O autor gostaria de reconhecer o uso de Investigação de Crianças Núcleo de Imagem Instituto de microscopia confocal e Jian Zhang para a sugestão de montar seções usando pérolas de agarose. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DC010387.

1. Isolamento e fixação do ouvido interno <ol><li> Para análise dos padrões celulares no órgão de Corti, euthanize adequadamente encenado embriões ou adultos. </li><li> Dissecar a cápsula ótica, contendo a orelha interna membranosa. No mouse, isso pode ser feito facilmente em embriões de embriões (E) 14,5 dias e mais velhos, em que E0.5 é o dia em que um plug vaginal foi detectada. Dissecção da cápsula ótica é realizada primeiro por decapitação e abertura do crânio, na linha média. Retire do cérebro para expor cada orelha (Fig. 1A). Ouvido interno podem ser descascados fora intacta usando uma pinça (como Dumont n º 5, fig. 1B). Se a imagem do órgão de Corti, remoção cuidadosa de todo o tecido neuronal e conjuntivo associados à cápsula ótica não é necessário. </li><li> Fix todo ouvidos internos por imersão em paraformaldeído a 4% (PFA) com balanço delicado a 4 ° C overnight em 1,8 ml com tampa de rosca NUNC Cryo-tubo frascos, ou recipiente de tamanho adequado outros. Solução de PFA deve ser feita fresco em DDH 2 0, em seguida, armazenadas a -20 ° C até ser necessário. </li><li> No dia seguinte, lave o fixador com três mudanças de fosfato 1X solução salina tamponada (PBS). Tecidos podem ser armazenados em 1X PBS estéril por dias até meses até que esteja pronto para processamento. Para o tecido adulto, descalcificar em EDTA 10% (0,27 M) a 4 ° C por 5 dias, seguido de lavagem e armazenamento em 1X PBS. </li></ol> 2. Corte de secções vibratome <ol><li> Prepare 4% baixo ponto de fusão agarose em 1X PBS. Adicionar baixo ponto de fusão de agarose a 1X PBS e microondas até agarose está na solução. Tome cuidado para que a solução não mais de bolha - tirar do microondas periodicamente e agite para misturar. Mantenha a solução em banho-maria a 55 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Utilizando uma pinça, remova ouvido interno de 1X solução PBS e posição na parte inferior de um molde de incorporação Peel-A-Way. Pipeta o excesso 1X PBS a partir do molde. Preencher o molde para cobrir o tecido com bastante líquido 4% baixo ponto de fusão agarose (Fig. 2A). </li><li> Posição do ouvido interno para o seccionamento no plano apropriado. Eu tenho obtido bons cortes transversais do órgão de Corti, aproximando a posição da cápsula ótica como se tivesse sido deixados no local da cabeça e corte no plano transversal. Para E14.5 embriões para adultos, a posição do ouvido interno de forma que ele é visto lateralmente, com o canal semi-circular laterais visíveis (Fig. 2B). Ângulo do ouvido interno de modo que a linha formada pelo lado posterior da cápsula ótica é de aproximadamente em um ângulo de 45 graus do plano previsto para a secção (Fig. 2A, B). Quando a cápsula ótica é visto de modo que a porção dorsal da cápsula ótica está no topo, o giro basal da cóclea deve estar localizado na parte inferior (ponta de seta, fig. 2B) e do canal semi-circular anterior (asc) deve estar no topo (Fig. 2B). </li><li> Agarose será fixado em RT dentro de 30 minutos. Transferência Peel-Away moldes contendo tecido incorporados a 4 ° C até que esteja pronto para a seção. Se o corte será adiada para o dia seguinte, adicione 1X PBS para cobrir a agarose no molde e guarde em uma caixa contendo toalhas de papel úmido embebido em 1X PBS. </li><li> Descascar o molde de plástico. Usando uma lâmina de barbear, cortar uma caixa de agarose contendo o tecido do ouvido interno. Tomar cuidado para garantir que o plano da seção é reta e paralela ao lado oposto do bloco, que será a superfície em que o bloco de agarose é colado para baixo. Desde a agarose não se infiltrar no tecido, não aparar agarose muito de todo o tecido, de modo que o tecido vai ser bem suportada. </li><li> Use supercola para fixar o bloco à superfície de corte. </li><li> Seção de 4-10 mM espessura por vibratome. Salvar seções em um prato da cultura de tecidos cheios de 1X PBS, 0,1% tritonX-100. Uma seção representativa através da espiral coclear é mostrado na figura. 2C. </li><li> Use pinças para dissecar afastado a agarose a partir do tecido. Agarose não penetram no tecido, mas só vai ser preso na superfície externa do ouvido interno. </li><li> Se desejar, piscina agarose sem tecido, seccionadas com uma pipeta com uma abertura de grandes buracos para evitar corte excessivo de tecido. Se estiver executando várias manchas de anticorpos em vários tecidos diferentes, as seções podem ser organizados em um 16 - ou 24 bem-prato de cultura de tecidos. </li></ol> 3. Anticorpo seções vibratome coloração Prosseguir com anticorpos mancha. Secções de processo em todo o monte, de livre flutuação em solução. Abaixo está um exemplo protocolo de coloração de anticorpos para o marcador S100 das células pilar do órgão de Corti, mas o protocolo pode ser usado para qualquer anticorpo. Todas as lavagens são realizadas à temperatura ambiente salvo indicação em contrário. <ol><li> Em um prato de cultura de tecido multi-bem, incubar flutuante seções com balanço delicado em PBT (1X PBS, 1% de soro bovino Triton, albumina 0,1% X-100) por 30 minutos. </li><li> Pipeta off solução antiga e bloco livre-floating seções com balanço delicado em PBT + soro normal de cabra (50 NGS mL / 1 ml PBT) por 30 minutos. </li><li> Pipeta off solução antiga e adicione o anticorpo primário diluído em PBT + NGS (1:200 diluição do S100 em PBT + NGS). Incubar overnight a 4 ° C com balanço delicado. </li><li> Pipeta off solução anticorpo primário. Lavar 3X, 5 mins. com PBT, em seguida, 4X, 30 minutos. com PBT. </li><li> Bloco com PBT + NGS, 30 mins. </li><li> Incube com fluorescente-anticorpo secundário conjugado (criado em cabra) diluídas em PBT + NGS. Incubar overnight a 4 ° C, ou algumas horas, RT, balançando suave. </li><li> Pipeta off solução de anticorpos secundários. Lavar 3X, 5 min., Em seguida, 4X, 30 minutos. com PBT. </li><li> Pipeta off PBT última lavagem e substitua-o por meio aquoso apropriado de montagem contendo um contracorante nuclear. </li></ol> 4. Seções de montagem em lâminas e microscopia confocal Para evitar o esmagamento de espessura com a lamínula, ao montar seções individuais, um espaçador deve ser inserido entre a lâmina de microscópio e as lamelas. Abaixo estão dois métodos alternativos de montagem seções vibratome grossa: <ol><li><ol type="a"><li> Um espaçador pode ser criado por colocar um aro de graxa de vácuo em uma praça ao redor da secção de tecido. Assim, quando, que estabelece as lamelas, as bordas da lamínula serão vedados com graxa de vácuo. Pressione para baixo as bordas da lamínula com o polegar para aderir firmemente-lo para o slide. Se a graxa de vácuo está bem presente e uniforme em torno de todas as bordas da lamínula, a lâmina será selado o suficiente para uso em um microscópio invertido confocal. </li><li> Alternativamente, um espaçador pode ser criado usando agarose resina de cromatografia de malhagem conhecidos (como Gel Azul Affi-Gel, Bio-Rad). Pipete uma de resina para a lâmina de microscópio em cada um dos quatro cantos, onde a lamela será colocado. Pipeta uma secção de tecido e meios de montagem no meio dos quatro pontos de resina. Lamela. Se estiver usando um microscópio invertido confocal, selar a lamínula sobre a lâmina de microscópio utilizando nailpolish. </li></ol></li><li> Obtenção de cortes ópticos das fatias vibratome coradas utilizando microscopia confocal. Para quantificar vários tipos celulares dentro do órgão de Corti, obtenha uma pilha z-passo em um tamanho definido (entre 1,5 e 3 mm). Seções devem ser contra-marcadas com um corante nuclear (passo 3.8). As imagens podem ser examinados em qualquer tela do computador após a coleta de imagem confocal. As células podem ser contadas manualmente ser observado o aparecimento e desaparecimento de núcleos como as imagens são examinados seqüencialmente através do z-stack. </li></ol> 5. Resultados representativos: A confocal representante z pilha através de uma seção vibratome, manchado para a proteína S100, que está presente na coluna e células Deiters &quot;e contrastado com um corante nuclear (Fig. 3A-F). Cada painel é a imagem confocal tomada em 3 m-passos, com o painel A da imagem confocal obtido mais próximo à superfície da seção vibratome e painel de F a imagem confocal obtido mais internamente dentro da seção vibratome. A morfologia do órgão de Corti parece minimamente perturbado. Em particular, as extensões citoplasmáticas das células pilar não estão quebrados. Observando o aparecimento e desaparecimento de núcleos de células pilar através do z-stack (Fig. 3A a 3F), tanto o número de células interiores e exteriores pilar podem ser contadas (ver numeração, Fig. 3A -. F). Devido ao pequeno número de cada tipo de célula por imagem confocal, esta abordagem pode ser usada para contar a maioria dos tipos celulares dentro do órgão de Corti. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Intactas, 15 semanas de idade, adultos ouvidos internos encerrado na cápsula ótica. (A) A cápsula ótica direita (entre colchetes) encerrado no crânio, visto de um ponto de vista de dentro da cabeça, após a remoção do cérebro. Anterior é para a direita. (B) intactas, 15 semanas de idade ouvidos internos após a dissecção do crânio. Superfície lateral da orelha esquerda interior é visível; face medial da orelha direita interior é visível. Etiquetas indicam os locais da anterior canal semi-circular (asc), co (cóclea), e ow (janela oval). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) da orelha interna inteiro de um adulto de 15 semanas de idade, embutido em agarose no centro de um molde de Peel-Away. Plano destina de seção é indicado. (B) imagem Close-up of a 15 semanas de idade, a orelha todo interior antes de incorporação. Uma parte do osso circundante foi dissecada de modo que o labirinto membranoso poderia um visto mais claramente. O canal semi-circular lateral (LSC), canal semi-circular anterior (asc), e cóclea (co) são traçados (curvas de branco). O giro basal da cóclea (seta) eo plano da seção destina (linha tracejada) são indicados. (C) Representante cross-section através da cóclea. Em uma seção transversal através do ducto coclear, o órgão de Corti (oC) é em caixa, da estria vascular (sv) está entre colchetes, e membrana de Reissner (Rm) é indicado. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. O órgão de Corti em um rato do tipo selvagem em P21. (AF) da série Sequential confocal, a um passo células 3 mm de tamanho, através de um órgão S100-anticorpo manchada de Corti para visualizar as células pilar e Deiters &#39;. Contagens de células pilares internas e externas desde o início até o fim da série são contados. Abreviaturas: IHC (células ciliadas), aIHC (células ciliadas adjacentes interior), OHC (células ciliadas externas), PC (células pilar), DC (células Deiters &#39;).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Colégio Médico de Wisconsin IACUC.

O procedimento de corte vibratome, seguido por imagem imunohistoquímica e confocal permite a visualização do órgão de Corti com dano tecidual mínimo. Claramente, as imagens tiradas de confocal regiões do interior da seção vibratome mostram excelente preservação da morfologia celular, que é limitada apenas por artefatos de fixação. Confocal imagens tomadas perto das duas superfícies de corte de uma seção vibratome são muitas vezes indistinguíveis a partir de imagens de regiões internas, embora ocasionais interrupções celulares, tais como quebras nas extensões citoplasmáticas das células pilar foram observados (não mostrado). Esta abordagem é simples, e os itens de equipamento principal - uma máquina vibratome e microscópio confocal - são itens de equipamentos comuns, que são geralmente acessíveis para a maioria dos investigadores. Além disso, essa abordagem pode ser usada para qualquer anticorpo que mostra coloração específica no órgão de Corti. De fato, a principal limitação dessa abordagem é a especificidade do anticorpo, e as modificações para a etapa 3 do presente protocolo pode ser necessárias para assegurar que um anticorpo dada resultará em coloração específica. Em resumo, eu descrevo um procedimento simples, que é generalizável a qualquer anticorpo e garante a preservação máxima e análise da organização celular do órgão de Corti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Leica VT1000S vibratório Lâmina micrótomo </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 laser de microscópio de varredura confocal </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estudante Dumont # 5 Pinça </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure baixo ponto de fusão Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way molde incorporação </td><td> Polysciences </td><td> 18.986 ou 18646A </td><td></td></tr><tr><td> albumina de soro bovino </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> O soro de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 cabra anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> graxa de vácuo </td><td> Pescador </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Gel Azul </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

O órgão de mamíferos de Corti é um mosaico altamente ordenada celular de cabelo e não-sensorial mecanosensorial células de suporte (Revisto em 1,2). Visualização deste mosaico celulares freqüentemente requer que o órgão de Corti é transversa. Em particular, o pilar não-sensorial e células Deiters &#39;, cujos núcleos estão localizados basally com relação às células ciliadas, não pode ser visualizada sem cross-seccionando o órgão de Corti. No entanto, a citoarquitetura delicada do órgão de Corti de mamíferos, incluindo os processos de multa citoplasmática do pilar e células Deiters &#39;, é difícil de preservar pela rotina de procedimentos histológicos, tais como parafina e crio-seccionamento, que são compatíveis com as técnicas de coloração imuno-histoquímica. Aqui eu descrevo um procedimento simples e robusta consistindo de vibratome seccionamento da cóclea, coloração imuno-histoquímica destas seções vibratome no monte todo, seguido por microscopia confocal. Este procedimento tem sido utilizado amplamente para a análise immunhistochemical de múltiplos órgãos, incluindo o broto de membro mouse, gut zebrafish, fígado, pâncreas e coração (ver 3-6 para exemplos seleccionados). Além disso, este procedimento foi bem sucedida para ambos imagem e quantitificaton do número de células em órgãos pilar mutante e controle de Corti em ambos os embriões e camundongos adultos 7. Este método, no entanto, atualmente não é amplamente usado para examinar o órgão de mamíferos de Corti. O potencial para este procedimento para tanto proporcionar a preservação do maior bem citoarquitetura do órgão de Corti e adultos permitem a quantificação de vários tipos celulares é descrito.

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.

Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K visualizações.  Medical College of Wisconsin. Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

O corte e o método flutuante para tecido parafina para seccionamento

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...