Attuali ed ex membri del laboratorio Rubel.

1. Preparazione di dissezione Area <ol><li> Continuamente bolla artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) con una miscela di 95% O 2 / 5% di CO 2 (pH compreso tra 7,2-7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l). </li><li> Mentre ACSF è spumeggiante, pulire l&#39;area di lavoro con il 70% EtOH. Pulire anche il vibratome e lama di taglio. Risciacquare con acqua distillata lama (dH 2 O). </li><li> Luogo pulito pad assorbimento di liquidi sulla dissezione area con adeguati strumenti di dissezione. </li><li> Colla blocco agar (40 mg agarosio / ml, cioè 4%, in dH 2 O) alla fase di un vibratome-slicing camera *. * Suggerimento: preparare agar prima dissezione. Conservare pre-agar fatto all&#39;interno di una capsula di Petri coperta in frigorifero. Agarosio acquistato da sostanze chimiche o EMD Invitrogen. </li></ol> 2. Preparato di 6-pozzetti con terreno di coltura <ol><li> Sotto una cappa sterile, riempire 1 vasca per animale di un 6-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura e incubare a 35 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Preparare come molti inserti membrana cultura come necessaria e metterli in cappuccio per un uso successivo. </li></ol> 3. Isolamento del tronco di pollo uditive <ol><li> Uovo posto sotto una fonte luminosa di luce per determinare la piena vuoto dello spazio aereo dell&#39;embrione (tipicamente grande lato dell&#39;uovo). </li><li> Rompere grande lato di uovo esporre sacco membrana. Fai la fetta nella membrana sacco con bisturi e rimuovere delicatamente la testa di un embrione di pollo. </li><li> Rapidamente decapitare la testa con le forbici. </li><li> Mettete la punta della lama di rasoio leggermente al posteriore e tra gli occhi. Fare un rostrale-to-caudale incisione linea mediana attraverso il cranio applicando solo una leggera pressione *. * Suggerimento: pressione applicata dipende dall&#39;età dell&#39;embrione (cioè, più giovane = meno = più vecchi) </li><li> Premere delicatamente da parte della pelle e piume di esporre cranio e verificare taglio della linea mediana. </li><li> Blocco porzione rostrale del cranio da affettare con una lametta. Lama posizione posteriore per gli occhi e rapidamente tagliare intero cranio e tessuto cerebrale *. * Suggerimento: è necessaria una forte pressione per rimuovere completamente sezione rostrale. </li><li> Fai la linea mediana a incisioni laterali con piccole forbici nella regione caudale del cranio, leggermente anteriore ai muscoli del collo visibile su entrambi i lati della testa. Tirare fuori cranio ei tessuti per esporre cervelletto e al cervello. </li><li> Rimuovere delicatamente dalla base del tronco cerebrale del cranio, tagliando il tessuto fissato con piccole forbici. Una volta che tutto il tessuto viene tagliato, tronco cerebrale dovrebbe muoversi liberamente fuori dal cranio *. * Suggerimento: potrebbe essere necessario capovolgere il cranio (in basso cervello) per tagliare i tessuti attaccati. </li></ol> 4. Preparazione del tronco per affettare <ol><li> Una volta tolto dal cranio, perno tronco cerebrale giù attraverso l&#39;ottica Tecta. </li><li> Rimuovere completamente il cervelletto con delicatezza il taglio con le forbici i peduncoli piccoli, esponendo il pavimento del quarto ventricolo. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto membranoso e dei vasi sanguigni dalla superficie del tronco encefalico con una pinzetta e fare dei tagli laterali attraverso l&#39;ottica Tecta per isolare il tronco cerebrale. </li><li> Mettete una piccola quantità di colla super-vibratome sul palco di fronte al blocco di agar (verso la lama vibratome). </li><li> Utilizzando una pinzetta, delicatamente e rapidamente sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale e del tessuto posto sulla super-colla con la parte rostrale verso il basso e verso la parte dorsale a lama vibratome *. * Suggerimento: colla in eccesso dovrebbe essere assorbito con un Kim-wipe o filtro di carta prima fase successiva. </li><li> Delicatamente versare ACSF ossigenata in fase vibratome *. * Nota: questo ACSF possono essere continuamente bolle con O 2 / CO 2. Tuttavia, bolle di ACSF in un piccolo volume di soluzione risultati in movimento indesiderato (e possibili danni) a fette tronco cerebrale. Se eseguita rapidamente, già ossigenato ACSF dalla dissezione è sufficiente. </li><li> Lama Vibratome dovrebbe essere ad un angolo di 20-22 °. Inizio vibratome (oscillazione dovrebbe essere fissato a massima ampiezza) e spostare stadio verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto è parallelo con la lama prima di tagliare. </li><li> Spostare rapidamente lama verso il tessuto cerebrale. Rallentare notevolmente appena prima del contatto della lama con il tessuto. </li><li> Iniziare taglio dei tessuti con più bassa possibile movimento in avanti. Una volta attraverso l&#39;intera sezione coronale del tessuto, spostare delicatamente fetta di distanza dalla lama con una spazzola o un bicchiere rotto, licenziato pipetta lucido, adatta ad una estremità con un bulbo di gomma. </li><li> Inferiore fase 300-500 micron passi e fetta di nuovo. Ripetere l&#39;operazione fino firme anatomiche sono visibili nel tessuto cerebrale. A questo punto, il tessuto cerebrale fetta contenenti strutture uditive a 200-1000 micron spessori, a seconda dell&#39;età dei bisogni del tessuto e sperimentale. </li><li> Attentamente mantenere fette utilizzabile in ordine di taglio, cioè il 1 fetta ° rappresenta la regione più caudale del circuito (a bassa frequenza di elaborazione del suono) e l&#39;ultima fetta rappresenta la sezione più rostrale (ad alta frequenza Processing) *. * Nota: per il posizionamento di fette per la cultura, vai alla sezione 6. Per in-vitro di stoccaggio fisiologia, vedere la sezione successiva. </li></ol> 5. Stoccaggio fetta di in-vitro Fisiologia <ol><li> A seconda dell&#39;età degli embrioni di pollo e lo spessore della fetta, ogni animale dovrebbe prevedere 1-6 fette. </li><li> Delicatamente posto singole sezioni in camera con pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma. Camera devono essere numerate. Posto solo una fetta per ogni bene, al fine di mantenere alcune specificità tonotopica (ad esempio, la fetta più caudale nella camera 1 e la fetta più rostrale nella camera scorso). Camera deve essere riempito con ACSF e continuamente bolle con una miscela di 95% O 2 / 5% di CO 2 (pH 7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l). </li><li> Lasciare fette per equilibrare mettendo la camera in un bagno caldo (36 ° C) per circa 1 ora. </li><li> Rimuovere camera da bagno caldo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per circa mezz&#39;ora. </li><li> Dopo ore e mezza a temperatura ambiente, fette possono essere trasferiti dalla camera tenendo ad una camera di registrazione ~ 0,5 ml montato su un microscopio per esperimenti di elettrofisiologia. </li><li> Fette può essere utilizzato per un massimo di ~ 6 ore dopo la rimozione dal bagno caldo. </li></ol> 6. Preparazione delle Culture Slice organotipica 8 <ol><li> Subito dopo la procedura di taglio (si veda Sezione 6) fette di trasferimento con ~ 500 microlitri ACSF utilizzando una pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma per un piatto ben 48 su ghiaccio. Una fetta per bene *. * Suggerimento: Fette devono essere almeno 300 micron e fino a 1000 micron di spessore. </li><li> Dopo fette sono stati raccolti, trasferire il 48 pozzetti alla cappa. </li><li> Rimuovere un 6-pozzetti contenenti terreno di coltura fuori dell&#39;incubatore e trasferirlo alla cappa. </li><li> Appena prima di mettere le fette da un cervello solo su membrane, luogo uno degli inserti membrana preparati (vedi Sezione 2.2) in un pozzo con terreno di coltura. Assicurarsi che non siano presenti bolle d&#39;aria in membrana. </li><li> Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire una fetta in una goccia d&#39;ACSF sulla membrana cultura e rimuovere ACSF in eccesso con una micropipetta. Ripetere l&#39;operazione per le fette restanti (max 4 fette per membrana) *. * Suggerimento: assicurarsi fette non si toccano e fette posto centralmente sulla membrana in modo da non toccare il bordo della membrana. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per il numero di sezioni di cervello necessario *. * Suggerimento: se le culture sono manipolate in un punto secondo momento, potrebbe essere vantaggioso per limitare la quantità di membrane al 3 per 6 pozzetti per ridurre il tempo vengono rimosse le culture dal termostato. </li><li> Cambia terreno di coltura 3 volte a settimana sotto una cappa: Rimuovere vecchi media con un tubo a vuoto con una punta sterile mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo con un paio di pinze. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco bene mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo. Quando tutti i media è cambiato, messo piastra posteriore nell&#39;incubatore. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Circuiti binaurale del tronco cerebrale uditivo pollo. (A) Schema di una sezione coronale e (BF) in vitro immagini fetta di tronco cerebrale uditivo pollo. Il circuito in (A) mostra afferente gli ingressi eccitatori dal nervo uditivo (AN) per nucleo magnocellularis (NM) e nucleo angularis (NA). NM progetti bilaterali ingressi eccitatori al nucleo laminaris (NL) su entrambi i lati del tronco encefalico. Un input inibitorio dal nucleo olivare superiore (SON) progetti di NA, NM e NL. In vitro a fette (BF) sono immagini sequenziali (200 micron ciascuno) andando da caudale (B) per rostrale (F) del tronco cerebrale uditivo pollo, che rappresenta il basso ad alta frequenza regioni, rispettivamente. Circuiteria è responsabile per la codifica proprietà temporali del suono utilizzato principalmente per la localizzazione del suono. Barra di scala a (B) = 500 micron e si applica per le immagini in (CF). Frecce (D) puntare al singolo strato corpo cellulare di NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Neuroni coltivati ​​sviluppare normale risposta fisiologica proprietà. Sovrapposte variazioni di tensione della membrana in risposta a iperpolarizzante e depolarizzanti passi corrente da acuta (A &amp; C) e della massa colta a 4 (B) e 7 (D) giorni di cultura (DIC). Nota di variazioni iperpolarizzante tensione &quot;sag&quot;, forte riduzione della corrente verso l&#39;esterno, e monocottura AP che si sviluppano in modo simile nell&#39;approccio cultura fetta rispetto all&#39;età tessuto equivalente acuta. Iniezioni di corrente sono stati 200 ms, a pochi passi di 50-100 pA. RMP sono stati tra -55 e -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Struttura anatomica in sli culturaCES. metà sinistra del tronco cerebrale uditivo di un pollo E11 dopo 7 giorni di cultura (DIC). Un anticorpo contro la proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2), che si verifica nel soma e dendriti, è etichettato in verde. Un gruppo di nucleo magnocellularis (NM), i neuroni e le sue assoni sono etichettati in rosso tramite elettroporazione di un destrano Alexa colorante. Sia NM e la linea cellulare NL sono visibili. Ipsilaterale terminali degli assoni NM può essere visto proiettare al dendriti dorsale NL (punte di freccia bianca).

<ol>
	<li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K++currents.">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li><li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken.">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li><li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons.">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li><li>Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+glutamatergic+synaptic+transmission+in+binaural+auditory+neurons.">Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).</li><li>Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+in+the+chick:+ontogeny+of+postsynaptic+responses.">Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses.</a> J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accommodation+enhances+depolarizing+inhibition+in+central+neurons.">Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons.</a> J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).</li><li>Lu, T., Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus.">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways.">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons.">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li><li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure.">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per diversi decenni, la preparazione fetta acuta del tronco cerebrale pollo è stato usato per studiare l&#39;elaborazione uditiva 9, 10. Questo approccio ha fornito una quantità enorme di dati in vitro fisiologici sul trattamento binaurale da entrambi gli stati di sviluppo e maturare 4, 11, 12. Si sa molto su questo circuito ad alta specializzazione e il ruolo di ogni nucleo svolge nella lavorazione temporale dei suoni 13, 14. In realtà, manipolazioni sperimentali a breve ter...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken ACSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-11624</td>
<td>130 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-10576</td>
<td>26 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9333</td>
<td>3 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8282</td>
<td>1.25 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M33-500</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>423525000</td>
<td>2 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken culture medium (store at 4&deg;C)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen</td>
<td>12492-013</td>
<td>48.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Earl's balanced salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E-2888</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7513</td>
<td>1.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>2.75%</td>
</tr>
<tr>
<td>horse serum (heat inactivated, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1138</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-0781</td>
<td>1.00 ml 
* = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Specific equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millicell-CM cell culture inserts</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plate</td>
<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator</td>
<td>Forma Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and culture of chicken auditory brainstem slices

Il tronco cerebrale uditivo pollo è un collaudato sistema di modello che è stato ampiamente usato per studiare l&#39;anatomia e la fisiologia del processo uditivo in periodi di discreto sviluppo 04/01 nonché meccanismi per la codifica temporale nel sistema nervoso centrale 5-7. Qui vi presentiamo un metodo per preparare le fette di pollo uditivi del tronco encefalico, che può essere utilizzato per acuti procedure sperimentali o di fette cultura organotipica per le manipolazioni sperimentali a lungo termine. Il tronco cerebrale uditivo pollo è composto da angularis nucleo, magnocellularis, oliva laminaris e superiore. Questi nuclei sono responsabili per l&#39;elaborazione del suono binaurale e singole preparazioni fetta coronale preservare l&#39;intero circuito. In definitiva, le culture fetta organotipica in grado di fornire l&#39;opportunità di manipolare vari parametri di sviluppo come l&#39;attività sinaptica, espressione di componenti pre e post-sinaptici, espressione di eccitabilità aspetti di controllo e di espressione genica differenziale Questo approccio può essere utilizzato per ampliare la conoscenza generale sullo sviluppo del circuito neurale, affinamento e maturazione.

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l&#39;elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l&#39;intero circuito mentre l&#39;approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K Views.  University of Washington. Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l'elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l'intero circuito mentre l'approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

Video: Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...