המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד&quot;ר ג&#39;אנג ג&#39;יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.

1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דפוסים הסלולר האיבר של קורטי, להרדים כראוי מבוים עוברים או מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקפסולה otic, המכיל את האוזן הפנימית קרומי. בשנת העכבר, זה יכול להיעשות בקלות על העוברים על העובר (ה) ביום 14.5 ומעלה, שבה E0.5 הוא היום שבו תקע הנרתיק זוהה. Dissection של הקפסולה otic נעשה לראשונה על ידי עריפת ראש ופתיחת הגולגולת על קו האמצע. הסר המוח לחשוף כל אוזן (איור 1A). האוזניים הפנימי ניתן הפגיזו את מלקחיים באמצעות שלמים (כגון 1B דומון # 5, איור.). אם הדמיה האיבר של קורטי, הסרה זהירה של כל רקמות החיבור ואת עצבי הקשור הקפסולה otic אינו הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון אוזניים פנימי שלם על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) עם נדנדה עדין ב 4 ° C במשך הלילה 1.8 בורג הכתיר מ&quot;ל NUNC cryo-צינור בקבוקונים, או מכולה בגודל מתאים אחרים. פתרון PFA צריכה להיעשות טרי DDH 2 0, מאוחסן אז -20 ° C עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את מקבע עם שלושה שינויים של פוספט 1X בופר סליין (PBS). רקמות ניתן לאחסן סטרילי 1X PBS במשך ימים עד חודשים עד מוכן לעיבוד. עבור רקמות למבוגרים, decalcify ב EDTA 10% (0.27 מ &#39;) בשעה 4 ° C למשך 5 ימים, ואחריהם שטיפה אחסון 1X PBS. </li></ol> 2. חיתוך חלקים vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% טמפ &#39;התכה נמוכה agarose ב 1X PBS. הוסף נקודת התכה נמוכה agarose אל 1X PBS ומיקרוגל עד agarose נמצא פתרון. תשמרי על עצמך כי הפתרון אינו בועה על - להוציא במיקרוגל מעת לעת מערבולת לערבב. שמור על פתרון אמבטיה 55 מעלות צלזיוס מים עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את האוזן הפנימית מפתרון PBS 1X ואת המיקום בתחתית התבנית פיל-A-Way הטבעה. Pipet משם כל עודף 1X PBS מן התבנית. מלא עובש כדי לכסות את הרקמה עם שפע של נוזל 4% טמפ &#39;התכה נמוכה agarose (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האוזן הפנימית עבור חתך במישור המתאים. אני השיגו טוב חתכים של האיבר של קורטי על ידי קירוב את המיקום של הקפסולה otic כאילו הושארו באתרם בראש חתך במישור רוחבי. עבור E14.5 עוברים למבוגרים, מקם את האוזן הפנימית, כך הוא מוצג בצורה רוחבית, עם התעלה חצי עגול לרוחב גלוי (איור 2B). זווית האוזן הפנימית, כך שנוצר על ידי קו הצד האחורי של הקפסולה otic כ בזווית של 45 מעלות מהמטוס המיועד של חתך (איור 2 א &#39;, ב). כאשר הקפסולה otic מוצג כך את החלק הגבי של הקפסולה otic נמצא בראש, להפוך את הבסיס של שבלול צריך להיות ממוקם בתחתית (ראש חץ, איור. 2B) ואת תעלת קדמית חצי עגול (עולה) צריך להיות בחלק העליון (איור 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose תקבע ב RT בתוך 30 דקות. פיל, הרחק תבניות העברה המכיל רקמות מוטבע על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן סעיף. אם חתך יהיה לדחות עד למחרת, להוסיף 1X PBS כדי לכסות את agarose במתכונת ומאחסנים בקופסה המכילה מגבות נייר לח טבול 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף עובש הפלסטיק. באמצעות סכין גילוח, לגזור תיבת agarose המכיל את רקמות האוזן הפנימית. תשמרי על מנת להבטיח כי מטוס של סעיף זה ישר מקביל בצד השני של הרחוב, אשר יהיה משטח שעליו לחסום agarose מודבק למטה. מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי agarose מרחבי הרקמה, כך רקמות יהיה נתמכות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק לצרף את גוש למשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף ב עובי 40-100 מיקרומטר ידי vibratome. שמור סעיפים בצלחת רקמות תרבות מלא 1X PBS, 0.1% TritonX-100. סעיף נציג דרך הספירלה שבלול מוצג באיור. 2C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לנתח משם את agarose מן הרקמה. Agarose לא יחדרו את הרקמה, אבל פשוט יהיה תקוע על פני השטח החיצוני של האוזן הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, בריכת agarose חינם, רקמה מחולק באמצעות pipet עם פתח גדול חור כדי למנוע מריחה מוגזמת של הרקמה. אם ביצוע כתמים נוגדן מרובים על רקמות שונות מרובות, ניתן לזהות קטעים מאורגן 16 - או 24 גם תרבות צלחת רקמות. </li></ol> 3. מכתים נוגדן vibratome בסעיפים המשך עם נוגדן הכתם. תהליך מקטעים שלמים הר, ריחוף ללא פתרון. להלן נוגדן למשל מכתים פרוטוקול סמן S100 של תאים מעמודי התווך של האיבר של קורטי, אבל הפרוטוקול יכול לשמש נוגדן כלשהו. שוטף כל נערכות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת רב גם בתרבית רקמה, דגירה חופשי צף חלקים עם נדנדה עדין PBT (1X PBS, 1% שור טריטון בסרום אלבומין, 0.1% X-100) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן לחסום חופשי floating קטעים עם נדנדה עדין PBT + עז בסרום נורמלי (50 NGS μl / 1 מ&quot;ל PBT) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן להוסיף נוגדן ראשוני בדילול מלא + PBT NGS (1:200 דילול S100 ב PBT + NGS). דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדן ראשוני. לשטוף 3X, 5 דקות. עם PBT, 4X ואז, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם PBT + NGS, 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות (שהועלו עז) בדילול מלא + PBT NGS. דגירה לילה ב 4 ° C, או כמה שעות, RT, נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדנים משני. לשטוף 3X, 5 דקות. אז 4X, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את PBT האחרון לשטוף ולהחליף עם המדיום המתאים הרכבה מימית המכילה counterstain גרעיני. </li></ol> 4. חלקים הרכבה על שקופיות מיקרוסקופיה confocal כדי למנוע ריסוק בסעיפים עבה עם coverslip, כאשר גובר חלקים בודדים, spacer חייב להיות מוכנס בין שקופיות מיקרוסקופ ואת coverslip. להלן שתי שיטות חלופיות של חלקים הרכבה vibratome עבה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spacer אפשר ליצור על ידי הנחת שפה של שומן ואקום בתוך ריבוע סביב החלק רקמות. לכן, כאשר הנחת את coverslip, קצוות של coverslip יהיה חתום גריז ואקום. לחץ כלפי מטה על שולי coverslip עם האגודל כדי לדבוק בנחישות אותו לשקופית. אם גריז ואקום היא יפה אחיד הנוכחי סביב כל הקצוות של coverslip, החלק יהיה אטום מספיק לשימוש מיקרוסקופ confocal הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, spacer יכול להיות שנוצרו באמצעות agarose שרף כרומטוגרפיה של גודל רשת ידועה (כגון Affi-Gel ג&#39;ל כחול, Bio-Rad). 1 Pipet μl של שרף לשקופית מיקרוסקופ בכל אחת מארבע פינות coverslip שבו יוצב. One Pipet רקמות סעיף התקשורת הרכבה לאמצע של ארבע נקודות של שרף. Coverslip. אם באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוכה, לאטום את coverslip לשקופית באמצעות מיקרוסקופ nailpolish. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג סעיפים אופטי של פרוסות vibratome מוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. כדי לכמת את סוגי תאים שונים בתוך האיבר של קורטי, להשיג Z-מחסנית בגודל צעד מוגדר (בין 1.5 ל -3 מיקרומטר). מדורים צריך להיות נגד מוכתם לצבוע גרעינית (שלב 3.8). דמויות יכולות להיבחן על כל מסך המחשב לאחר אוסף תמונה confocal. תאים ניתן לספור ידני להיות התבוננות הופעה והיעלמות של הגרעינים כתמונות נבחנות ברצף באמצעות מחסנית-z. </li></ol> 5. נציג תוצאות: Confocal נציג Z-מחסנית באמצעות קטע vibratome, מוכתם עבור חלבון S100, אשר שוהה עמוד ותאי &quot;Deiters, ו counterstained עם צבע גרעיני (איור 3A-F). פאנל כל התמונה confocal נלקחה ב 3 מיקרומטר, צעדים, עם פאנל התמונה confocal שהושגו הקרובים אל פני השטח של סעיף הפאנל vibratome ו-F התמונה confocal השיג רוב פנימי בתוך הקטע vibratome. מורפולוגיה של האיבר של קורטי מופיע שיבשו מינימלית. בפרט, שלוחות cytoplasmic של תאים עמוד אינם שבורים. לפי לציין את המראה ואת היעלמותו של גרעיני תאים באמצעות עמוד מחסנית-z (איור 3A ל 3F), תא פנימי וחיצוני כאחד מספר העמוד ניתן לספור (ראה מספור, איור 3A -. F). בשל המספר הקטן של כל סוג תא לכל תמונה confocal, גישה זו ניתן להשתמש כדי לספור תאים מסוגים ביותר בתוך האיבר של קורטי. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. אינטקט, 15 בן שבועיים, האוזניים הפנימי מבוגר עטוף הקפסולה otic. (א) קפסולה otic ימינה (בסוגריים) עטוף הגולגולת, שנצפו מנקודת מבט של בתוך הראש, לאחר ההסרה של המוח. Anterior נמצאת מימין. (ב) שלמים, 15 שבועות בן באוזן הפנימית לאחר דיסקציה מהגולגולת. משטח הרוחב של האוזן הפנימית שמאל גלוי; השטח המדיאלי של האוזן הפנימית זכות גלוי. תוויות לציין את מיקומם של הקדמי חצי עגול תעלה (עולה), שיתוף (שבלול), ו ow (חלון סגלגל). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. (א) האוזן הפנימית שלמים מן מבוגר 15 בן שבוע, מוטבע agarose במרכז עובש פיל פרידה. המטוס מיועד סעיף מצוין. (ב) תקריב תמונה של אוזן, 15 בן שבועיים פנימי שלם לפני ההטבעה. חלק מן העצם שמסביב כבר גזור משם כך מבוך קרומי יכול לראות בצורה ברורה יותר. התעלה לרוחב חצי עגול (LSC), תעלה קדמית חצי עגול (עולה), וכן שבלול (במשותף) הם לייחס (עקומות לבן). להפוך את הבסיס של שבלול (ראש חץ) והמטוס נועד סעיף (קו מקווקו) מצוינים. (ג) נציג CROss-קטע דרך שבלול. בחתך אחד דרך צינור שבלול, האיבר של קורטי (OC) הוא התאגרף, vascularis stria (ד&quot;ה) הוא בסוגריים, ואת הממברנה של Reissner (RM) מצוין. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. איבר קורטי בעכבר wild-type ב p21. (AF) סדרה confocal סדרתית, על תאים 3 מיקרומטר צעד בגודל, דרך איבר S100 נוגדן מוכתם של קורטי לדמיין את התאים העמוד Deiters &quot;. ספירת התאים עמוד הפנימיים והחיצוניים מההתחלה עד הסוף של הסדרה ממוספרים. קיצורים: IHC (תא השיער הפנימי), aIHC (שיער סמוך התאים הפנימית), OHC (תא השיער החיצונית), מחשב (תא העמוד), DC (תא &#39;Deiters).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC.

ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> לייקה VT1000S רטט Blade Microtome </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סטודנט דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> טמפ &#39;התכה נמוכה ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> פיל-A-Way הטבעה עובש </td><td> Polysciences </td><td> 18986 או 18646A </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> ואקום גריז </td><td> דיג </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel ג&#39;ל כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory (הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי &quot;Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי &quot;Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical. הנה אני מתארת ​​תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K Views.  Medical College of Wisconsin. הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Video: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Developmental Biology

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biology

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens act in a concentration- and time-dependent manner to specify distinct transcriptional programs that instruct and reinforce cell fate. One mechanism by which appropriate morphogen signaling thresholds are ensured is through delivery of the signaling proteins by specialized filopodia called cytonemes. Cytonemes are very thin (&#8804;200 nm in diameter) and can grow to lengths of several hundred microns, which makes their preservation for fixed-image analysis challenging. This paper describes a refined method for delicate handling of mouse embryos for fixation, immunostaining, and thick sectioning to allow for visualization of cytonemes using standard confocal microscopy. This protocol has been successfully used to visualize cytonemes that connect distinct cellular signaling compartments during mouse neural tube development. The technique can also be adapted to detect cytonemes across tissue types to facilitate the interrogation of developmental signaling at unprecedented resolution.

Here, an optimized step-by-step protocol is provided for fixation, immunostaining, and sectioning of embryos to detect specialized signaling filopodia called cytonemes in developing mouse tissues.

קיבוע רקמת עכבר עוברית לניתוח ציטונמה

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...