בהווה ובעבר חברי רובל מעבדה.

1. הכנת שטח הביתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות נוזל השדרה בועה מלאכותית מוחין (ACSF) בתערובת של 95% O 2 / 5% CO 2 (pH שבין 7.2-7.4, osmolarity 295-310 mOsm / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ACSF מבעבעת, נקי עבודה עם שטח EtOH 70%. כמו כן לנקות את vibratome ואת להב חיתוך. יש לשטוף את הסכין עם מים מזוקקים (DH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום נקי כרית ספיגת נוזלים על ביתור שטח עם כלים לנתח המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק לחסום אגר (40 מ&quot;ג agarose / mL, 4%, כלומר ב DH 2 O) לשלב של החדר vibratome-חיתוך *. * טיפ: להכין אגר לפני לנתיחה. חנות מוכנות אגר בתוך צלחת פטרי מכוסה במקרר. Agarose שנרכשו EMD כימיקלים או Invitrogen. </li></ol> 2. הכנת 6-גם צלחות עם בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע סטרילית, למלא היטב 1 לכל חיה של צלחת 6-היטב עם 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות לדגור על 35 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כמה שיותר קרום מוסיף תרבות הצורך ולמקם אותם בשכונה לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 3. בידוד של גזע המוח שמיעתית עוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ביצה תחת מקור אור בהיר על מנת לקבוע את חלל מלא באוויר הריק של העובר (בדרך כלל הצד גדול של הביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפסקת פתוח בצד גדולות של ביצה חשיפת שק קרום. בצע פרוסה בקרום שק עם אזמל בעדינות להסיר את ראשו של העובר עוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף את הראש עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קצה סכין גילוח האחורי מעט אל בין העיניים. ביצוע חתך מקורי ל-הזנב קו האמצע דרך הגולגולת החלים רק לחץ קל *. * טיפ: הלחץ המופעל תלוי גיל העובר (כלומר, הצעיר = פחות, ישנים יותר =) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת לאמת חתך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק חלק מקורי של הגולגולת על ידי חיתוך בסכין גילוח. להב מיקום אחורי אל העיניים לחתוך במהירות דרך הגולגולת כולו ברקמת המוח *. * טיפ: לחץ חזק נדרשת להסיר לחלוטין קטע מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את קו האמצע אל לרוחב חתכים עם מספריים קטנים באזור הזנב של הגולגולת, קדמית מעט שרירי הצוואר לעין משני צדי הראש. משוך ממנו הגולגולת רקמת לחשוף את המוח הקטן והמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את המוח מבסיס הגולגולת על ידי חיתוך הרקמה מחוברת עם מספריים קטנים. לאחר כל רקמה נחתכת, המוח צריך לנוע בחופשיות מן הגולגולת *. * טיפ: ייתכן שיהיה עליך להפוך את הגולגולת (את המוח) לחתוך רקמות המצורפת. </li></ol> 4. הכנת המוח עבור בחותכו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר לאחר מהגולגולת, סיכת המוח למטה דרך tecta אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את המוח הקטן בעדינות על ידי חיתוך peduncles עם מספריים קטנים, לחשוף את רצפת החדר הרביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הרקמה הקרומית ואת כלי הדם מפני השטח של גזע המוח עם פינצטה ולבצע קיצוץ רוחבי דרך tecta אופטיים לבודד את גזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה של דבק סופר על הבמה vibratome מול לחסום את אגר (לכיוון הלהב vibratome). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, בעדינות ובמהירות להרים את המוח על חוט השדרה וברקמות מקום על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי כלפי ללהב vibratome *. * טיפ: דבק עודף צריכה להיספג עם קים, למחות או מסנן נייר לפני הצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות יוצקים ACSF מחומצן לשלב vibratome *. * הערה: זה יכול להיות ACSF מבעבע ברציפות עם O 2 / CO 2. עם זאת, מבעבע של ACSF בהיקף כה קטן של תוצאות הפתרון בתנועה בלתי רצויות (ונזק אפשרי) על פרוסות המוח. אם מבוצע במהירות, כבר מחומצן ACSF מ דיסקציה היא מספקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להב Vibratome צריכה להיות בזווית של 20-22 מעלות. התחל vibratome (תנודה צריך להיות מוגדר על אמפליטודה מקסימלית) ולעבור שלב לכיוון הלהב כך את החלק העליון של רקמת מקביל עם להב לפני חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור במהירות להב כלפי רקמת המוח. האט משמעותית לקראת פשוט ליצור קשר עם להב רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך הרקמה בתנועה קדימה האיטי ביותר האפשרי. לאחר קטע דרך העטרה כולה של רקמה, להזיז בעדינות פרוסה מן הלהב בעזרת מברשת או זכוכית שבורה, ירה פיפטה מלוטש, מתאים בקצה אחד עם נורת גומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב התחתון של 300-500 צעדים מיקרומטר ו פרוסה שוב. חזור על הפעולה עד חתימות אנטומיים ניכרים ברקמת המוח. בשלב זה, גזע המוח פרוסת רקמה המכילה מבנים שמיעתי ב 200-1000 מיקרומטר עובי, בהתאם לגילו של צרכים רקמות ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשמור על פרוסות שמיש הסדר של חיתוך, כלומר, פרוסה 1 st מייצג את אזור הזנב ביותר של המעגל (צליל בתדר נמוך עיבוד) וגם את הפרוסה האחרונה מייצגת את קטע מקורי ביותר (בתדירות גבוהה processing) *. * הערה: עבור מיקום של פרוסות לשימוש תרבות, עבור לפרק 6. עבור אחסון הפיזיולוגיה חוץ גופית, ראה בסעיף הבא. </li></ol> 5. פורסים אחסון עבור חוץ גופית פיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לגיל העובר עוף ואת עובי של הפרוסה, כל חיה צריך לספק 1-6 פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום פרוסות בודדים בתא באמצעות זכוכית מלוטשת אש פיפטה מצויד בקצה אחד עם נורת גומי. לשכת צריכים להיות ממוספרים. המקום רק פרוסה אחת לכל היטב, על מנת לשמור על כמה סגוליות tonotopic (למשל, פרוסת הזנב ביותר בתא 1 ואת פרוסת מקורי ביותר בתא האחרון). לשכת צריכים להיות מלאים ACSF ו מבעבע ברציפות בתערובת של 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7.4, osmolarity 295-310 mOsm / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פרוסות לאזן על ידי הצבת חדר לתוך אמבט חמים (36 מעלות צלזיוס) במשך שעה בערך 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קאמרית מן אמבטיה חמה ולאפשר לנוח בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי בערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה וחצי בטמפרטורת החדר, פרוסות ניתנת להעברה מחדר מחזיק תא ~ 0.5 מ&quot;ל הקלטה רכוב על מיקרוסקופ לניסויים אלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות יכול לשמש עד ~ 6 שעות לאחר הסרת מן האמבט החם. </li></ol> 6. הכנת תרבויות Slice Organotypic 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הליך חיתוך (ראה סעיף 6) פרוסות להעביר עם ACSF 500 ~ μL באמצעות זכוכית מלוטשת אש פיפטה מצויד בקצה אחד עם נורת גומי לצלחת 48 היטב על קרח. פרוסה אחת לכל טוב *. * טיפ: Slices צריך להיות לפחות 300 מיקרומטר עד 1000 מיקרומטר עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פרוסות נאספו, להעביר את צלחת 48-היטב למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 6-המכיל גם צלחת תרבות בינוני מתוך החממה ולהעביר אותו אל מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני הנחת פרוסות מהמוח יחיד על ממברנות, מקום אחד מוסיף קרום מוכן (ראה סעיף 2.2) לתוך באר עם המדיום לתרבות. ודא שאין בועות אוויר נמצאים תחת קרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה כוס, העברת פרוסה ירידה של ACSF על הממברנה תרבות להסיר ACSF עודף עם micropipette. חזור עבור שאר פרוסות (מקסימום 4 פרוסות לכל ממברנה) *. * טיפ: ודאו פרוסות לא נוגעים זה בזה ופרוסות מקום מרכזי על הממברנה, כך שהם לא נוגעים שפת הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוסות המוח כמו רבים לפי הצורך *. * טיפ: אם התרבויות הם מניפולציה בשלב מאוחר יותר, זה יכול להיות יתרון להגביל את כמות ממברנות עד 3 לכל צלחת 6 גם כדי להפחית את הזמן התרבויות יוסרו מן החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התרבות בינוני 3 פעמים בשבוע מתחת למכסה המנוע: הסר בינוני ישן עם צינורית ואקום עם קצה סטרילית תוך הוספת קרום הוא הרים את הבאר עם זוג מלקחיים. הוסף 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי גם בעוד להכניס קרום מורם מתוך הבאר. כאשר כל מדיום הוא שונה, לשים צלחת בחזרה לתוך החממה. </li></ol> 7. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. המעגלים binaural של גזע המוח השמיעתית עוף. (א) סכמטי של קטע העטרה ו (BF) חוץ גופית תמונות פרוסת גזע המוח השמיעתית עוף. מעגל ב (א) מראה תשומות הגירוי מביא מתוך עצב השמיעה () לגרעין magnocellularis (NM) ואת גרעין angularis (NA). NM פרויקטים תשומות הגירוי הבילטרלי לגרעין laminaris (NL) על שני הצדדים של גזע המוח. הקלט מעכבות מן מעולה (בנו) פרויקטים olivary גרעין כדי NA, NM ו NL. חוץ גופית פרוסות (BF) הם תמונות רציפים (200 מיקרומטר אחד) הולך מן הזנב (ב) על מקורי (F) של גזע המוח השמיעתית עוף, המייצג את נמוך לתדר גבוה אזורים, בהתאמה. המעגלים אחראי על קידוד נכסים זמני של קול בשימוש בעיקר עבור לוקליזציה קול. בר סולם ב (B) = 500 מיקרומטר ו חל על תמונות (CF). חצים בנקודה (ד &#39;) את שכבת התאים בגוף יחיד של NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. נוירונים בתרבית לפתח נורמלי מאפייני התגובה פיזיולוגי. מעל כל השינויים מתח הממברנה בתגובה hyperpolarizing ו depolarizing השלבים הנוכחיים של חריפה (A &amp; C) בתרבית רקמה על 4 (ב) ו -7 (ד) ימים בתרבות (DIC). הערה שינויים hyperpolarizing &quot;לשקוע&quot; מתח, ירידה חזקה הנוכחית כלפי חוץ, ועל אחת ירי AP כי לפתח דומה בגישה תרבות פרוסה לעומת רקמת הגיל המקבילה חריפה. זריקות נוכחי היו 200 ms, צעדים של הרשות 50-100. RMPs היו בין -55 ו -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. המבנה האנטומי של SLI תרבותCES. המחצית השמאלית של המוח השמיעתית של עוף E11 לאחר 7 ימים בתרבות (DIC). נוגדנים כנגד חלבון microtubule הקשורים 2 (MAP2), אשר מתרחשת סומה ו דנדריטים, מסומן בירוק. מקבץ של גרעין magnocellularis (NM) נוירונים האקסונים שלה מסומנים באדום דרך electroporation של dextran אלקסה לצבוע. שני NM וקו תא NL גלויים. Ipsilateral מסופי האקסון NM ניתן לראות מקרין על דנדריטים הגב NL (ראשי חץ לבן).

<ol>
	<li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K++currents.">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li><li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken.">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li><li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons.">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li><li>Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+glutamatergic+synaptic+transmission+in+binaural+auditory+neurons.">Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).</li><li>Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+in+the+chick:+ontogeny+of+postsynaptic+responses.">Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses.</a> J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+underlying+the+firing+of+neurons+in+the+avian+cochlear+nucleus.">Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).</li><li>Monsivais, P., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accommodation+enhances+depolarizing+inhibition+in+central+neurons.">Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons.</a> J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).</li><li>Lu, T., Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus.">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways.">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons.">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li><li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure.">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במשך כמה עשורים, להכנת פרוסה חריפה של גזע המוח עוף שימש ללמוד עיבוד שמיעתי 9, 10. גישה זו סיפקה כמות עצומה של חוץ גופית נתונים פיזיולוגיים על עיבוד binaural משני מצבים התפתחותיים בוגרת 4, 11, 12. הרבה ידוע על המעגל הזה מאוד מיוחדים ואת תפקיד גרעין כל משחק בעיבוד...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken ACSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-11624</td>
<td>130 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-10576</td>
<td>26 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9333</td>
<td>3 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8282</td>
<td>1.25 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M33-500</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>423525000</td>
<td>2 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken culture medium (store at 4&deg;C)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen</td>
<td>12492-013</td>
<td>48.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Earl's balanced salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E-2888</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7513</td>
<td>1.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>2.75%</td>
</tr>
<tr>
<td>horse serum (heat inactivated, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1138</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-0781</td>
<td>1.00 ml 
* = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Specific equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millicell-CM cell culture inserts</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plate</td>
<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator</td>
<td>Forma Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and culture of chicken auditory brainstem slices

גזע המוח השמיעתית עוף היא מערכת מבוססת מודל, שבו נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את האנטומיה והפיזיולוגיה של עיבוד שמיעתי בתקופות דיסקרטי הפיתוח 1-4, כמו גם מנגנוני קידוד הזמני במערכת העצבים המרכזית 5-7. כאן אנו מציגים שיטה להכין עוף גזע המוח השמיעתית פרוסות כי ניתן להשתמש הפרוצדורות חריפה או פרוסות תרבות organotypic לטווח ארוך מניפולציות ניסיוני. גזע המוח השמיעתית עוף מורכב angularis גרעין, זית magnocellularis, laminaris מעולה. גרעינים אלה אחראי לעיבוד צליל binaural חד ההכנות פרוסה העטרה לשמר את המעגלים כולו. בסופו של דבר, תרבויות פרוסה organotypic יכול לספק את ההזדמנות כדי לתפעל מספר פרמטרים התפתחותיים כגון הפעילות הסינפטית, ביטוי של מרכיבים טרום postsynaptic, ביטוי של רגישות להיבטים השליטה גן ביטוי ההפרש גישה זו יכולה לשמש כדי להרחיב את הידע הכללי על התפתחות המעגל העצבי עידון, והתבגרות.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices at JoVE.com

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

גזע המוח השמיעתית עוף מורכבת גרעינים אחראי לעיבוד צליל binaural. הכנה אחד פרוסה העטרה שומרת את כל המעגלים, בעוד גישה תרבותית מספק הכנה מיוחדת כדי לחקור את התפתחות מבנה ותפקוד עצבי השמיעה ברמה המולקולרית, התאית הרשת.

הכנה והתרבות של שמיעתית פרוסות עוף גזע המוח

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  University of Washington. גזע המוח השמיעתית עוף מורכבת גרעינים אחראי לעיבוד צליל binaural. הכנה אחד פרוסה העטרה שומרת את כל המעגלים, בעוד גישה תרבותית מספק הכנה מיוחדת כדי לחקור את התפתחות מבנה ותפקוד עצבי השמיעה ברמה המולקולרית, התאית הרשת.

Video: Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

הכנה משופרת ושימור פרוסות עכבר היפוקמפוס להקלטה יציבה מאוד ושחזור של הגברה לטווח ארוך

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...