فإن الكاتب يعترف أن استخدام الأطفال الأساسية للأبحاث معهد التصوير المجهري مبائر والدكتور تشانغ جيان لاقتراح تحميل المقاطع باستخدام الخرز agarose. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DC010387.

1. العزلة والتثبيت الداخلي للآذان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الزخرفة الخلوية في جهاز كورتي ، والموت ببطء نظموا مناسب الأجنة أو البالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأذن خارج الكبسولة ، التي تحتوي على الأذن الغشائي الداخلي. في الماوس ، يمكن القيام به بسهولة على هذه الأجنة في الجنينية (E) في اليوم 14.5 وكبار السن ، والذي هو اليوم E0.5 التي تم الكشف عن المكونات المهبلية. ويتم إنجاز تشريح الأذن الكبسولة الاولى قطع الرأس وفتح الجمجمة في خط الوسط. إزالة المخ لفضح كل أذن (الشكل 1A). يمكن آذان الداخلية قصفت بها سليمة باستخدام ملقط (مثل دومون # 5 ، الشكل 1B). إذا كان التصوير جهاز كورتي ، وإزالة متأنية لجميع الأنسجة الضامة والعصبية المرتبطة كبسولة أذني ليست ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأذن الداخلية بأكملها من قبل الانغماس في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) مع هزاز لطيف في 4 درجات مئوية خلال الليل في 1.8 مل المسمار وتوج قارورة كرو أنبوب نونك ، أو غيرها من حاوية بحجم مناسب. وينبغي بذل PFA حل العذبة في DDH 2 0 ، ثم تخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وغسل خارج تثبيتي ، مع ثلاثة تغييرات من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). يمكن تخزينها في الأنسجة 1X PBS العقيمة لعدة أيام قد تصل إلى شهور حتى جاهزة للمعالجة. للأنسجة البالغين ، يزيل الكلس في EDTA 10 ٪ (0.27 م) في 4 درجات مئوية لمدة 5 أيام ، تليها الشطف وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol> 2. قطع المقاطع vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد قليلة 4 ٪ نقطة ذوبان agarose في برنامج تلفزيوني 1X. إضافة نقطة انصهار منخفضة agarose لبرنامج تلفزيوني 1X والميكروويف حتى agarose في الحل. الحرص على أن الحل ليس أكثر من فقاعة -- تتخذ للخروج من دوامة الميكروويف دوريا وإلى المزيج. الحل في الحفاظ على درجة حرارة 55 مئوية حمام ماء حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط ، إزالة الأذن الداخلية من حل PBS 1X والموقف في قاع القالب تضمين التقشير - A - واي. الماصة بعيدا 1X PBS أي فائض من العفن. ملء القالب لتغطية الأنسجة مع الكثير من 4 ٪ قليلة السائل نقطة الانصهار agarose (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف الأذن الداخلية لsectioning في الطائرة المناسبة. وقد حصلت على مقاطع عرضية جيدة من الجهاز كورتي التي تقارب موقف كبسولة أذني كما لو كان قد تركها في موقعها الأصلي في الرأس وsectioning في الطائرة عرضية. لE14.5 الأجنة للبالغين ، والموقف في الأذن الداخلية بحيث يتم عرضها أفقيا ، مع القناة شبه الدائرية الجانبية مرئية (الشكل 2B). زاوية الأذن الداخلية بحيث شكلت الخط من الجانب الخلفي من الكبسولة أذني تقريبا بزاوية 45 درجة من الطائرة المقصود من sectioning (الشكل 2A ، B). عند عرض كبسولة أذني بحيث الجزء الظهري من الكبسولة أذني في أعلى ، يجب أن يكون موجودا بدوره القاعدية من القوقعة في أسفل (رأس السهم ، الشكل 2B) ويجب الأمامي شبه دائرية قناة (ASC) يكون على رأس (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف Agarose وضعت في غضون 30 دقيقة RT. نقل التقشير بعيدا قوالب جزءا لا يتجزأ من النسيج تحتوي على 4 درجات مئوية حتى جاهزة للمقطع. إذا كان سيتم وضع sectioning قبالة حتى اليوم التالي ، إضافة 1X PBS لتغطية agarose في قالب وتخزينها في مربع تحتوي على مناشف ورقية رطبة غارقة في برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا قالب من البلاستيك. باستخدام شفرة حلاقة ، قطع مربع تحتوي على أنسجة agarose الأذن الداخلية. الحرص على ضمان ان الطائرة من الباب مستقيم مواز وعلى الجانب الآخر من كتلة ، والتي سوف يكون السطح الذي يتم لصقها كتلة agarose أسفل. منذ agarose لا اختراق الأنسجة ، لا تقليم agarose الكثير من أنحاء الأنسجة ، بحيث سيكون جيدا الأنسجة التي تدعمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام superglue تعلق الكتلة إلى سطح القطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المقطع سمك 4-10 ميكرون بواسطة vibratome. حفظ المقاطع في صحن الأنسجة الثقافة مليئة 1X PBS ، 0.1 ٪ TritonX - 100. ويرد ممثل القسم من خلال القوقعة الحلزونية في الشكل. 2C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لتشريح بعيدا agarose من الأنسجة. Agarose سوف لا تتمكن من اختراق الأنسجة ، ولكن لن يكون مجرد عالقة على السطح الخارجي من الأذن الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك ، تجمع agarose خالية من الأنسجة مقطوع باستخدام الماصة مع فتحة كبيرة حفرة لمنع تقطيع المفرط للنسيج. إذا كان أداء بقع متعددة على الضد أنسجة مختلفة متعددة ، يمكن تنظيم المقاطع في 16 -- أو 24 طبق جيدا زراعة الأنسجة. </li></ol> 3. أقسام الضد تلطيخ vibratome المضي قدما في الأضداد وصمة عار. المقاطع في جبل لعملية برمتها ، التعويم الحر في الحل. وفيما يلي تلوين الأجسام المضادة للبروتوكول سبيل المثال علامة S100 من خلايا عمود الجهاز كورتي ، ولكن يمكن استخدام أي بروتوكول للجسم. وتجرى جميع يغسل في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في طبق نسيج الثقافة المتعددة أيضا ، احتضان التعويم الحر المقاطع مع هزاز لطيف في PBT (1X PBS ، الأبقار مصل الزلال 1 ٪ ، 0.1 ٪ تريتون X - 100) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قبالة الحل القديمة وكتلة حرة - FLoating المقاطع مع هزاز لطيف في + PBT مصل الماعز العادي (50 م و ع ميكرولتر / 1 مل PBT) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قبالة الحل القديم وإضافة الضد الأولية مخففة في PBT NGS + (1:200 تخفيف S100 في PBT NGS +). يحضن بين عشية وضحاها في 4 مع هزاز لطيف درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قبالة الأضداد الحل الأساسي. غسل 3X ، و 5 دقائق. مع PBT ، ثم 4X ، 30 دقيقة. مع PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة مع PBT NGS + و 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently - مترافق (التي أثيرت في الماعز) المخفف في PBT NGS +. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، أو بضع ساعات ، RT ، هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قبالة حل الضد الثانوية. غسل 3X ، و 5 دقائق. ثم 4X ، 30 دقيقة. مع PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قبالة PBT مشاركة يغسل واستبدالها مع الوسط المائي المناسبة المتصاعدة التي تحتوي على ملون مباين النووية. </li></ol> 4. تصاعد المقاطع على الشرائح المجهرية ومبائر لمنع تكسير أبواب سميكة مع ساترة ، وعندما تصاعد المقاطع الفردية ، لا بد من إدراج فاصل بين شريحة المجهر وساترة ل. وأدناه طريقتين بديلة لتركيب أبواب سميكة vibratome : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إنشاء هل من خلال وضع حافة الشحوم فراغ في مربع حول القسم الأنسجة. وهكذا ، عندما إرساء ساترة ، سيتم اغلاق حواف ساترة مع الشحوم فراغ. اضغط لأسفل على حواف ساترة بإبهامك التمسك بحزم وضعها على الشريحة. إذا كانت الشحوم الفراغ الحالي بدقة وبشكل موحد في جميع أنحاء جميع حواف ساترة ، سيتم اغلاق الشريحة بما فيه الكفاية لاستخدامها في المجهر an مبائر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء باستخدام agarose هل اللوني راتنج من حجم شبكة المعروفة (مثل جل الأزرق افى جل بيو راد). الماصة 1 ميكرولتر من الراتنج على الشريحة المجهر في كل من الزوايا الأربع ، حيث سيتم وضع ساترة. قسم الأنسجة الماصة واحد وسائل الاعلام المتزايدة في منتصف النقاط الأربع الراتنج. ساترة. إذا باستخدام مجهر مقلوب مبائر ، ختم ساترة على الشريحة باستخدام المجهر nailpolish. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المقاطع البصرية من شرائح vibratome الملون باستخدام المجهر مبائر. لتحديد أنواع الخلايا المختلفة داخل جهاز كورتي ، والحصول على ض المكدس في حجم خطوة محددة (بين 1.5 ميكرون و3). وينبغي أن أبواب مكافحة ملطخة صبغة النووي (الخطوة 3.8). يمكن فحص الصور على أي شاشة الكمبيوتر بعد جمع الصور مبائر. يمكن عدها يدويا الخلايا تكون مراقبة ظهور واختفاء النوى كما يتم فحص الصور بالتتابع من خلال Z - المكدس. </li></ol> 5. ممثل النتائج : A - Z مبائر ممثل كومة من خلال القسم vibratome ملون للبروتين S100 ، التي هي موجودة في عمود والخلايا دايترس ، وcounterstained مع صبغة نووية (الشكل 3A - F). كل لوحة هي صورة مبائر التي اتخذت في 3 ميكرومتر الخطوات ، مع لوحة وصورة مبائر الحصول على أقرب إلى السطح من المقطع vibratome ولوحة F صورة مبائر الحصول على معظم داخليا داخل القسم vibratome. يظهر الحد الأدنى من تعطل الجهاز مورفولوجية كورتي. على وجه الخصوص ، ليست مقطوعة ملحقات هيولي من خلايا العمود. بالإشارة إلى ظهور واختفاء نوى الخلايا من خلال عمود ض المكدس (الشكل 3A إلى 3F) ، يمكن عدها سواء خلية عمود الداخلي والخارجي رقم (انظر الترقيم ، والشكل 3A -- واو). نظرا لعدد صغير من كل نوع من الخلايا في صورة مبائر ، يمكن استخدام هذا الأسلوب لحساب معظم أنواع الخلايا في جهاز كورتي. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. سليمة ، والمغطى آذان الداخلية البالغين 15 أسبوعا من العمر ، في كبسولة أذني. (A) المغطى الكبسولة أذني اليمنى (بين قوسين) في الجمجمة ، وينظر إليها من وجهة نظر من داخل الرأس ، وبعد إزالة المخ. الأمامي إلى يمين. (ب) سليمة ، ومدتها 15 أسبوعا من العمر بعد تشريح الأذن الداخلية من الجمجمة. السطح الوحشي للالأذن الداخلية اليسار مرئيا ؛ السطح الإنسي من الأذن الداخلية الحق مرئيا. تسميات تشير إلى مواقع القناة شبه الدائرية الأمامي (ASC) ، وشارك (القوقعة) ، وآه (النافذة البيضوية). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : (أ) الأذن الداخلية من الجامعة البالغين 15 أسبوعا من العمر ، جزءا لا يتجزأ من agarose في وسط قالب التقشير بعيدا. يشار الطائرة المقصود من المقطع. (ب) عن قرب صورة الأذن 15 أسبوعا من العمر ، كلها داخلية قبل التضمين. وقد تم تشريح جزء من العظام المحيطة بها بعيدا حتى التيه الغشائي يمكن أن ينظر إليها أكثر وضوحا. وتتبع الجانبي نصف دائري قناة (LSC) ، الأمامي شبه دائرية قناة (ASC) ، والقوقعة (شارك) (منحنيات بيضاء). وأشار بدوره القاعدية من القوقعة (رأس السهم) وطائرة المقصود من القسم (خط متقطع). (C) الممثل كروسS - القسم من خلال القوقعة. في مقطع واحد ، عبر من خلال قناة القوقعية ، الجهاز كورتي (درجة مئوية) هو محاصر ، وعائي السطر (اس) هو بين قوسين ، ويشار غشاء رايسنر (روم). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3 ، وجهاز كورتي في الماوس من النوع البري في P21. (AF) سلسلة متعاقبة مبائر ، في خطوة الخلايا 3 ميكرومتر الحجم ، عن طريق جهاز الأضداد الملطخة S100 كورتي لتصور خلايا عمود ودايترس. يتم ترقيم بحساب الخلايا عمود الداخلي والخارجي من البداية إلى نهاية السلسلة. الاختصارات : IHC (الخلايا الداخلية الشعر) ، aIHC (الخلية المجاورة الشعر الداخلي) ، OHC (الخلية الخارجي الشعر) ، PC (خلية عمود) ، DC (خلية دايترس &#39;).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها كلية الطب في ويسكونسن IACUC.

إجراءات sectioning vibratome ، تليها التصوير المناعية ومبائر يسمح التصور من جهاز كورتي مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة. بوضوح ، وصور مأخوذة من مبائر المناطق الداخلية في المقطع vibratome تظهر الحفاظ ممتازة من التشكل الخلوية التي يقتصر فقط التحف التثبيت. صور مبائر المتخذة على مقربة م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> ايكا VT1000S بالاهتزاز بليد مشراح </td><td> لايكا </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM510 زايس مجهر المسح بالليزر مبائر </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> طالب دومون # 5 الملقط </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> عالى النقاء قليلة نقطة الانصهار Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> قشر - A - طريق تضمين القالب </td><td> Polysciences </td><td> 18986 أو 18646A </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> جاكسون ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الماعز </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> داكو </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 568 الماعز المضادة للأرنب مفتش </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11036 </td><td> 1:1000 تخفيف </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO - PRO - 1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> فراغ الشحوم </td><td> الصياد </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> افى جل جل الأزرق </td><td> الحيوي راد </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

الجهاز الثدييات كورتي هو أمر غاية الخلوية فسيفساء من الشعر mechanosensory nonsensory والخلايا المساندة (إعادة النظر في 1،2). التصور من هذه الفسيفساء الخلوية وغالبا ما يتطلب أن جهاز كورتي هو عبر مقطوع. على وجه الخصوص ، يمكن للعمود nonsensory دايترس والخلايا &#39;، التي تقع النواة basally فيما يتعلق خلايا الشعر ، لا يمكن تصور دون sectioning عبر جهاز كورتي. ومع ذلك ، فإن التهندس الخلوي الحساسة للجهاز كورتي الثدييات ، بما في ذلك العمليات السيتوبلازمية الدقيقة للعمود والخلايا دايترس &#39;، من الصعب الحفاظ على النسيجية من خلال إجراءات روتينية مثل البارافين والبرد sectioning ، والتي تتوافق مع معيار تقنيات تلطيخ المناعى. هنا أصف إجراء بسيط وقوي يتألف من vibratome sectioning من القوقعة ، وتلطيخ المناعى من هذه المقاطع vibratome في جبل بأكمله ، تليها المجهري متحد البؤر. وقد استخدم هذا الإجراء على نطاق واسع لتحليل immunhistochemical أجهزة متعددة ، بما في ذلك الماوس برعم الطرف ، الزرد الأمعاء والكبد والبنكرياس ، والقلب (انظر 3-6 لأمثلة مختارة). بالإضافة إلى ذلك ، كان هذا الإجراء سوسسفول] لكل من التصوير وquantitificaton من عدد الخلايا في العمود أجهزة متحولة والتحكم في كورتي في كل من الأجنة والبالغين 7 الفئران. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، لا يستخدم حاليا على نطاق واسع لفحص الجهاز من الثدييات كورتي. يوصف المحتملة لهذا الإجراء لتوفير الحفاظ على حد سواء المعزز للالتهندس الخلوي غرامة الجهاز الكبار كورتي ، والسماح للالكمي لمختلف أنواع الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

يوصف إجراء بسيط من vibratome sectioning الجهاز كورتي ، تليها المجهري ومبائر المناعية. يسمح هذا الإجراء للحفاظ على تحسن من التهندس الخلوي غرامة الجهاز الثدييات كورتي ، ويسمح بالتالي لتقدير دقيق لأنواع الخلايا.

Vibratome Sectioning للحفاظ على المحسن من التهندس الخلوي للجهاز الثدييات كورتي

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.1K Views.  Medical College of Wisconsin. يوصف إجراء بسيط من vibratome sectioning الجهاز كورتي ، تليها المجهري ومبائر المناعية. يسمح هذا الإجراء للحفاظ على تحسن من التهندس الخلوي غرامة الجهاز الثدييات كورتي ، ويسمح بالتالي لتقدير دقيق لأنواع الخلايا.

Video: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

أساليب التلاعب التجريبية بعد Transection العصب البصري الثدييات في الجهاز العصبي المركزي

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

الردود تصوير الخلايا العصبية في الجهاز الاستعدادات لقطات للالميكعي تعرب عن جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

التسامي DAN مصفوفة للكشف والتخيل من Gangliosides في الجرذ أنسجة المخ لMALDI التصوير قياس الطيف الكتلي

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

التصور للوحدات القشرية في الأرض كورتيسيس الثدييات

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

أسلوب حجمي للتحديد الكمي للمخ بالتشنج في نموذج موريني نزيف تحت العنكبوتية

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...