Aktuelle und ehemalige Rubel lab Mitglieder.

1. Vorbereitung der Dissecting Bereich <ol><li> Kontinuierlich Blase künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 (pH-Wert zwischen 7,2 bis 7,4, Osmolarität 295-310 mOsm / l). </li><li> Während ACSF brodelt, saubere Arbeitsfläche mit 70% EtOH. Reinigen Sie auch die Vibratom und Schneidscheibe. Spülen Klinge mit destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Legen Sie saubere Flüssigkeitsaufnahme Pad auf Sezieren mit geeigneten Werkzeugen sezieren. </li><li> Kleber Agarblock (40 mg Agarose / mL, dh 4%, in dH 2 O) auf die Bühne eines Vibratom-Slicing Kammer *. * Tipp: Bereiten Agar vor Dissektion. Shop vorgefertigte Agar in einer Petrischale abgedeckt in den Kühlschrank. Agarose gekauft EMD Chemicals oder Invitrogen. </li></ol> 2. Herstellung von 6-well Platten mit Kulturmedium <ol><li> Unter einer sterilen Haube, füllen 1 gut pro Tier einer 6-well-Platte mit 1 ml Kulturmedium und Inkubation bei 35 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bereiten Sie so viele Kultur-Membran-Einsätze nach Bedarf und legen Sie sie in der Kapuze für die spätere Verwendung. </li></ol> 3. Isolation von Chicken auditorischen Hirnstamm <ol><li> Legen Ei unter eine helle Lichtquelle, um die Luft gefüllten Raum void des Embryos (in der Regel der großen Seite des Eies) zu bestimmen. </li><li> Aufbrechen, große Seite Ei auszusetzen Membran sac. Machen Sie schneiden in der Membran sac mit Skalpell und entfernen Sie vorsichtig den Kopf des Hühnerembryo. </li><li> Schnell enthaupten Kopf mit einer Schere. </li><li> Platzieren Sie die Spitze der Rasierklinge leicht hinter und zwischen den Augen. Machen Sie eine rostral-to-caudal Mittellinienschnitt durch den Schädel Anwendung nur mit leichtem Druck *. * Tipp: Druck ist abhängig von dem Alter des Embryos (dh jünger = weniger, älter = mehr) </li><li> Vorsichtig beiseite schieben Haut und Federn, um Schädel zu entlarven und zu überprüfen Mittellinie geschnitten. </li><li> Block rostralen Teil des Schädels durch Schneiden mit einer Rasierklinge. Position Klinge hinter Augen und schnell durch das ganze Schädel-Hirn-Gewebe geschnitten *. * Tipp: starker Druck erforderlich ist, um vollständig zu entfernen rostralen Abschnitt. </li><li> Machen Mittellinie zu seitliche Einschnitte mit einer kleinen Schere im kaudalen Bereich des Schädels, leicht anterior sichtbar Nackenmuskulatur auf beiden Seiten des Kopfes. Ziehen Sie sich Schädel und Gewebe des Kleinhirns und des Gehirns aufzudecken. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Hirnstamm von Schädelbasis durch Schneiden angebracht Gewebe mit einer kleinen Schere. Sobald alle Gewebe geschnitten wird, sollte Hirnstamm frei weg von den Schädel *. * Tipp: Sie müssen möglicherweise den Schädel (Gehirn nach unten) blättern, um befestigt Gewebe zu schneiden. </li></ol> 4. Vorbereitung der Hirnstamm für Slicing <ol><li> Einmal aus dem Schädel entfernt, pin Hirnstamm nach unten durch die Optik tecta. </li><li> Vollständig zu entfernen das Kleinhirn durch vorsichtiges Schneiden der Stiele mit einer kleinen Schere, Freilegung der Boden des vierten Ventrikels. </li><li> Entfernen Sie alle häutigen Gewebe und Blutgefäße von der Oberfläche des Hirnstamms mit einer Pinzette und machen seitliche Schnitte durch die Optik tecta zum Hirnstamm zu isolieren. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber auf der Vibratom Bühne vor dem Agar-Block (gegen Vibratom Klinge). </li><li> Mit Pinzette, sanft und schnell heben Sie den Hirnstamm in das Rückenmark und Ort Gewebe auf den Superkleber mit der rostralen Seite nach unten und dorsal in Richtung auf Vibratom Klinge *. * Tipp: überschüssigen Kleber sollte mit aufgenommen werden einen Kim-Wisch-oder Filterpapier vor dem nächsten Schritt. </li><li> Vorsichtig gießen Sauerstoff ACSF in die Vibratom Bühne *. * Hinweis: dieser ACSF kann kontinuierlich mit O 2 / CO 2 perlen. Allerdings Sprudeln ACSF in einem so kleinen Volumen der Lösung ergibt sich unerwünschte Bewegungen (und mögliche Schäden) an Hirnstamm Scheiben schneiden. Wenn erfolgen schnell, bereits mit Sauerstoff ACSF aus der Zerlegung ist ausreichend. </li><li> Vibratom Klinge sollte bei 20-22 ° Winkel sein. Starten Vibratom (Schwingung bei maximaler Amplitude eingestellt werden) und bewegen Bühne bis zur Klinge, so dass die Spitze des Gewebes parallel mit der Klinge vor dem Schneiden. </li><li> Schnell bewegen Klinge in Richtung Hirnstamm Gewebe. Slow down erheblich kurz vor Klinge Kontakt mit dem Gewebe. </li><li> Begin Slicing Gewebe mit langsamsten Vorwärtsbewegung. Einmal durch die gesamte Frontalschnitt des Gewebes, sanft bewegen Stück weg von der Klinge mit einer Bürste oder ein zerbrochenes Glas, feuerte polierten Pipette, fit an einem Ende mit einem Gummiball. </li><li> Untere Bühne in 300-500 um Schritte und in Scheiben schneiden erneut. Wiederholen, bis anatomischen Unterschriften sichtbar in Hirnstamm Gewebe. Zu diesem Zeitpunkt Dicken Scheibe Hirnstamm Gewebe mit auditiven Strukturen auf 200-1000 um, je nach Alter des Gewebes und experimentellen Anforderungen. </li><li> Sorgfältig pflegen nutzbare Scheiben in der Reihenfolge des Schneidens, dh, stellt der 1. Scheibe den kaudalen Bereich der Schaltung (low-frequency-Sound Processing) und die letzte Scheibe repräsentiert die rostralen Abschnitt (Hochfrequenz-Processing) *. * Hinweis: für die Platzierung von Scheiben für Kultur zu verwenden, mit Abschnitt 6 fort. Für in-vitro Physiologie Lagerung, siehe nächster Abschnitt. </li></ol> 5. Slice-Speicher für in-vitro Physiology <ol><li> Je nach Alter des Hühnerembryo und die Dicke der Scheibe, sollte jedes Tier bieten 1 bis 6 Scheiben schneiden. </li><li> Sanft statt einzelne Segmente in der Kammer mit feuerpolierte Glaspipette an einem Ende mit einem Gummi-Glühlampe. Kammer sollten nummeriert werden. Legen Sie nur eine Scheibe pro Vertiefung, um einige tonotopen Spezifität (z. B. die meisten caudal Scheibe in der Kammer 1 und die meisten rostral Scheibe in die letzte Kammer) zu halten. Kammer sollte mit ACSF gefüllt werden und kontinuierlich mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7,4, Osmolarität 295-310 mOsm / l) geleitet. </li><li> Lassen Sie Slices, indem die Kammer in ein warmes Bad (36 ° C) für ca. 1 Stunde ausgleichen. </li><li> Entfernen Kammer vom warmen Bad und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für ca. ½ Stunde ruhen lassen. </li><li> Nach ½ Stunden bei Raumtemperatur, können Scheiben von der Aufnahmekammer eine ~ 0,5 mL Aufnahme Kammer an einem Mikroskop für elektrophysiologische Experimente montiert übertragen werden. </li><li> Scheiben kann verwendet werden für bis zu ca. 6 Stunden nach der Entnahme aus der warmen Badewanne. </li></ol> 6. Vorbereitung der organotypischen Kulturen 8 <ol><li> Unmittelbar nach dem Aufschneiden Verfahren (siehe Abschnitt 6) übertragen Scheiben mit ~ 500 ul ACSF mit einem feuerpolierte Glaspipette an einem Ende mit einem Gummiball auf eine 48-Well-Platte auf Eis ausgerüstet. Eine Scheibe pro Well *. * Tipp: Scheiben müssen mindestens 300 um und bis 1000 um dick sein. </li><li> Nach Scheiben gesammelt worden sind, übertragen Sie die 48-Well-Platte an der Kapuze. </li><li> Entfernen einer 6-well-Platte mit Kulturmedium aus dem Inkubator und überträgt es auf die Motorhaube. </li><li> Kurz vor der Platzierung Scheiben aus einem einzigen Gehirn auf Membranen, eine der vorbereiteten Membran-Einsätze statt (siehe Abschnitt 2.2) in eine gut mit Kulturmedium. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter der Membran zu präsentieren. </li><li> Mit einer Glaspipette, Übertragung einer Scheibe in einem Tropfen ACSF auf die Kultur-Membran und entfernen überschüssige ACSF mit der Pipette. Wiederholen Sie für die restlichen Scheiben (max 4 Scheiben pro Membran) *. * Tipp: Achten Sie darauf, Scheiben nicht berühren einander und legen Scheiben zentral auf der Membran, so dass sie sich nicht berühren der Membran Felge. </li><li> Wiederholen Sie dies für so viele Hirnschnitten nach Bedarf *. * Tipp: Wenn Kulturen zu einem späteren Zeitpunkt manipuliert werden, könnte es vorteilhaft sein, den Betrag von Membranen bis 3 Limit pro 6-Well-Platte als die Zeit, die Kulturen aus dem Brutschrank entnommen sind zu reduzieren. </li><li> Ändern Kulturmedium 3 mal pro Woche unter einer Haube: Entfernen Sie alte Medium mit einer Vakuum-Röhre mit einer sterilen Spitze, während Membran eingefügt wird aus dem Brunnen mit einer Pinzette angehoben. 1 ml frisches Kulturmedium in gut während die Membran eingefügt wird aus dem Brunnen gehoben. Wenn alle Medium gewechselt wird, setzen Platte zurück in den Inkubator. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Binaural Schaltung des Huhns auditorischen Hirnstamm. (A) Schematische Darstellung eines koronalen Abschnitt und (BF) in-vitro Schnittbilder des Huhns auditorischen Hirnstamm. Die Schaltung in (A) zeigt afferenten erregenden Eingänge aus den Hörnerv (AN) zu Kern magnocellularis (NM) und Nucleus angularis (NA). NM Projekte bilateralen exzitatorischen Eingänge Kern Laminaris (NL) auf beiden Seiten des Hirnstamms. Eine inhibitorische Eingang von der oberen Olive Kern (SON) Projekte zur NA, NM und NL. Die in-vitro Scheiben in (BF) sind aufeinander folgenden Bildern (200 um jeweils) geht von kaudal (B) zu rostral (F) des Huhns auditorischen Hirnstamm, die die niedrig-bis hochfrequente Regionen bzw.. Circuitry ist verantwortlich für die Codierung von zeitlichen Eigenschaften von Ton in erster Linie für Sound-Lokalisierung verwendet. Balken in (B) = 500 um und gilt für Bilder in (CF). Arrows in (D) weisen auf die einzelne Zelle Körper Schicht aus NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Kultivierten Neuronen entwickeln normale physiologische Reaktion Eigenschaften. Überlagert Membran Spannungsänderungen in Reaktion auf Hyperpolarisation und depolarisierende aktuellen Schritte von akuten (A &amp; C) und gezüchtetes Gewebe in 4 (B) und 7 (D) Tagen in Kultur (DIC). Hinweis Änderungen in hyperpolarisierenden Spannung &quot;sag&quot;, starke Reduktion der nach außen gerichteten Strom, und einzelne AP Feuern, die sich ähnlich entwickeln, die Scheibe Kultur-Ansatz im Vergleich zum Alter entspricht akuten Gewebe. Aktuelle Injektionen wurden 200 ms, nur wenige Schritte von 50-100 pA. RMP wurden zwischen -55 und -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Anatomische Strukturen in Kultur slices. linken Hälfte des auditorischen Hirnstamm eines E11 Huhn nach 7 Tagen in Kultur (DIC). Ein Antikörper gegen das Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), die im Soma und Dendriten auftritt, ist in grün gekennzeichnet. Eine Gruppe von Kern magnocellularis (NM) Neuronen und ihre Axone sind in rot über Elektroporation eines Alexa Dextran Farbstoff markiert. Beide NM und NL-Zelllinie sichtbar sind. Ipsilateral NM Axonterminalen sehen projizieren zum dorsalen NL Dendriten (weiße Pfeilspitzen) werden.

<ol>
	<li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K++currents.">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li><li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken.">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li><li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons.">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li><li>Sanchez, J. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus.">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Trussell, L. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure.">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li></ol>

Seit mehreren Jahrzehnten hat sich die akuten Scheibe Vorbereitung des Huhns Hirnstamm verwendet worden, um Studie auditiven Verarbeitungs-9, 10. Dieser Ansatz hat eine enorme Menge von in-vitro physiologischen Daten auf binauralen Verarbeitung sowohl von Entwicklungs-und reifen Staaten 4, 11, 12 vorgesehen. Viel ist über diese hoch spezialisierten Schaltung und die Rolle jeder Kern spielt in der zeitlichen Verarbeitung von Ton 13, 14 bekannt. In der Tat haben kurzfristige expe...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken ACSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-11624</td>
<td>130 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-10576</td>
<td>26 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9333</td>
<td>3 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8282</td>
<td>1.25 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M33-500</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>423525000</td>
<td>2 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken culture medium (store at 4&deg;C)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen</td>
<td>12492-013</td>
<td>48.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Earl's balanced salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E-2888</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7513</td>
<td>1.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>2.75%</td>
</tr>
<tr>
<td>horse serum (heat inactivated, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1138</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-0781</td>
<td>1.00 ml 
* = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Specific equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millicell-CM cell culture inserts</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plate</td>
<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator</td>
<td>Forma Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and culture of chicken auditory brainstem slices

Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist ein gut etabliertes Modell, das in großem Umfang verwendet wurde, um die Anatomie und Physiologie der auditiven Verarbeitung bei diskreten Perioden der Entwicklung 1-4 sowie Mechanismen für die zeitliche Kodierung in das zentrale Nervensystem 5-7 studieren. Hier präsentieren wir eine Methode, um Hühner auditorischen Hirnstamm Scheiben, die für die akute experimentelle Verfahren oder zur Kultur organotypischen Schnitten für die langfristige experimentelle Manipulationen genutzt werden kann vorzubereiten. Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist der Kern angularis, magnocellularis, Laminaris und oberen Olive zusammen. Diese Kerne sind verantwortlich für die binaurale Signalverarbeitung und Single koronare Schicht Präparate erhalten die gesamte Schaltung. Letztlich kann organotypischen Kulturen die Möglichkeit bieten, mehrere Entwicklungs-Parameter wie synaptische Aktivität, Expression von Pre-und postsynaptischen Komponenten, Ausdruck von Aspekten Controlling Erregbarkeit und differenziellen Genexpression zu manipulieren Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die allgemeinen Kenntnisse über neuronale Schaltkreis Entwicklung, Verfeinerung und Reifung zu erweitern.

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist der Kerne verantwortlich für die binaurale Signalverarbeitung zusammen. Ein einziger koronare Schicht Vorbereitung unterhält die gesamte Schaltung, während die kultivierten Ansatz bietet eine einzigartige Vorbereitung auf die Entwicklung der neuronalen Struktur und auditiven Funktion auf molekularer, zellulärer und Netzebenen zu studieren.

Vorbereitung und Kultur von Chicken auditorischen Hirnstamm Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Aufrufe.  University of Washington. Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist der Kerne verantwortlich für die binaurale Signalverarbeitung zusammen. Ein einziger koronare Schicht Vorbereitung unterhält die gesamte Schaltung, während die kultivierten Ansatz bietet eine einzigartige Vorbereitung auf die Entwicklung der neuronalen Struktur und auditiven Funktion auf molekularer, zellulärer und Netzebenen zu studieren.

Serie: Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...