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1. 지역 분석 해 봅시다의 준비 <ol><li> 95% O 2 / 5% CO 2의 혼합물 (7.2-7.4 사이의 산도, osmolarity 295-310 mOsm / L)와 함께 지속적으로 거품 인공 대뇌 척수 (ACSF). </li><li> ACSF가 버블링이지만, 70 % EtOH로 작업 영역을 청소하십시오. vibratome과 깔끔히 칼날에도 청소. 증류수 (DH 2 O)의 칼날을 씻어. </li><li> 적절한 해부 도구로 영역을 해부 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> vibratome - 깔끔히 챔버의 무대에 글루 한천 블록 (DH 2 O 40 MG 아가로 오스 / ML, 즉 4%) *. * 도움말 : 해부하기 전에 한천을 준비합니다. 냉장고에 덮여 페트리 접시 안에 스토어 미리 만든 한천. 아가로 오스는 EMD 화학 물질이나 Invitrogen에서 구입했습니다. </li></ol> 2. 문화 매체와 6 - 잘 플레이트의 준비 <ol><li> 멸균 후드 아래, 35 문화 매체와 부화 1 ML과 6 자 접시의 동물마다 잘 작성 1 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 많은 문화 막 삽입 등 필요한 준비하고 나중에 사용하기 위해 모자를 놓으십시오. </li></ol> 3. 치킨 청각 Brainstem의 분리 <ol><li> 배아 (일반적으로 계란의 큰 쪽)의 공기 가득한 공간 무효를 결정하는 밝은 광원에 따라 플레이스 달걀. </li><li> 멤브레인 색을 노출 계란의 대형 측면을 열고 브레이크. 때론 막 색으로 슬라이스를 만들어 부드럽게 닭 배아의 머리를 제거합니다. </li><li> 신속하게 가위로 머리가 목을 베다. </li><li> 와 눈 사이 약간 후부 면도날의 장소 끝. 단 약간의 압력을 적용하는 두개골을 통해 주동이의 - 투 - 꼬리 정중선 절개를합니다 *. * 팁 : 적용 압력이 배아의 나이에 따라 달라집니다 (즉, 젊은 = 적은, 나이 = 이상) </li><li> 부드럽게 피부와 두개골을 노출하고 정중선 절개를 확인하기 위해 깃털을 잊어버리게. </li><li> 면도날로 깔끔히에 의해 두개골의 주동이의 부분을 차단합니다. 눈 뒷부분 빠르게 전체 두개골과 뇌 조직을 통해 절단 위치 블레이드 *. * 도움말 : 강한 압력이 완전히 주동이의 섹션을 제거하기 위해 필요합니다. </li><li> 머리 양쪽에 볼 수 목 근육에 약간 앞쪽에 두개골의 꼬리 지역에 작은 가위와 정중선 - 투 - 측면 incisions하십시오. 두개골과 소뇌 및 뇌 노출 조직을 멀리 당기세요. </li><li> 부드럽게 작은 가위로 연결된 조직을 절단하여 두개골 바닥에서 brainstem를 제거합니다. 모든 조직이 절단되면, brainstem가 두개골에서 떨어져 자유롭게 이동한다 *. * 팁 : 연결된 조직을 잘라 두개골 (뇌 아래)를 플립해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 4. 부러 뜨리 Brainstem의 준비 <ol><li> 일단 두개골에서 제거, 광학 tecta 통해 brainstem을 핀. </li><li> 완전히 부드럽게, 작은 가위로 peduncles 절삭 번째 뇌실의 바닥을 노출하여 소뇌를 제거합니다. </li><li> 핀셋으로 brainstem의 표면으로부터 막의 조직과 혈관을 제거하고 brainstem을 분리하기 위해 광학 tecta을 통해 측면 인하합니다. </li><li> 한천 블록의 앞에 vibratome 단계 (vibratome 블레이드 향해)에 슈퍼​​ 접착제의 작은 금액을 넣으십시오. </li><li> 족집게를 사용하면, 부드럽게 그리고 신속하게 vibratome 블레이드에 대한 주동이의 측면 아래로 등의 측면과 슈퍼 접착제로 척수와 장소 조직에서 brainstem 리프트 *. * 도움말 : 초과하는 접착제가로 흡수해야 킴 - 닦아 또는 다음 단계 전에 종이를 필터링합니다. </li><li> 부드럽게 vibratome 단계로 산소 ACSF를 따르다 *. * 참고 :이 ACSF 연속 O 2 / CO 2와 함께 부풀어 오른 수 있습니다. 그러나, brainstem의 조각을 원하지 않는 운동의 솔루션 결과 같은 작은 볼륨 (및 손상)에 ACSF들이 꿈틀. 빠르게 수행할 경우, 이미 해부에서 ACSF 충분 산소. </li><li> Vibratome 블레이드는 20-22 °의 각도로해야합니다. 시작 vibratome (진동이 최대 진폭에서 설정해야합니다)과이 조직의 최고가 깔끔히 전에 블레이드와 평행이되도​​록 블레이드 향해 무대를 이동합니다. </li><li> 신속 brainstem 조직으로 블레이드를 이동합니다. 조직과 블레이드 연락 상당히 직전 천천히. </li><li> 느린 가능 전진 운동과 조직을 깔끔히 시작합니다. 일단 조직의 전체 코로나 섹션을 통해, 부드럽게 브러쉬 또는 깨진 유리와 블레이드에서 슬라이스를 멀리 이동 광택 피펫은 고무 전구 한 끝에 맞게, 발사. </li><li> 로우어 300-500 μm의 단계로 무대와 다시 조각. 해부 학적 서명 brainstem 조직에서 볼 때까지 반복합니다. 이때, 200-1000 μm의의 청각 구조를 포함하는 슬라이스 brainstem 조직 조직과 실험 요구 나이에 따라 두께. </li><li> 조심스럽게, IE를 깔끔히의 순서로 사용할 슬라이스를 유지, 1 일 슬라이스는 회로의 가장 꼬리 영역 (저주파 사운드 처리)을 나타내고 마지막 슬라이스가 가장 주동이의 섹션 (고주파 processi을 나타냅니다NG) *. * 참고 : 문화 사용을 위해 조각의 배치에 대해, 제 6으로 이동하십시오. 체외 수정 생리학 스토리지, 다음 섹션을 참조하십시오. </li></ol> 5. 체외 수정 생리학에 대한 슬라이스 스토리지 <ol><li> 치킨 배아 및 슬라이스의 두께의 연령에 따라 각 동물 1-6 조각을 제공한다. </li><li> 부드럽게 고무 벌브 한 끝에 장착되어 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 챔버에서 개별 조각 장소. 상공 회의소 번호가 있어야합니다. 일부 tonotopic 특이성 (예, 챔버 한 대부분의 꼬리 조각과 마지막 챔버에서 가장 주동이의 슬라이스) 유지하기 위해 잘마다 하나의 슬라이스를 놓습니다. 상공 회의소는 ACSF 가득 지속 95% O 2 / 5% CO 2 (산도 7.4, osmolarity 295-310 mOsm / L)의 혼합과 함께 부풀어 오른해야합니다. </li><li> 조각은 약 1 시간 동안 따뜻한 목욕 (36 ° C)에 챔버를 삽입하여 평형 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 목욕에서 챔버를 제거하고 약 ½의 시간 실온에서 휴식을 허용합니다. </li><li> 상온에서 ½ 시간 후, 조각은 electrophysiological 실험 현미경에 장착된 ~ 0.5 ML 기록 챔버에 보관 챔버에서 전송할 수 있습니다. </li><li> 조각은 따뜻한 목욕에서 제거 후 ~ 6 시​​간에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. Organotypic 슬라이스 문화 8 준비 <ol><li> 즉시 전송 조각 얼음이 48 잘 접시에 고무 전구 한 끝에 장착되어 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 ~ 500 μL ACSF와 (제 6 항 참조) 깔끔히 절차에 따라. 하나는 잘마다 조각 *. * 팁 : 조각이 적어도 300 μm의 두께 및 최대 1000 μm의해야합니다. </li><li> 조각이 수집되고 나면, 후드에 48 잘 접시를 전송합니다. </li><li> 보육의 6 자 플레이트가 포함된 배지 출력을 제거하고 후드에 전송할 수 있습니다. </li><li> 직전 장소는 문화 매체로 우물에 (섹션 2.2 참조), 세포막에 하나의 머리에서 조각을 준비 막 삽입 중 하나를 배치하는. 더 공기 거품이 막 아래에 존재하지 있는지 확인합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 문화 막에 ACSF의 드롭에 슬라이스를 전송하고 micropipette로 초과 ACSF를 제거합니다. 남은 조각을 반복 (막 당 최대 4 조각) * * 도움말 : 그들이 막 림을 만지지 않도록 조각이 막에서 중앙 서로 접촉과 장소의 조각하지 않도록합니다. </li><li> 필요에 따라 많은 뇌 조각을 반복 * * 도움말 : 문화가 나중 지점에서 조작하는 경우에는 문화가 인큐베이터에서 제거하는 시간을 줄일 수로가 6 자 판 당 3 세포막의 양을 제한하는 유리 수도 있습니다. </li><li> 문화 매체에게 후드 아래에 3 회 일주일 변경 : 막 삽입이 포셉 한 쌍의으로 잘 밖으로 해제하는 동안 진공 튜브 살균 팁과 함께 오래된 매체를 제거합니다. 멤브레인 삽입이 잘 밖으로 해제되는 동안에 잘 신선한 문화 매체 1 ML을 추가합니다. 모든 매체가 변경되면, 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. </li></ol> 7. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 치킨 청각 brainstem의 Binaural 회로. 코로나 섹션 (A) 도식과 치킨 청각 brainstem의 (BF)에 - 체외의 슬라이스 이미지. (A)의 회로는 핵 magnocellularis (NM)와 핵 angularis (NA)로 청각 신경 ()에서 수입 성의 흥분성의 입력을 보여줍니다. NM은 brainstem 양쪽에 핵 laminaris (NL)에 양자 흥분성의 입력을 프로젝트. NA, NM 및 NL에 뛰어난 olivary 핵 (아들) 프로젝트에서 억제 입력. 의 체외 수정의 조각 (BF)는 순차 이미지 고주파 영역 낮은로 대표 꼬리에서 (B) 치킨 청각 brainstem의 주동이의 (F) 갈 (각 200 μm의)는, 각각 있습니다. 회로 소리 로컬 라이제이션을 위해 주로 사용 소리의 시간적 특성을 코딩에 대한 책임이 있습니다. 규모 바 (B) = 500 μm의 및 이미지 (CF) 적용됩니다. NL의 단세포 몸 레이어 (D) 지점에서 화살표. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 교양 뉴런 정상 physiologic 응답 특성을 개발할 수 있습니다. 급성 (A &amp; C) 4 (B) 7 (D) 문화 일 (DIC)에서 교양 조직에서 현재 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 막 전압 변화를 겹쳐. 연령 상응하는 급성 조직에 비해 슬라이스 문화 접근에 유사하게 개발 전압 &quot;세그&quot;외부 전류에 강한 감소하고, 하나의 AP 시행을 hyperpolarizing에 참고 변경됩니다. 현재 주사가 50-100 PA 200 MS, 단계되었습니다. RMPs은 -55과 -60 MV 사이에 있었다. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 문화 SLI의 해부 구조CES. 문화 7 일 후 E11 치킨 (DIC)의 청각 brainstem의 왼쪽 반동안. 소마와 dendrites에서 발생하는 미세 소관 결합 단백질 2 (MAP2)에 대한 항체는 녹색으로 표시됩니다. 핵 magnocellularis (NM) 뉴런과 axons의 클러스터는 알렉사 dextran 염료의 electroporation을 통해 빨간색으로 표시됩니다. NM와 NL 세포 라인 모두 볼 수 있습니다. Ipsilateral NM의 축삭 터미널은 지느러미 NL의 dendrites (흰색 화살촉)에 돌출 볼 수 있습니다.

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K++currents.">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li><li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken.">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li><li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons.">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li><li>Sanchez, J. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus.">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways.">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons.">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li><li>Sorensen, S. A., Rubel, E. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

몇 수십년 동안 치킨 brainstem의 급성 슬라이스 준비는 청각에게 처리 9, 10을 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 접근 방식은 모두 발달 및 성숙 상태 4, 11, 12 binaural 처리에에 - 체외 생리 어마어마한 양의 데이터를 제공하고 있습니다. 대부분이 고도로 전문화된 회로와 각 핵 소리 13, 14의 시간적 처리하는 역할에 대한 알려져있다. 사실,이 잘 특징 회로의 구조와 기...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken ACSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-11624</td>
<td>130 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-10576</td>
<td>26 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9333</td>
<td>3 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8282</td>
<td>1.25 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M33-500</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>423525000</td>
<td>2 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken culture medium (store at 4&deg;C)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen</td>
<td>12492-013</td>
<td>48.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Earl's balanced salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E-2888</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7513</td>
<td>1.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>2.75%</td>
</tr>
<tr>
<td>horse serum (heat inactivated, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1138</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-0781</td>
<td>1.00 ml 
* = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Specific equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millicell-CM cell culture inserts</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plate</td>
<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator</td>
<td>Forma Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and culture of chicken auditory brainstem slices

닭고기 청각 brainstem 널리 개발 1-4 신중 기간에서뿐만 5-7 중추 신경 시스템에서 시간적 코딩을위한 메커니즘으로 청각 처리의 해부학과 생리학을 연구하는 데 사용되었습니다 잘 구축 모델 시스템입니다. 여기 급성 실험 절차 또는 장기 실험 조작에 대한 문화 organotypic 조각하는 데 사용할 수있는 닭고기 청각 brainstem의 조각을 준비하는 방법을 제시한다. 닭고기 청각 brainstem는 핵의 angularis, magnocellularis, laminaris 및 뛰어난 올리브로 구성되어 있습니다. 이 핵은 binaural 사운드 처리 및 단일 코로나 슬라이스 준비 전체 회로를 보존 책임이 있습니다. 궁극적으로, organotypic 슬라이스 문화는 시냅스 활동, 사전 및 postsynaptic 구성 요소의 표현, 부분 통제 흥분과 차별 유전자 발현의 표현과 같은 몇 가지 발달 매개 변수를 조작할 수있는 기회를 제공할 수 있습니다 이 접근법은 신경 회로 개발, 교양과 성숙에 대한 일반 지식을 확대하는 데 사용할 수 있습니다.

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

닭고기 청각 brainstem는 binaural 사운드 처리에 대한 책임 핵으로 구성되어 있습니다. 교양 접근, 분자 세포 및 네트워크 수준에서의 연결 구조와 청각 기능의 발달을 연구하기 위해 특별한 준비를 제공하는 동안 하나의 코로나 슬라이스 준비는 전체 회로를 유지합니다.

치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K 조회수.  University of Washington. 닭고기 청각 brainstem는 binaural 사운드 처리에 대한 책임 핵으로 구성되어 있습니다. 교양 접근, 분자 세포 및 네트워크 수준에서의 연결 구조와 청각 기능의 발달을 연구하기 위해 특별한 준비를 제공하는 동안 하나의 코로나 슬라이스 준비는 전체 회로를 유지합니다.

비디오: Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

인공 와우 수술 및 C57BL/6 마우스에 전기 evoked 청각 Brainstem 응답 기록

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...