המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד&quot;ר ג&#39;אנג ג&#39;יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.

1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דפוסים הסלולר האיבר של קורטי, להרדים כראוי מבוים עוברים או מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקפסולה otic, המכיל את האוזן הפנימית קרומי. בשנת העכבר, זה יכול להיעשות בקלות על העוברים על העובר (ה) ביום 14.5 ומעלה, שבה E0.5 הוא היום שבו תקע הנרתיק זוהה. Dissection של הקפסולה otic נעשה לראשונה על ידי עריפת ראש ופתיחת הגולגולת על קו האמצע. הסר המוח לחשוף כל אוזן (איור 1A). האוזניים הפנימי ניתן הפגיזו את מלקחיים באמצעות שלמים (כגון 1B דומון # 5, איור.). אם הדמיה האיבר של קורטי, הסרה זהירה של כל רקמות החיבור ואת עצבי הקשור הקפסולה otic אינו הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון אוזניים פנימי שלם על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) עם נדנדה עדין ב 4 ° C במשך הלילה 1.8 בורג הכתיר מ&quot;ל NUNC cryo-צינור בקבוקונים, או מכולה בגודל מתאים אחרים. פתרון PFA צריכה להיעשות טרי DDH 2 0, מאוחסן אז -20 ° C עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את מקבע עם שלושה שינויים של פוספט 1X בופר סליין (PBS). רקמות ניתן לאחסן סטרילי 1X PBS במשך ימים עד חודשים עד מוכן לעיבוד. עבור רקמות למבוגרים, decalcify ב EDTA 10% (0.27 מ &#39;) בשעה 4 ° C למשך 5 ימים, ואחריהם שטיפה אחסון 1X PBS. </li></ol> 2. חיתוך חלקים vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% טמפ &#39;התכה נמוכה agarose ב 1X PBS. הוסף נקודת התכה נמוכה agarose אל 1X PBS ומיקרוגל עד agarose נמצא פתרון. תשמרי על עצמך כי הפתרון אינו בועה על - להוציא במיקרוגל מעת לעת מערבולת לערבב. שמור על פתרון אמבטיה 55 מעלות צלזיוס מים עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את האוזן הפנימית מפתרון PBS 1X ואת המיקום בתחתית התבנית פיל-A-Way הטבעה. Pipet משם כל עודף 1X PBS מן התבנית. מלא עובש כדי לכסות את הרקמה עם שפע של נוזל 4% טמפ &#39;התכה נמוכה agarose (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האוזן הפנימית עבור חתך במישור המתאים. אני השיגו טוב חתכים של האיבר של קורטי על ידי קירוב את המיקום של הקפסולה otic כאילו הושארו באתרם בראש חתך במישור רוחבי. עבור E14.5 עוברים למבוגרים, מקם את האוזן הפנימית, כך הוא מוצג בצורה רוחבית, עם התעלה חצי עגול לרוחב גלוי (איור 2B). זווית האוזן הפנימית, כך שנוצר על ידי קו הצד האחורי של הקפסולה otic כ בזווית של 45 מעלות מהמטוס המיועד של חתך (איור 2 א &#39;, ב). כאשר הקפסולה otic מוצג כך את החלק הגבי של הקפסולה otic נמצא בראש, להפוך את הבסיס של שבלול צריך להיות ממוקם בתחתית (ראש חץ, איור. 2B) ואת תעלת קדמית חצי עגול (עולה) צריך להיות בחלק העליון (איור 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose תקבע ב RT בתוך 30 דקות. פיל, הרחק תבניות העברה המכיל רקמות מוטבע על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן סעיף. אם חתך יהיה לדחות עד למחרת, להוסיף 1X PBS כדי לכסות את agarose במתכונת ומאחסנים בקופסה המכילה מגבות נייר לח טבול 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף עובש הפלסטיק. באמצעות סכין גילוח, לגזור תיבת agarose המכיל את רקמות האוזן הפנימית. תשמרי על מנת להבטיח כי מטוס של סעיף זה ישר מקביל בצד השני של הרחוב, אשר יהיה משטח שעליו לחסום agarose מודבק למטה. מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי agarose מרחבי הרקמה, כך רקמות יהיה נתמכות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק לצרף את גוש למשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף ב עובי 40-100 מיקרומטר ידי vibratome. שמור סעיפים בצלחת רקמות תרבות מלא 1X PBS, 0.1% TritonX-100. סעיף נציג דרך הספירלה שבלול מוצג באיור. 2C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לנתח משם את agarose מן הרקמה. Agarose לא יחדרו את הרקמה, אבל פשוט יהיה תקוע על פני השטח החיצוני של האוזן הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, בריכת agarose חינם, רקמה מחולק באמצעות pipet עם פתח גדול חור כדי למנוע מריחה מוגזמת של הרקמה. אם ביצוע כתמים נוגדן מרובים על רקמות שונות מרובות, ניתן לזהות קטעים מאורגן 16 - או 24 גם תרבות צלחת רקמות. </li></ol> 3. מכתים נוגדן vibratome בסעיפים המשך עם נוגדן הכתם. תהליך מקטעים שלמים הר, ריחוף ללא פתרון. להלן נוגדן למשל מכתים פרוטוקול סמן S100 של תאים מעמודי התווך של האיבר של קורטי, אבל הפרוטוקול יכול לשמש נוגדן כלשהו. שוטף כל נערכות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת רב גם בתרבית רקמה, דגירה חופשי צף חלקים עם נדנדה עדין PBT (1X PBS, 1% שור טריטון בסרום אלבומין, 0.1% X-100) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן לחסום חופשי floating קטעים עם נדנדה עדין PBT + עז בסרום נורמלי (50 NGS μl / 1 מ&quot;ל PBT) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן להוסיף נוגדן ראשוני בדילול מלא + PBT NGS (1:200 דילול S100 ב PBT + NGS). דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדן ראשוני. לשטוף 3X, 5 דקות. עם PBT, 4X ואז, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם PBT + NGS, 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות (שהועלו עז) בדילול מלא + PBT NGS. דגירה לילה ב 4 ° C, או כמה שעות, RT, נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדנים משני. לשטוף 3X, 5 דקות. אז 4X, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את PBT האחרון לשטוף ולהחליף עם המדיום המתאים הרכבה מימית המכילה counterstain גרעיני. </li></ol> 4. חלקים הרכבה על שקופיות מיקרוסקופיה confocal כדי למנוע ריסוק בסעיפים עבה עם coverslip, כאשר גובר חלקים בודדים, spacer חייב להיות מוכנס בין שקופיות מיקרוסקופ ואת coverslip. להלן שתי שיטות חלופיות של חלקים הרכבה vibratome עבה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spacer אפשר ליצור על ידי הנחת שפה של שומן ואקום בתוך ריבוע סביב החלק רקמות. לכן, כאשר הנחת את coverslip, קצוות של coverslip יהיה חתום גריז ואקום. לחץ כלפי מטה על שולי coverslip עם האגודל כדי לדבוק בנחישות אותו לשקופית. אם גריז ואקום היא יפה אחיד הנוכחי סביב כל הקצוות של coverslip, החלק יהיה אטום מספיק לשימוש מיקרוסקופ confocal הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, spacer יכול להיות שנוצרו באמצעות agarose שרף כרומטוגרפיה של גודל רשת ידועה (כגון Affi-Gel ג&#39;ל כחול, Bio-Rad). 1 Pipet μl של שרף לשקופית מיקרוסקופ בכל אחת מארבע פינות coverslip שבו יוצב. One Pipet רקמות סעיף התקשורת הרכבה לאמצע של ארבע נקודות של שרף. Coverslip. אם באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוכה, לאטום את coverslip לשקופית באמצעות מיקרוסקופ nailpolish. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג סעיפים אופטי של פרוסות vibratome מוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. כדי לכמת את סוגי תאים שונים בתוך האיבר של קורטי, להשיג Z-מחסנית בגודל צעד מוגדר (בין 1.5 ל -3 מיקרומטר). מדורים צריך להיות נגד מוכתם לצבוע גרעינית (שלב 3.8). דמויות יכולות להיבחן על כל מסך המחשב לאחר אוסף תמונה confocal. תאים ניתן לספור ידני להיות התבוננות הופעה והיעלמות של הגרעינים כתמונות נבחנות ברצף באמצעות מחסנית-z. </li></ol> 5. נציג תוצאות: Confocal נציג Z-מחסנית באמצעות קטע vibratome, מוכתם עבור חלבון S100, אשר שוהה עמוד ותאי &quot;Deiters, ו counterstained עם צבע גרעיני (איור 3A-F). פאנל כל התמונה confocal נלקחה ב 3 מיקרומטר, צעדים, עם פאנל התמונה confocal שהושגו הקרובים אל פני השטח של סעיף הפאנל vibratome ו-F התמונה confocal השיג רוב פנימי בתוך הקטע vibratome. מורפולוגיה של האיבר של קורטי מופיע שיבשו מינימלית. בפרט, שלוחות cytoplasmic של תאים עמוד אינם שבורים. לפי לציין את המראה ואת היעלמותו של גרעיני תאים באמצעות עמוד מחסנית-z (איור 3A ל 3F), תא פנימי וחיצוני כאחד מספר העמוד ניתן לספור (ראה מספור, איור 3A -. F). בשל המספר הקטן של כל סוג תא לכל תמונה confocal, גישה זו ניתן להשתמש כדי לספור תאים מסוגים ביותר בתוך האיבר של קורטי. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. אינטקט, 15 בן שבועיים, האוזניים הפנימי מבוגר עטוף הקפסולה otic. (א) קפסולה otic ימינה (בסוגריים) עטוף הגולגולת, שנצפו מנקודת מבט של בתוך הראש, לאחר ההסרה של המוח. Anterior נמצאת מימין. (ב) שלמים, 15 שבועות בן באוזן הפנימית לאחר דיסקציה מהגולגולת. משטח הרוחב של האוזן הפנימית שמאל גלוי; השטח המדיאלי של האוזן הפנימית זכות גלוי. תוויות לציין את מיקומם של הקדמי חצי עגול תעלה (עולה), שיתוף (שבלול), ו ow (חלון סגלגל). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. (א) האוזן הפנימית שלמים מן מבוגר 15 בן שבוע, מוטבע agarose במרכז עובש פיל פרידה. המטוס מיועד סעיף מצוין. (ב) תקריב תמונה של אוזן, 15 בן שבועיים פנימי שלם לפני ההטבעה. חלק מן העצם שמסביב כבר גזור משם כך מבוך קרומי יכול לראות בצורה ברורה יותר. התעלה לרוחב חצי עגול (LSC), תעלה קדמית חצי עגול (עולה), וכן שבלול (במשותף) הם לייחס (עקומות לבן). להפוך את הבסיס של שבלול (ראש חץ) והמטוס נועד סעיף (קו מקווקו) מצוינים. (ג) נציג CROss-קטע דרך שבלול. בחתך אחד דרך צינור שבלול, האיבר של קורטי (OC) הוא התאגרף, vascularis stria (ד&quot;ה) הוא בסוגריים, ואת הממברנה של Reissner (RM) מצוין. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. איבר קורטי בעכבר wild-type ב p21. (AF) סדרה confocal סדרתית, על תאים 3 מיקרומטר צעד בגודל, דרך איבר S100 נוגדן מוכתם של קורטי לדמיין את התאים העמוד Deiters &quot;. ספירת התאים עמוד הפנימיים והחיצוניים מההתחלה עד הסוף של הסדרה ממוספרים. קיצורים: IHC (תא השיער הפנימי), aIHC (שיער סמוך התאים הפנימית), OHC (תא השיער החיצונית), מחשב (תא העמוד), DC (תא &#39;Deiters).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC.

ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> לייקה VT1000S רטט Blade Microtome </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סטודנט דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> טמפ &#39;התכה נמוכה ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> פיל-A-Way הטבעה עובש </td><td> Polysciences </td><td> 18986 או 18646A </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> ואקום גריז </td><td> דיג </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel ג&#39;ל כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory (הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי &quot;Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי &quot;Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical. הנה אני מתארת ​​תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.1K Views.  Medical College of Wisconsin. הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Video: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

ויזואליזציה של מודולי קורטיקליים Cortices יונקים שעברו שיטוח

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...