저자는 아가로 오스 비즈를 사용하여 섹션을 탑재하는 제안에 대한 공촛점 현미경 박사 지앤 장을위한 어린이 연구소 이미징 코어의 사용을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 DC010387 부여했다.

1. 내부의 귀를 분리 및 고정 <ol><li> Corti의 장기에서 세포 patterning의 분석을 위해, 안락사가 적절하게 배아 또는 성인 개최. </li><li> 막의 내이 (内耳)를 포함, 귀의 캡슐을 절개하다. 마우스에서, 이것은 쉽게 (E) 일 14.5 세 이상이있는 E0.5가 질 플러그가 발견했습니다되는 날이 배아에서 배아에서 할 수 있습니다. 귀의 캡슐의 절개는 정중선에서 잘린과 두개골의 개방에 의해 첫번째 수행됩니다. 각각의 귀를 (그림 1A) 노출 두뇌를 제거합니다. 내부 귀는 그대로 사용 포셉 (예 : 더몬트 # 5, 그림. 1B)를 했대 수 있습니다. 이미지 Corti 기관의 경우, 귀의 캡슐과 관련된 모든의 연결 및 결합 조직의주의 제거가 필요하지 않습니다. </li><li> 4 부드러운 락을과 4 % paraformaldehyde에 집중 (PFA)에 의해 전체 내부 귀를 수정 ° C 1.8 ML 나사 덮인 NUNC Cryo - 튜브 튜브 또는 기타 적절한 크기의 용기에 하룻밤. PFA 솔루션이 필요 때까지 -20 ° C에 보관 ddH 2 0에서 신선한하여야한다. </li><li> 그 다음날, 1X 인산 세 변화로 정착액을 씻어 호수 (PBS)를 버퍼. 처리를위한 준비까지 조직은 개월 일 최대 살균 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 성인 조직에 대한 4 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.27 M)에 decalcify ° rinsing 및 1X PBS에 보관하여 다음에 오일에 대한 C,. </li></ol> 2. vibratome 섹션을 절단 <ol><li> 1X PBS에서 4% 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 솔루션에까지 1X PBS, 전자렌지에 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다. 솔루션을 통해 거품하지 않는 부탁해 - 정기적으로 전자 레인지와 섞어 소용돌이 밖으로 가져가라. 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C의 물을 욕조의 솔루션을 유지. </li><li> 포셉를 사용 1X PBS 솔루션과 필 - A - 웨이 포함 금형의 하단에있는 위치에서 내이 (内耳)를 제거합니다. 금형에서 Pipet 거리 초과 1X PBS. 액체 4퍼센트 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스 (그림 2A) 많이있는 조직을 커버하기 위해 금형을 입력합니다. </li><li> 해당 비행기에 sectioning에 대한 내이 (内耳)를 놓습니다. 난 그게 머리에 현장에 남아 있던 것처럼 귀의 캡슐의 위치를​​ approximating 및 가로 비행기에 sectioning에 의해 Corti의 기관의 좋은 크로스 섹션을 획득했습니다. 그것이 눈에 보이는 측면 반 원형 운하 (그림 2B)로, 옆으로 볼 수 있도록 성인, 위치, 내이 (内耳)를 E14.5 배아하십시오. 귀의 캡슐의 사후 옆 형성 라인 (그림 2A, B) sectioning의 의도된 비행기에서 45도 각도로 약되도록 내이 (内耳)를 각도. 귀의 캡슐이 귀의 캡슐의 지느러미 부분이 상단에 너무 많이하면 달팽이관의 기초 설정은 하단 (화살촉, 그림. 2B)에 위치하고 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC)이되어야한다 상단 (그림 2B)에 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 30 분 이내에 RT로 설정합니다. 전송 필 - 어웨이 금형은 ° C 섹션 준비까지 4 임베디드 조직을 포함하는. sectioning가 다음날까지 연기되는 경우, 1X PBS는 1X PBS에 담가 젖은 종이 타월을 포함 상자에 금형 및 저장소의 아가로 오스를 충당하기 위해 추가합니다. </li><li> 플라스틱 금형 벗겨내는 거지. 면도날을 사용하여 내이 (内耳)의 조직을 포함하는 아가로 오스 상자를 잘라. 섹션의 비행기가 똑바로 아가로 오스 블록이 아래로 접착되는 표면 될 블록의 반대편에 평행하게되도록하는데주의를 기울여야. 아가로 오스가 조직에 침투하지 않기 때문에, 조직이 잘 지원되도록, 조직 주위에서 너무 많은 아가로 오스를 잘라하지 않습니다. </li><li> 절단 표면에 블록을 연결하는 superglue를 사용합니다. </li><li> vibratome으로 40-100 μm의 두께로 섹션을 참조하십시오. 1X PBS, 0.1 % TritonX - 100 가득한 조직 문화 요리에 섹션을 저장합니다. 달팽이 나선형을 통해 대표적인 부분은 그림에 표시됩니다. 2C. </li><li> 조직의 아가로 오스 멀리 해부하다하는 포셉를 사용합니다. 아가로 오스는 조직을 침투하지 않지만 단지 내이 (内耳)의 바깥 표면에 붙어 것입니다. </li><li> 원하는 경우, 수영장, 아가로 오스 프리, sectioned 조직은 조직의 과도한 전단을 방지하기 위해 큰 구멍이 열고있는 pipet을 사용합니다. 또는 24 - 잘 조직 문화 요리 - 여러 다른 조직에 여러 항체 얼룩을 수행하는 경우, 섹션은 16 구성할 수 있습니다. </li></ol> 3. 항체 얼룩의 vibratome 섹션 항체는 얼룩 진행합니다. 솔루션에 무료 부동 전체 - 마운트의 프로세스 섹션. 아래 Corti의 기관의 기둥 세포의 S100 표시에 대한 예제 항체 얼룩 프로토콜이지만, 프로토콜은 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 별도의 언급이없는 한 모든 세척은 상온에서 실시하고 있습니다. <ol><li> 멀티 잘 조직 문화 요리에서 30 분 대한 PBT의 부드러운 락을 (1X PBS, 1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X - 100) 무료 - 부동 섹션을 품어. </li><li> 이전 솔루션과 블록 자유 층에서 Pipet30 분 대한 PBT + 정상 염소 혈청에 부드러운 락을 (50 μl NGS / 1 ML PBT)와 섹션을 oating. </li><li> 이전 솔루션에서 Pipet와 PBT + NGS (PBT + NGS의 S100의 1:200 희석)에 희석 기본 항체를 추가합니다. 4 밤새 품어 ° C를 부드러운 락을 함께. </li><li> 기본 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. PBT와 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께. </li><li> PBT + NGS와 블록, 30 분. </li><li> PBT + NGS의 희석 찬란 - 복합 이차 항체 (염소의 사육)와 부화. 4 밤새 품어 ° C, 또는 몇 시간, RT, 부드러운 락을. </li><li> 차 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께. </li><li> 마지막 PBT에서 Pipet은 씻어과 핵 counterstain를 포함하는 적절한 수성 장착 매체로 바꿉니다. </li></ol> 4. 슬라이드 및 공촛점 현미경에 장착 섹션 coverslip으로 두꺼운 부분을 깔아 뭉 갠다고 방지하기 위해, 각각의 섹션을 장착하면, 공백은 현미경 슬라이드와 coverslip 사이에 삽입해야합니다. 아래 두꺼운 vibratome 섹션을 장착 두 가지 다른 방법은 다음과 같습니다 <ol><li><ol type="a"><li> 스페이서는 조직 섹션 주변 광장에 진공 그리스의 림을 배치하여 만들 수 있습니다. 따라서 coverslip를 내려놓고 때 coverslip의 가장자리는 진공 그리스와 함께 날인 것입니다. 단단히 슬라이드에 그것을 준수하여 엄지와 coverslip의 가장자리 아래로 누르십시오. 진공 그리스는 coverslip의 가장자리 주위에 깔끔하게하고 균일하게 존재하는 경우, 슬라이드가 거꾸로 공촛점 현미경에서 사용하기 위해 충분한 날인 것입니다. </li><li> 또는 공백이 알려진 메쉬 크기의 아가로 오스 크로마 토그래피 수지 (예 : Affi - 젤 블루 젤, 바이오 래드 등)를 사용하여 만들 수 있습니다. coverslip가 배치됩니다 네 개의 모서리 각 현미경 슬라이드에 수지 Pipet 1 μl. 수지의 4 개의 점을 한 가운데에 Pipet 한 조직 섹션 및 장착 미디어. Coverslip. 거꾸로 공촛점 현미경을 사용하는 경우 nailpolish를 사용하여 현미경 슬라이드에 coverslip을 봉쇄. </li></ol></li><li> 공촛점 현미경을 사용하여 스테인드 vibratome 슬라이스의 광학 부분을 구합니다. Corti의 기관 내에 다양한 셀 유형을 수치, 정의 단계 크기 (1.5 및 3 μm의 사이)에서 Z - 스택을 얻습니다. 섹션 핵 염색 (3.8 단계)와 카운터 묻은해야합니다. 이미지 공촛점 이미지 모음 후에 컴퓨터 화면에 검사하실 수 있습니다. 세포 이미지가 Z - 스택을 통해 순차적으로 검사 있으므로 수동으로 핵의 모양과 실종 사건을 관찰 할 계산하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 기둥과 Deiters &#39;세포에 존재하고, 핵 염색 (그림 3A - F)와 counterstained S100 단백질에 대한 스테인드 vibratome 섹션을 통해 대표 공촛점 Z - 스택. 각 패널은 패널, 3 μm의 - 단계에서 촬영한 공촛점 이미지 공촛점 이미지 vibratome 섹션 패널 F vibratome 섹션 내에서 가장 내부 얻은 공촛점 이미지의 표면에 가까운 얻을. Corti의 기관의 형태는 최소한 방해가 나타납니다. 특히, 기둥 세포의 세포질 확장이 깨진되지 않습니다. Z - 스택 (그림의 3A 층)를 통해 기둥 세포 핵의 모양과 실종 사건을 지적하여 모두 내부와 외부 기둥의 휴대폰 번호는 (. - F 번호, 그림 3A 참조) 계산하실 수 있습니다. 공촛점 이미지마다 각각의 셀 타입의 소수으로 인해,이 접근법은 Corti의 기관 내에서 가장 셀 유형을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 손대지 15 주 된, 어른 내부 귀는 귀의 캡슐으로 쌌다. (A) 오른쪽 귀의 캡슐 (괄호)는 두뇌의 제거 후, ​​머리 내부의 밴티지 포인트에서 조회, 두개골으로 쌌다. 앞쪽에는 오른쪽에 있습니다. (B) 손상, 15 주 된 내부 귀 두개골의 절개 후. 왼쪽 내이 (内耳)의 측면 표면은 표시되며 오른쪽 내이 (内耳)의 중간 표면은 볼 수 있습니다. 레이블은 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC), 공동 (달팽이관), 그리고 아야 (난원 창)의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 필 - 어웨이 금형의 중심에 아가로 오스에 포함된 15 주 된 성인에서 (A) 전체 내이 (内耳). 섹션의 대상 비행기가 표시됩니다. 전에 삽입하기 15 주 된, 전체 내이 (内耳)의 (B) 클로즈업 이미지. 막의 미로 더 명확하게 본 수 있도록 주위의 뼈 부분은 거리를 해부했습니다. 측면 세미 원형 운하 (LSC), 앞쪽에 세미 원형 운하 (ASC), 그리고 달팽이관 (공동) (화이트 곡선) 추적하고 있습니다. 달팽이관 (화살촉)의 기초 설정 및 섹션 (점선)의 목적으로 비행기가 표시됩니다. (C) 대표 크로스달팽이관을 통해 S - 절을 참조하십시오. 달팽이 덕트 관통 단면에서 Corti (OC)의 기관이 박스는, 자국 vascularis (SV)는 괄호이며, Reissner의 막은 (RM) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. P21에서 야생 타입 마우스 Corti의 기관. 기둥 세포와 Deiters을 시각화하기 위해 Corti의 S100 항체 묻은 기관을 통해 3 μm의 스텝 크기를 &#39;세포에서 (AF) 선형 공촛점 시리즈. 시리즈의 마지막에 처음부터 내부 및 외부 기둥 세포의 카운트 번호가 있습니다. 약어 : IHC (내부 머리 세포), aIHC (인접 내부 머리 세포), OHC (외부 머리카락 세포), PC (기둥 세포), DC (Deiters &#39;셀).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

동물 실험 위스콘신 IACUC의 메디컬 칼리지에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

immunohistochemistry와 공촛점 이미징 다음 vibratome sectioning의 절차는 최소한의 조직 손상 Corti의 기관의 시각화를위한 수 있습니다. 분명 vibratome 섹션에서 내부 지역에서 가져온 공촛점 이미지는 고정 아티팩트에 의해 제한됩니다 세포 형태 우수 보전을 보여줍니다. 이러한 기둥 세포의 세포질 확장 나누기로 가끔 세포 중단이 (표시되지 않음) 관찰 되었으나 vibratome 섹션의 두 컷 - 표면에 가까운 촬영 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Leica 블레이드 마이크로톰 진동 VT1000S </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자이스 혈구 LSM510 레이저 스캐닝 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 학생 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 낮은 녹는 포인​​트 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> 필 - A - 웨이 포함 금형 </td><td> Polysciences </td><td> 18986 또는 18646A </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 568 염소 안티 - 토끼 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11036 </td><td> 1:1000 희석 </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO - PRO - 1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 그리스 </td><td> 어부 </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi - 젤 블루 젤 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

Corti의 포유류의 기관은 mechanosensory 머리 nonsensory 지원 세포의 높은 주문한 세포 모자이크입니다 (1,2에서 검토)이 세포 모자이크. 시각화는 종종 Corti의 기관 간 sectioned되어 있어야합니다. 특히, 그의 핵 세포와 관련하여 basally 있습니다 nonsensory 기둥과 Deiters &#39;세포는, Corti의 오르간을 교차 sectioning없이 시각 수 없습니다. 그러나, 기둥 및 Deiters &#39;세포의 미세 세포질 프로세스를 포함 Corti의 포유류의 기관의 섬세한 cytoarchitecture는, 표준 immunohistochemical 얼룩 기술과 호환되는 이러한 파라핀과 cryo - sectioning 같은 일상 histological 절차에 의해 보존하기가 어렵습니다. 난 여기 공촛점 현미경 다음 달팽이관 전체 마운트 이러한 vibratome 섹션 immunohistochemical 얼룩의 sectioning vibratome 구성된 단순하고 강력한 절차를 설명합니다. 이 절차는 마우스 사지 봉오리, zebrafish 굿, 간, 췌장, 그리고 마음 (선택한 예제 3-6 참조)를 포함하여 여러 기관의 immunhistochemical 분석 널리 사용되고 있습니다. 또한이 절차는 배아와 성인 생쥐 일곱 모두 Corti의 돌연변이 및 제어 장기 기둥 휴대폰 번호의 이미징 및 quantitificaton 모두 sucessful했다. 이 방법은 그러나, 현재 널리 Corti의 포유 동물 장기를 검사하는 데 사용되지 않습니다. Corti의 성인용 기관의 벌금 cytoarchitecture의 향상된 보존을 제공하고 다양한 세포 유형의 부량 수 있도록 모두이 절차에 대한 가능성을 설명합니다.

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K 조회수.  Medical College of Wisconsin. immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

연구

신경과학

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

절단 및 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면에 대 한 부동 방법

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...