L&#39;autore ringrazia vivamente l&#39;uso di Ricerca dei Bambini Nucleo Istituto Imaging per la microscopia confocale e il dottor Zhang Jian per il suggerimento di montare sezioni utilizzando perline agarosio. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere DC010387.

1. Isolamento e fissazione interna delle orecchie <ol><li> Per l&#39;analisi di patterning cellulare in dell&#39;organo del Corti, eutanasia opportunamente allestita embrioni o gli adulti. </li><li> Sezionare la capsula otica, che contiene l&#39;orecchio interno membranoso. Nel topo, questo può essere fatto facilmente su embrioni a embrionale (E) giorno 14.5 e anziani, in cui E0.5 è il giorno in cui è stata rilevata una spina vaginale. Dissezione della capsula otica avviene prima per decapitazione e l&#39;apertura del cranio sulla linea mediana. Rimuovere cervello per esporre ciascun orecchio (Fig. 1A). Orecchio interno può essere sborsato intatto pinze utilizzando (come Dumont # 5, fig. 1B). Se l&#39;imaging dell&#39;organo del Corti, la rimozione accurata di tutto il tessuto neuronale e connettivo associata alla capsula otica non è necessario. </li><li> Fissare tutta orecchi interiori per immersione in 4% paraformaldeide (PFA) con dondolo dolci a 4 ° C per una notte in 1,8 ml con tappo a vite NUNC Cryo-tubo fiale o altri contenitori di dimensioni appropriate. PFA soluzione dovrebbe essere fresca in DDH 2 0, poi conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Il giorno dopo, lavare il fissativo con tre cambi di fosfato 1X soluzione salina tamponata (PBS). Tessuti possono essere memorizzati in sterili PBS 1X per giorni fino a mesi fino al momento per l&#39;elaborazione. Per i tessuti adulti, decalcificare nel 10% EDTA (0,27 M) a 4 ° C per 5 giorni, seguito da risciacquo e conservazione in PBS 1X. </li></ol> 2. Il taglio delle sezioni vibratome <ol><li> Preparare il 4% di agarosio a basso punto di fusione in PBS 1X. Aggiungi a basso punto di fusione di agarosio al PBS 1X e forno a microonde fino agarosio è in soluzione. Fare attenzione che la soluzione non bolla oltre - tolga dal forno a microonde periodicamente e mescolare. Conservare la soluzione in un bagno d&#39;acqua ° 55 C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere orecchio interno dalla soluzione PBS 1X e la posizione sul fondo di una Peel-A-Way stampo incorporamento. Pipettare via qualsiasi eccesso di PBS 1X dallo stampo. Riempire stampi per coprire il tessuto con abbondanza di liquido 4% agarosio a basso punto di fusione (Fig. 2A). </li><li> Posizionare l&#39;orecchio interno di sezionamento nel piano adeguato. Io ho ottenuto buoni sezioni dell&#39;organo del Corti da approssimare la posizione della capsula otica come se fosse stato lasciato in situ nella testa e sezionamento nel piano trasversale. Per E14.5 embrioni agli adulti, la posizione l&#39;orecchio interno in modo che sia visto lateralmente, con il laterale semicircolare canale visibile (Fig. 2B). Angolo dell&#39;orecchio interno in modo che la linea formata dalla parte posteriore della capsula otica è pari a circa ad un angolo di 45 gradi rispetto al piano previsto di sezionamento (Fig. 2A, B). Quando la capsula otica è vista in modo che la parte dorsale della capsula otica è al top, il giro basale della coclea deve essere posizionato in basso (punta di freccia, fig. 2B) e l&#39;anteriore semicircolare canale (asc) dovrebbe essere in cima (Fig. 2B). </li><li> Agarosio sarà fissato a RT entro 30 minuti. Trasferimento Peel-Away di scarto contenenti tessuto integrato a 4 ° C fino al momento di sezione. Se sezionamento sarà rimandato al giorno dopo, aggiungere PBS 1X per coprire l&#39;agarosio nello stampo e conservare in una scatola contenente carta assorbente umida imbevuta di PBS 1X. </li><li> Sbucciare via lo stampo di plastica. Utilizzando una lama di rasoio, ritagliare una scatola di agarosio contenente il tessuto dell&#39;orecchio interno. Fare attenzione per assicurare che il piano di sezione è diritta e parallela al lato opposto del blocco, che sarà la superficie su cui è incollato il blocco di agarosio in giù. Dal momento che l&#39;agarosio non infiltrano i tessuti, non tagliare troppo agarosio provenienti da tutto il tessuto, in modo che il tessuto sarà ben supportato. </li><li> Usa supercolla per fissare il blocco alla superficie di taglio. </li><li> Sezione a 40-100 micron di spessore vibratome. Salva sezioni in un tessuto-cultura piatto pieno di PBS 1X, 0,1% TritonX-100. Una sezione rappresentativa attraverso la spirale cocleare è mostrato in fig. 2C. </li><li> Utilizzare pinze a sezionare l&#39;agarosio via dal tessuto. Agarosio non penetra nel tessuto, ma sarà solo attaccati alla superficie esterna dell&#39;orecchio interno. </li><li> Se lo si desidera, piscina agarosio-free, tessuto sezionato con una pipetta di un grosso foro di apertura per evitare un eccessivo taglio del tessuto. Se si esegue macchie di anticorpi multipli su più tessuti diversi, le sezioni possono essere organizzate in 16 - o 24-ben piatto coltura tissutale. </li></ol> 3. Anticorpi colorazione vibratome sezioni Procedere con anticorpi macchia. Sezioni processo per intero-mount, fluttuante in soluzione. Di seguito è riportato un anticorpo protocollo di esempio per la colorazione S100 marker delle cellule pilastro dell&#39;organo del Corti, ma il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi anticorpi. Tutti i lavaggi sono condotte a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. <ol><li> In un piatto multi-bene di coltura tissutale, incubare libero di fluttuare sezioni con dondolo dolce in PBT (1X PBS, 1% di sieroalbumina bovina, 0,1% Triton X-100) per 30 minuti. </li><li> Pipettare off vecchia soluzione e bloccare free-floating sezioni con dondolo dolci capra PBT siero + normale (50 microlitri NGS / 1 ml PBT) per 30 minuti. </li><li> Pipettare off vecchia soluzione e aggiungere l&#39;anticorpo primario diluito in PBT + NGS (1:200 diluizione S100 in PBT + NGS). Incubare per una notte a 4 ° C con dolce dondolio. </li><li> Pipettare off soluzione dell&#39;anticorpo primario. Lavare 3X, 5 min. con PBT, poi 4X, minuti 30. con PBT. </li><li> Blocco con PBT + NGS, 30 min. </li><li> Incubare con fluorescenza anticorpo secondario coniugato (cresciuto a capra) diluito in PBT + NGS. Incubare per una notte a 4 ° C, o un paio d&#39;ore, RT, dolce dondolio. </li><li> Pipettare off soluzione di anticorpo secondario. Lavare 3X, 5 min., Poi 4X, minuti 30. con PBT. </li><li> Pipettare lo scorso PBT lavare e sostituire con adeguate mezzo acquoso contenente il montaggio di contrasto nucleare. </li></ol> 4. Sezioni di montaggio su vetrini e microscopio confocale Per evitare lo schiacciamento delle sezioni di spessore con il coprioggetti, durante il montaggio singole sezioni, un distanziatore deve essere inserito tra il vetrino da microscopio e il coprioggetto. Di seguito sono due metodi alternativi di montaggio sezioni vibratome spessore: <ol><li><ol type="a"><li> Un distanziatore può essere creato inserendo un bordo di grasso per vuoto in una piazza intorno alla sezione di tessuto. Così, nello stabilire il coprioggetti, i bordi del coprioggetto saranno sigillati con grasso per vuoto. Premere verso il basso i bordi del coprioggetto con il pollice per aderire saldamente sulla diapositiva. Se il grasso vuoto è ordinatamente e in modo uniforme presenti tutti i bordi del vetrino, la diapositiva sarà sigillato sufficiente per l&#39;uso su un microscopio invertito confocale. </li><li> In alternativa, un distanziatore possono essere creati utilizzando resina agarosio cromatografia maglie di dimensioni conosciute (come Affi-Gel Blu Gel, Bio-Rad). Pipettare 1 ml di resina sul vetrino da microscopio in ciascuno dei quattro angoli dove il coprioggetti verrà posizionato. Pipettare una sezione di tessuto e mezzi di montaggio al centro dei quattro punti di resina. Coprioggetto. Se si utilizza un microscopio invertito confocale, sigillare il coprioggetto sul vetrino da microscopio utilizzando nailpolish. </li></ol></li><li> Ottenere sezioni ottiche delle fette vibratome colorati usando la microscopia confocale. Per quantificare vari tipi di cellule all&#39;interno dell&#39;organo del Corti, ottenere un z-stack in un passo definito (tra 1,5 e 3 micron). Sezioni devono essere controproducente da un colorante nucleare (passo 3,8). Le immagini possono essere esaminate su qualsiasi schermo del computer dopo la raccolta di immagini confocale. Le celle possono essere contati manualmente sia osservando la comparsa e la scomparsa dei nuclei come immagini vengono esaminate in modo sequenziale attraverso il z-stack. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un rappresentante confocale z-stack attraverso una sezione vibratome, colorati per le proteine ​​S100, che è presente nel pilastro e cellule Deiters &#39;, e di contrasto con un colorante nucleare (Fig. 3A-F). Ogni pannello è l&#39;immagine confocale presa a 3 micron-passi, con un pannello l&#39;immagine confocale ottenuto più vicino alla superficie della sezione vibratome e il pannello F l&#39;immagine confocale ottenuto più internamente all&#39;interno della sezione vibratome. La morfologia dell&#39;organo del Corti appare minimamente disturbato. In particolare, le estensioni citoplasmatica delle cellule pilastro non sono rotte. Notando la comparsa e la scomparsa dei nuclei delle cellule pilastro attraverso il z-stack (Fig. 3A a 3F), sia interiore che esteriore numero di cellulare pilastro può essere contato (vedi numerazione, Fig. 3A -. F). A causa del piccolo numero di ciascun tipo di cellula per immagine confocale, questo approccio può essere usato per contare più tipi di cellule all&#39;interno dell&#39;organo del Corti. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Intatto, 15 settimane di età, adulti orecchio interno racchiuso nella capsula otica. (A) La capsula diritto otic (tra parentesi) racchiuso nel cranio, viste da un punto di vista di dentro la testa, dopo la rimozione del cervello. Anteriore è a destra. (B) intatto, orecchie interna di 15 settimane di età dopo la dissezione dal cranio. Superficie laterale dell&#39;orecchio interno sinistro è visibile; superficie mediale dell&#39;orecchio interno destro è visibile. Le etichette indicano le posizioni dei anteriore semicircolare canale (ASC), co (coclea), e ow (finestra ovale). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) intero orecchio interno da 15 settimane di età adulta, incorporato nel agarosio al centro di una Peel-Away stampo. Aereo prevista di sezione è indicato. (B), primo piano l&#39;immagine di 15 settimane di età, intero orecchio interno prima di incorporamento. Una parte dell&#39;osso circostante è stata sezionata via così il labirinto membranoso potrebbe un visto più chiaramente. Il laterale del canale semicircolare (LSC), anteriore semicircolare canale (asc), e la coclea (co) sono tracciati (curve bianco). La svolta basale della coclea (punta di freccia) e il piano previsto di sezione (linea tratteggiata) sono indicati. (C) Rappresentante cross-sezione attraverso la coclea. In una sezione trasversale attraverso il dotto cocleare, l&#39;organo del Corti (° C) è boxed, il vascularis stria (sv) è tra parentesi, e la membrana del Reissner (Rm) è indicato. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. L&#39;organo di Corti in una wild-type del mouse P21. (AF) serie sequenziale confocale, ad un passo cellule 3 micron di dimensioni, attraverso un anticorpo macchiato S100 organo di Corti per visualizzare le cellule pilastro e Deiters &#39;. Conta delle cellule pilastro interiore ed esteriore dall&#39;inizio alla fine della serie sono numerati. Abbreviazioni: IHC (cellule ciliate interne), aIHC (adiacente cellule ciliate interne), ACT (cellule ciliate esterne), PC (cella pilastro), DC (cellule Deiters &#39;).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Medical College of Wisconsin IACUC.

La procedura di sezionamento vibratome, seguita da immagini immunoistochimica e confocale permette la visualizzazione delle dell&#39;organo del Corti, con minimo danno tissutale. Chiaramente, le immagini confocale preso dalle regioni interne della sezione vibratome spettacolo eccellente conservazione della morfologia cellulare che è limitata solo dalla fissazione artefatti. Immagini confocale preso vicino alle due superfici di taglio di una sezione vibratome sono spesso indistinguibili dalle immagini provenienti dalle ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Leica VT1000S vibrante lama microtomo </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 microscopio confocale a scansione laser </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Studente Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura Bassa Punto di fusione Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way embedding stampo </td><td> Polysciences </td><td> 18986 o 18646A </td><td></td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 di capra anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> vuoto grasso </td><td> Pescatore </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Gel Blu </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

L&#39;organo di Corti dei mammiferi è un mosaico altamente ordinato cellulari di capelli mechanosensory e nonsensory cellule di supporto (Recensione a 1,2). Visualizzazione di questo mosaico cellulare spesso richiede che l&#39;organo del Corti è sezionato. In particolare, il pilastro nonsensory e le cellule Deiters &#39;, i cui nuclei si trovano basale rispetto alle cellule dei capelli, non possono essere visualizzati senza cross-sezionare l&#39;organo del Corti. Tuttavia, il delicato citoarchitettura dell&#39;organo di Corti dei mammiferi, inclusi i processi multa citoplasmatica del pilastro e cellule Deiters &#39;, è difficile da conservare per procedure istologiche di routine come la paraffina e crio-sezionamento, che sono compatibili con le tecniche standard di colorazione immunoistochimica. Qui descrivere una procedura semplice e robusta costituita da vibratome sezionamento della coclea, la colorazione immunoistochimica di queste sezioni vibratome a monte tutto, seguita da microscopia confocale. Questa procedura è stata utilizzata ampiamente per l&#39;analisi immunhistochemical di molti organi, tra cui la gemma dell&#39;arto topo, pesce zebra intestino, fegato, pancreas e cuore (vedi 3-6 per esempi selezionati). Inoltre, questa procedura è stata sucessful sia per l&#39;imaging e quantitificaton del numero di cellule mutanti pilastro di organi e il controllo delle Corti sia in embrioni di topi adulti e 7. Questo metodo, tuttavia, non è attualmente molto utilizzato per esaminare l&#39;organo di Corti dei mammiferi. Il potenziale di questa procedura per garantire sia la conservazione potenziata del citoarchitettura multa dell&#39;organo del Corti adulti e consentire la quantificazione dei vari tipi di cellule è descritto.

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell&#39;organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell&#39;organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.

Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell&#39;organo di Corti dei mammiferi

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K Views.  Medical College of Wisconsin. Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell'organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.

Video: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Un metodo volumetrico per la quantificazione di Vasospasm cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...