著者は、アガロースビーズを使用してセクションをマウントするために提案するための共焦点顕微鏡と博士建張のための子供の研究所イメージングコアの使用を承認したいと思います。この作品は、NIHの助成金DC010387によって賄われていた。

1。内側の耳の単離と固定<ol><li>コルチ器官の細胞のパターニングの分析については、安楽死は、適切に胚、大人を上演した。 </li><li>膜性内耳を含む、耳嚢をばらばらにする。マウスでは、これは簡単に（E）14.5日と古いが、これでE0.5は膣栓が検出された日である胚における胚で行うことができます。耳嚢の解剖は、正中線で断頭し、頭蓋骨の開放が最初に実行されます。それぞれの耳を（図1A）を公開するために脳を取り外します。内側の耳はそのまま使用して鉗子を（そのようなデュモン＃5、図1Bのような）を砲撃することができます。イメージングコルチ器官の場合、耳嚢に関連するすべての神経と結合組織を注意深く除去する必要はありません。 </li><li> 4％4での穏やかな振盪パラホルムアルデヒド（PFA）° C一晩1.8ミリリットルのスクリューキャップNUNCクライオチューブバイアル、または他の適切なサイズの容器に浸漬することによって全体の内側の耳のを修正。 PFAのソリューションは、必要になるまでその後-20℃で保存し、DDH 2 0で新鮮なされるべきである。 </li><li>翌日、1Xリン酸の三つの変更を固定液を洗い流す緩衝食塩水（PBS）。組織は、処理の準備が整うまで数ヶ月に数日のために滅菌1X PBSにまで保存することができます。成体組織の場合は、4で10％EDTA（0.27 M）でカルシウムが溶け出す° 1X PBSで洗浄し、ストレージに続いて5日間Cを、。 </li></ol> 2。ビブラトームセクションカッティング<ol><li> 1X PBSで4％低融点アガロースを準備します。アガロースが溶液になるまで、1X PBSと電子レンジに低融点アガロースを追加。解決策は、オーバーバブルしないことに注意してください - 定期的に電子レンジから取り出して、渦が混在する。使用するまで55 ° Cの水浴中で解決してください。 </li><li>鉗子を使用して、1X PBS溶液とピール- A -ウェイ埋め込み型の下部にある位置から内耳を削除します。金型から離れてピペットで余分な1X PBSを。液体4パーセント低融点アガロース（図2A）をたっぷり使って組織をカバーするために金型を埋める。 </li><li>適切な平面でセクショニングの内耳を置きます。私はそれが頭の中でその場に残されていたかのように耳嚢の位置を近似し、横断面の切片によってコルチ器官の良い断面を取得しています。それは目に見える側面の半円形の運河（図2B）と、横方向に表示されるように大人、位置内耳をするE14.5胚のための。耳嚢の後側が作る折れ線は、切片の意図した平面（図2A、B）から45度の角度で約であるように。内耳の角度に耳嚢は（ASC）耳嚢の背側部分が最上部にある、蝸牛の基底回転が下（矢印、図2B）および前部の半円形の運河に設置されるべきであるようにしてください表示されている場合上部（図2B）になります。 </li><li>アガロースは30分以内、RTで設定されます。埋組織から4 ° Cのセクションへの準備ができるまでを含むピールアウェイ金型を転送する。 1X PBSに浸した湿ったペーパータオルを含むボックスの金型とストア内のアガロースをカバーするために1X PBSを追加、次の日まで延期されます切片場合。 </li><li>プラスチック金型離れて皮をむき。カミソリの刃を使用して、内耳の組織を含むアガロースボックスを切り取る。セクションの面ではストレートとアガロースブ​​ロックが下に接着されている面となるブロックの反対側に、平行になるように注意してください。アガロースが組織に浸潤していないので、組織がしっかりサポートされるように、組織の周りからあまりにも多くのアガロースをトリムしないでください。 </li><li>切断面にブロックを取り付けるために瞬間接着剤を使用してください。 </li><li>ビブラトームは40〜100μmの厚さでセクション。 1X PBS、0.1％TritonX - 100を充填した組織培養皿内のセクションを保存します。蝸牛のスパイラルを通じて代表的なセクションを図に示します。 2C。 </li><li>組織からアガロースを離れて分析する鉗子を使用してください。アガロースは、組織に浸透しませんが、単に内耳の外表面に貼着される。 </li><li>組織の過度の剪断を防ぐために、大ホールの開口部にピペットを用いて必要に応じて、プールアガロースフリー、組織切片。または24ウェル組織培養皿 - 複数の異なる組織の複数の抗体染色を行う場合、セクションは16に整理することができます。 </li></ol> 3。抗体染色のビブラトームのセクション抗体染色に進みます。溶液中でのホールマウント、フリーフローティングのプロセスのセクション。下記のコルチ器官の柱細胞のS100マーカーの例の抗体染色のプロトコルですが、プロトコルは任意の抗体のために使用することができます。特に記載がない限り、すべての洗浄は室温で実施しています。 <ol><li>マルチウェル組織培養皿では、30分間PBTの中で穏やかに振盪（1X PBS、1％ウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX - 100）とフリーフローティングのセクションをインキュベートする。 </li><li>従来のソリューションとブロック自由FLオフピペットPBTの中で穏やかに振盪+ 30分のための正常ヤギ血清（50μlのNGS / 1ミリリットルPBT）を持つセクションを浮動少数。 </li><li>古いソリューションオフピペットとPBT + NGS（PBT + NGSのS100の1:200希釈）で希釈した一次抗体を加える。 4℃で一晩インキュベート℃で緩やかに振盪した。 </li><li>一次抗体溶液オフピペット。 、5分3X洗う。 PBTと、その後4X、30分。 PBTと。 </li><li> PBT + NGSとブロック、30分。 </li><li> PBT + NGSで希釈した蛍光標識二次抗体（ヤギで提起された）でインキュベートする。 4℃で一晩インキュベート° C、または数時間、RT、穏やかな揺れ。 </li><li>二次抗体溶液オフピペット。 、5分3X洗う。、その後4X、30分。 PBTと。 </li><li>最後のPBTオフピペットは核対比を含む適切な水性封入剤で洗浄し、交換してください。 </li></ol> 4。スライドおよび共焦点顕微鏡で取り付け部カバーガラスと厚いセクションを粉砕しないようにするには、個々のセクションをマウントする際に、スペーサーは、顕微鏡スライドとカバースリップの間に挿入されている必要があります。下記の取付厚いビブラトームのセクションの2つの代替方法は、以下のとおりです。 <ol><li><ol type="a"><li>スペーサーは、組織切片の周りの広場に真空グリースのリムを配置することによって作成することができます。このように、カバースリップを敷設するときに、カバースリップの端は真空グリースで密封されます。しっかりとスライド上に付着するために親指でカバースリップの端を押し下げます。真空グリースはカバースリップのすべてのエッジの周りにきれいに、均一に存在する場合、スライドは、倒立型共焦点顕微鏡で使用するために十分に密封されます。 </li><li>また、スペーサーは、既知のメッシュサイズのアガロースクロマトグラフィー樹脂（例えば、アフィ - ゲルブルージェルとして、Bio - Rad）を使用して作成することができます。ピペットでカバースリップが配置される四隅のそれぞれの顕微鏡スライド上に樹脂を1μl。樹脂の4ドットの真ん中にピペットつの組織のセクションと取り付けメディア。カバースリップ。倒立型共焦点顕微鏡を使用している場合、nailpolishを使用して、顕微鏡のスライドにカバースリップをシール。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡を用いて染色したビブラトームスライスの光学セクションを取得します。コルチ器官内のさまざまな種類の細胞を定量化するために、定義されたステップサイズ（1.5〜3μmの間）でのz -スタックを取得する。のセクションでは、核染料（ステップ3.8）で対比染色してください。画像は、共焦点画像のコレクションの後に任意のコンピュータの画面上で調べることができます。細胞は、画像はZ -スタックを順次検討しているように手動で核の出現と消失を観察することが数えることができる。 </li></ol> 5。代表的な結果： ビブラトームセクションを通じて代表的な共焦点Z -スタックは、柱とダイテルス&quot;細胞内に存在するS100タンパク質、のために染色し、核染色（図3A - F）で対比。各パネルはパネルで、3μmのステップで取得された共焦点画像である共焦点画像ビブラトームセクションとパネルのFビブラトームセクション内で最も内部的に取得共焦点像の表面に最も近い得た。コルチ器官の形態は、低侵襲中断されます。特に、柱細胞の細胞質の拡張子が壊れていない。 Z -スタック（図3A 3Fへ）を介して柱の細胞核の出現と消失に注目することによって、両方の内側と外側の柱の細胞数は、（。 - F番号、図3Aを参照）をカウントすることができます。共焦点画像ごとの各細胞型の数が少ないため、このアプローチは、コルチ器官の中で最も細胞の種類をカウントするために使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="図1"/> 図1は、無傷の、15週齢、大人内耳は耳のカプセルに封入した。 （A）の右耳嚢は、（括弧）脳の除去後、ヘッド内部の視点から見て、頭蓋骨に収められた。前方には、右側にあります。 （B）はそのまま、15週齢の内側の耳の頭蓋骨から郭清後。左内耳の側面が見える、右内耳の内側面が見えるようになります。ラベルは前の半円形の運河（ASC）、CO（蝸牛）、およびOW（卵円窓）の位置を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="図2"/> 図2（）ピールアウェイ型の中央にアガロースに埋め込 ​​まれている15週齢の成体、より全体内耳。セクションの意図する面が表示されます。前の埋め込み〜15週齢、全体内耳の（B）クローズアップ画像。膜迷路がより明確に見ることができるように周囲の骨の部分が離れて解剖されています。横方向の半円形の運河（LSC）、前半円形の運河（ASC）、および蝸牛（CO）（白のカーブ）がトレースされます。蝸牛の基底回転（矢印）とセクションの意図された平面（破線）が示されている。 （C）代表CROは蝸牛を通しての断面。蝸牛管を通じて1断面では、コルチ器官（OC）がボックス化されると、血管条（SV）は、括弧で、ライスナーの膜は、（RM）が示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。P21において、野生型マウスにおけるコルチ器官。 （AF）柱細胞とダイテルス&quot;細胞を可視化するコルチS100抗体染色臓器3〜μmのステップサイズでのシーケンシャル共焦点シリーズ、、。シリーズの開始から終了までの内側と外側の柱細胞のカウントは番号が付けられています。略語：IHC（内有毛細胞）、aIHC（隣接する内側の有毛細胞）、OHC（外有毛細胞）、PC（柱のセル）、DC（ディーターズ&quot;セル）。

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

動物実験は、ウィスコンシンIACUCの医科大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

免疫組織化学と共焦点イメージングが続くビブラトーム切片、の手順では、最小限の組織損傷とコルチ器官の可視化が可能になります。明らかに、ビブラトームセクションで内部の地域から採取した共焦点画像は固定のアーティファクトによって制限される細胞形態の優れた保全を示しています。このような柱細胞の細胞質の拡張子の区切りなど、時折携帯電話の中断は、（図示せず）が観?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ライカは、ブレードミクロトームを振動VT1000S </td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイスLSM510レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>学生デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91150〜20 </td><td></td></tr><tr><td>超高純度低融点アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td>ピールウェイ埋め込み型</td><td> Polysciences </td><td> 18986または18646A </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td>ダコ</td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 568ヤギ抗ウサギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> - 11036 </td><td> 1:1000希釈</td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトル研究所</td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO - PRO - 1 </td><td>インビトロジェン</td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>フィッシャー</td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td>アッフィのジェルブルージェル</td><td> Bio - Rad社</td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

コルチ器の哺乳類の器官はmechanosensory髪とnonsensory支持細胞の高度に秩序化された細胞のモザイクです。 この細胞のモザイクの（1,2でレビュー）。可視化は、多くの場合、コルチ器官は横断面であることが必要です。特に、その核有毛細胞に関してbasally配置されているnonsensory柱とダイテルス&quot;細胞は、、コルチ器官を横断切片のない視覚化できません。しかし、柱とダイテルス&quot;細胞の微細な細胞質プロセスを含むコルチの哺乳類器官のデリケートな細胞構築は、標準的な免疫組織化学的染色技術と互換性のあるようなパラフィンおよび凍結切片のようなルーチン組織学的手続きによって維持することは困難です。 ここでは、共焦点顕微鏡に続く蝸牛、全体のマウントにこれらのビブラトーム切片の免疫組織化学染色の切片ビブラトームで構成されるシンプルかつ堅牢な手順を説明します。この手順は、マウスの肢芽、ゼブラフィッシュの腸、肝臓、膵臓、および心臓（選択された例については3-6を参照）を含む複数の臓器のimmunhistochemical解析に広く用いられている。さらに、この手順では、胚および成体マウス7の両方におけるコルチ器の変異体と制御器官における柱の細胞数のイメージングとquantitificatonの両方の判定に成功した。このメソッドは、しかし、現在広くコルチの哺乳類の器官を調べるために使用されていません。この手順の両方コルチ成人器官の微細な細胞構築の強化された保護を提供し、種々の細胞型の定量化を可能にするために可能性が説明されています。

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

免疫組織化学と共焦点顕微鏡に続くコルチ器官を、切片ビブラトームの簡単な手順が説明されています。この手順では、コルチ器の哺乳類器官の微細な細胞構築の改良保全を可能にし、その結果、細胞の種類を正確に定量することができます。

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.1K ビュー.  Medical College of Wisconsin. 免疫組織化学と共焦点顕微鏡に続くコルチ器官を、切片ビブラトームの簡単な手順が説明されています。この手順では、コルチ器の哺乳類器官の微細な細胞構築の改良保全を可能にし、その結果、細胞の種類を正確に定量することができます。

ビデオ: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

神経科学

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

ビブラトームセクショニングマウス網膜は、感光体文化を準備する

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

平坦化された哺乳類の皮質皮質モジュールの可視化

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...