עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R21NS064412, NSF מענק 1,052,048 וJeffress זיכרון אמון מענק J-908.

1. לדוגמא הכנה הערה: במקרים רבים ניסויי זלוף לשטוף את חלק משמעותי של תאים, מה שיכול להיות בעיה מתסכלת. אמנם לא הכרחי עבור כל שורות תאים, משטחי זכוכית כיסוי ציפוי עם פולי-L-ליזין (להוסיף 1.0 ml/25 2 סנטימטר של פתרון 0.01% על פני השטח, דגירה&gt; 5 דקות, לשטוף פעמיים עם מים כיתה תרבית תאים, ויבשים ב ארון הבטיחות הביולוגי) משפר את הידבקות תא. כמו כן, להיות מודע לרמת הבטיחות הביולוגית (מנהלת הליגה) של הקו הסלולרי בשימוש, ופעל על פי נוהל העבודה הרגיל שאושר על ידי משרד בריאות ובטיחות הסביבתי המקומי. בניסוי זה, תאי cos7 שימשו עקב פעילות תחבורת גלוטמין אנדוגני נמוכה (ראה איור 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע cos7 ב ~ confluency 70-80% בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + 10% נסיוב עגל קוסמי ו100 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, או על coverslips זכוכית סטרילית 25 מ&quot;מ מונח בתרבות 6 היטבצלחת או שקופיות זכוכית תחתונה 8 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את מצע הגידול לDMEM +10% בסרום קוסמי עגל (ללא אנטיביוטיקה), על פי הפרוטוקול של היצרן. לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בלחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.4 מ&quot;ג כל אחת של ה-DNA פלסמיד קידוד חיישן גלוטמין (pcDNA3.1, נשא חיישן FLIPQTV3.0 תחת CMV אמרגן 10) וASCT2 mCherry מתויג 10-50 סרום ללא מדיה מיליליטר (Opti-ממ) ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב transfection 50 מיליליטר סרום ללא מדיה. לדגור על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני פתרונות המכילים DNA (שלב 1.3) ומגיב transfection (שלב 1.4) ו דגירה עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את מגיב transfection על גבי התאים ומערבבים בעדינות על ידי נדנדה הקאמרית. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף הבינוני עד DMEM + 10% עגל סרום קוסמישל פניצילין / סטרפטומיצין (CCS) + 100 יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם צילמו 48-72 לאחר transfection שעה. </li></ol> 2. ניסוי זלוף הערה: לתאי cos7 השתמשו בניסוי זה, תקשורת זלוף והקאמרי הוחזקו על RT וסביבת CO 2 ריכוז. עם זאת, יש להשתמש אם התאים בשימוש דורשים טמפרטורה גבוהה יותר ו-CO 2 שליטת ריכוז להישרדות, במה מיקרוסקופ מחוממת ו / או תא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן AF חיץ זלוף (ראה רשימה של חומרים). צרף ברזים למיניהם ל50 מיליליטר מזרקים, לסגור את הברזים למינים ולאחר מכן למלא אותם עם פתרונות זלוף. פתח את ברזלים לתקופה קצרה כדי למלא את החלל בראש בברזלים עם למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על 8 ערוצים, מערכת זלוף הכבידה להאכיל עם עיפרון זלוף, ולאחר מכן בחר באפשרות &quot;מצב ידני&quot; תחת אפשרות בחירת פונקציה. הנח מיכל פסולת בעיפרון זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידנילהפעיל את הנמלים על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ולמלא את tubings באמצעות 10 מזרק מיליליטר המכיל מים, ולאחר מכן לסגור את הנמל. ברגע שהיציאות מלאות במים, לקבוע את המזרקים המכילים מאגרי AF ביציאה 1-6 של מערכת זלוף, ולאחר מכן פתח את הברזים למיניהם. לפתוח את היציאות שוב כדי להחליף את המים בצינורות עם החוצצים. קצב הזרימה צריך להיות סביב 0.8 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על ביטול פעם אחת בבקר זלוף לחזור לתפריט &quot;בחר פונקציה&quot;. לעבור לאפשרות &quot;תכנית ערוך&quot;, ולאחר מכן להקליד את פרוטוקול זלוף מפורט בטבלה 1. שמרו את תכנית זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מחוץ לחממה. שטוף פעמיים עם חיץ זלוף, ולאחר מכן קבע את התאים על הבמה. חבר את מערכת זלוף לתא. אם נעשה שימוש בתא פתוח, הוקם משאבה נוספת שמסירה את פתרון זלוף מהחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Slidebook. התחל שקופית חדשה. הערה:ההליך הבא הוא ספציפי לתוכנת Slidebook, אלא גם תוכנות אחרות כגון MetaFluor וNis-Element יכולות לשמש לסוג של הדמיה שתוארה כאן. באופן תיאורטי ניתן לבצע ניסויים באמצעות כל תוכנה המאפשרת הדמיה בזמן כמובן, וניתן לנתח רצפי התמונה שלאחר ניסוי באמצעות תוכנה כגון ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או פיג&#39;י (http:/ / Fiji.sc / פיג&#39;י). עם זאת, תוכנה המאפשרת ניטור של יחס acceptor / תורם בזמן אמת היא שימושית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות על הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מצא תאי שיתוף מבטא את החיישן וASCT-mCherry באמצעות מערכות סינון מתאימות (ראה רשימה של חומרים) תחת פונקצית &quot;פוקוס&quot;. התאם רווח על ידי לחיצה על לשונית &quot;מצלמה&quot; ומחליק את פס השקף תחת &quot;רווח&quot;. כמו כן, להתאים את הגדרת מסנן צפיפות הניטרלית מתפריט הנפתח מסנן צפיפות ניטראלי. הערה: אם קוביית המסנן אינה כוללת מסנן עין, אין להשתמש בחלקי העין מאז שוראור עירור T-גל מזיק לעיניים. השתמש במסך המחשב כדי למצוא את התאים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של תאים with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (מסננים שצוינו ברשימה של חומרים). לחץ על &quot;לכידת תמונה&quot;, ולאחר מכן בחלון הרכישה, לציין את המסננים שהולכים להיות בשימוש. לחץ על לחצן &quot;בדיקה&quot; כדי להתאים את זמן חשיפה על ידי הקלדת זמן חשיפה הרצויה בתיבה ליד הגדרות מסננים. הערה: כל שלושה הערוצים צריכים להיות חשופים לאותו האורך. בעת כוונון הפרמטרים ההדמיה, לקחת את שינוי סריג יעילות הצפוי ולקפל להגדיל בחשבון: לדוגמא, אם את יעילות סריג צפויה לעלות פי 2 במהלך הניסוי, צריכים להיות מותאמים פרמטרים הדמיהכך שעוצמתם Acceptor לשעבר תורם במצב המנוחה צריכה להיות &lt;50% מהערך המקסימאלי שניתן להקליט על ידי המכשיר, כך שהערוץ שאינו הופך להיות רווי במהלך הניסוי. אות מהתאים שכותרתו צריכה להיות לפחות גבוהה יותר פי שלוש מזה שבאזור הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין באמצעות כלי אזורים בתוכנה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת פונקציה כדי לבחור פיקסלים מעל עוצמה מסוימת, ולאחר מכן הוסבה לאזורים. כדי לעשות זאת, לחץ על מסיכה - מגזרי, ואז להעביר את סרגל הגלילה כדי להדגיש את האזורים הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;זמן לשגות&quot; בתיבת הסוג ללכוד, ולאחר מכן לציין את המרווח (10 שניות בניסוי הזה) ונקודות זמן לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור באזור ללא כל תאי ניאון. אזור זה משמש לחיסור רקע. לחץ לחיצה ימנית באזור נמשך, ולאחר מכן להגדיר אותו כרקע. הערה: באופן אידיאלי, תאים שאיןיש להשתמש לא מבטאים את החיישנים כמו זו של אזור הרקע לחשבון עבור שני autofluorescence ותפרחת הרקע זוהתה על ידי המצלמה. אם אין תאים כאלה זמינים בשדה ראיה, יש להשתמש לפחות באזור ללא תאים כדי להסביר את הקרינה הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התכנית הרצויה תחת &quot;בחר פונקציה - הפעלת תוכניות&quot; אפשרות. לעבור לתכנית הצילה (ראה שלב 2.3), ולאחר מכן פגע ENTER בבקר זלוף. עכשיו התכנית נטענת, ולהכות על מקש כלשהו יפעיל את זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זלוף וניסוי ההדמיה להתחיל באותו הזמן על ידי לחיצה על כפתור &quot;התחל&quot; בחלון הלכידה באותו הזמן כמו לחיצה על מקש בבקר זלוף. הערה: מומלץ להקליט timepoint בי הפתרונות הוחלפו (זה יכול להיעשות באמצעות &quot;אורים&quot; פונקציה, נמצאים בתוך כרטיסיית הרכישה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את אותה USI פרוטוקול זלוףng תאים לבטא חיישן שצפוי להיות או רווי או לא מאוגד תחת תנאי הניסוי. הערה: כאן, FLIPQTV3.0_1.5μ, שהוא רווי בתנאי הניסוי, משמש כביקורת, איור 6 ניסויי שליטה כזו נחוצים כדי לוודא ששינוי סריג יעילות הוא כתוצאה מהשינוי בפועל במצע ולא. כתוצאה מהשינוי בפרמטרים אחרים כגון pH הסלולרי. </li></ol> 3. ניתוח שלאחר ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם להיסחף מדגם אירע במהלך הניסוי. צייר אזורים של העניין (ROI) זה על התמונה שצולמה בtimepoint 0, ולאחר מכן להעביר את סרגל הגלילה בחלק העליון של חלון ההדמיה ולבדוק אם התאים נפולת של ROIs בתמונות שצולמו מאוחר יותר בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כן, אז להשתמש בפונקצית המעקב כדי לתקן את הסחף על ידי ראשון, יצירת מסכות סביב התאים על ידי בחירת מסכה - מגזרי, ולאחר מכן להחליק את השורה שמציינת את הפסקת לגדולותhlight האזורים המכילים תאים. עקוב אחר האזורים על ידי לחיצה מסכה - מעקב אחר חלקיקים - מעקב אחר חלקיקי יסוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לצייר ROIs ואזור רקע בעת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את העצמה הממוצעת של ROIs במהלך הניסוי. לחץ סטטיסטיקה - יצוא - נתוני היחס / timelapse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סריג יעילות וכימות של ריכוז מצע אינה הכרחיים, עלילה כמובן יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) כשלוח של הדינמיקה של המצע הזמן. כדי לקבוע את ריכוז cytosolic, לחשב את מקסימלי ומינימאלי שינוי יחס (כלומר, שבירווה והעדר המצע, בהתאמה), Δr מקסימום - דקות Δr, על ידי רגרסיה לא לינארית של Δratio (Δr) עם המשוואה הבאה: x Δr = [S] / (d + K [S]) (Δr <sub&gt; מקסימום - דקות Δr) + Δr דקות שבו [S] הוא ריכוז המצע בcytosol. שימוש Δr מקסימום - ערכי Δr דקות הושגו, הרוויה (S) של החיישן בΔr נתון מחושב כ S = (Δr - Δr דקות) / (Δr מקסימום - דקות Δr) S נוסף ניתן להמיר את ריכוז המצע [S] באמצעות המשוואה הבאה: S = [S] / (d + K [S]) הערה: עוצמת ערוץ em Acceptor לשעבר Acceptor צריכה להיות גם זמם לבחון אם תנאי הניסוי השפיעו על הקרינה של acceptor ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר להיסחף בסיסי בשל צילום הלבנה הוא ציין, לבצע תיקון בסיס. כדי לעשות זאת, עלילה העוצמות של תורם acceptor לאורך זמן (איור 5 א). ואז לזהות את הנקודות הזמן משמש להבסיס דואר, על פי העיכוב במערכת זלוף ופעילות ההובלה של תא המסוים (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הולם polynominal שמגדירה את נקודת ההתחלה. לאחר מכן, לנרמל את עוצמת הגלם מtimepoint לבסיס (איור 5 ג). לחשב את יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) מעוצמות תורם acceptor המנורמלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

ההצלחה של ניסויי הדמיה תלויה בגורמים קריטיים כמה. אחד הגורמים הללו הוא הזיקה של חיישנים המשמשת, כפי שפורט לעיל. ריכוז מוחלט של המצע בתא subcellular של עניין, עם זאת, הוא לעתים קרובות לא ידוע. לכן אנו ממליצים לנסות חיישנים מרובים עם זיקות מעד למצוא אחד שפועל תחת תנאי ניסוי הר?...

בשל התקדמות מרשימה בטכנולוגיות המאפשרת בדיקה של transcriptome וproteome ברמה תאית, זה הפך כעת ברור כי ביוכימיה והשטף של מטבוליטים ויונים וכתוצאה מכך הם מאוד תאים מסוג ספציפי. לדוגמא, בכבד של היונקים, השפלה גלוטמין רציפה וסינתזה מתבצעות בו זמנית על ידי תאי periportal ותאי perivenous בהתאמה, האכלת אמוניום למעגל האוריאה בסוג התא לשעבר תוך צריכת אמוניה עודפת ב1-3 האחרון. במקרים מסוימים, את ההטרוגניות ביוכימיים משמעותית הוא זוהה גם ב&quot; סוג תא &quot;יחיד 4, 5. בנוסף לסגולי מרחבית כגון, הרמות תאיות של מטבוליטים ויונים הן מאוד דינמיות (למשל, מולקולות איתות כגון Ca 2 + ונוקלאוטידים מחזוריים). דפוסי spatiotemporal של מטבוליטים ויונים לעתים קרובות משחקים תפקיד קריטי בהעברת אותות. Monitoring דינמיקה הסלולר של מטבוליטים ויונים, לעומת זאת, מהווה אתגר ייחודי. במקרים רבים השינוי בריכוזים הם מהירים וחולפים, שהודגם על ידי המקרה של מולקולות איתות כגון Ca 2 +, אשר דועך בתוך ~ 20 אלפיות שניים בקוצים הדנדריטים 6. בנוסף, מידור של מסלולים ביוכימיים בתוך ובין התאים עושה את זה קשה לכמת את הדינמיקה של מטבוליטים ויונים באמצעות מיצוי וכרומטוגרפיה עמודה / טכניקות ספקטרומטריית מסה. חיישני מקודד גנטי למולקולות ביולוגיות המשמשים כיום באופן נרחב בשל הרזולוציה spatiotemporal הגבוהה המאפשרת הנסיין ללמוד דינמיקה קצרת מועד ו / או ממודרת מולקולרית (הנסקרת ב 7, 8). בערך ניתן לחלק את חיישני מקודדים גנטי אלה לשתי קטגוריות; חיישנים מבוססי עוצמה וחיישני ratiometic. חיישנים מבוססי עוצמה בדרך כלל מורכבים של תחום מחייב ושפעתחלבון orescent (FPS), והמומס מחייב לתחום המחייב משנים את עוצמת הניאון. חיישני Ratiometic, לעומת זאת, מנצלים לעתים קרובות העברת פוסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני FPS המתפקדים כזוג סריג. חיישנים אלה כוללים תחום מחייב ושתי תמונות בשניה, והמומס המחייב גורם שינוי בסריג יעילות בין שתי תמונות בשניה. מספר גדול של חיישנים למטבוליטים ויונים חשובים מבחינה ביולוגית פותחו בעשור האחרון 8, 9. אחת האפשרות מרגשת המוצע על ידי חיישני מקודדים גנטי כזה הוא השימוש שלהם בניתוח ברזולוציה הגבוהה של תהליכי הובלת קרום, שלא היה קל בעבר כדי לזהות ברמה התאית. חיישני מקודדים גנטי להקל על הניתוח של מנגנוני הובלה כגון סגוליות מצע וpH תלות 10, 11. יתר על כן, בשילוב עם מיל הגנטיources כגון הספרייה של RNAi בונה לאורגניזמים מודל, ניתן כיום לבצע חיפושי הגנום לתהליכי הובלת רומן באמצעות חיישנים מקודדים גנטי. ואכן, שימוש בעופרת חיישן מקודד גנטי לגילוי של מובילי uncharacterized בעבר במקרים רבים 12, 13. לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה סדרה של חיישן מבוסס סריג לגלוטמין. אנחנו הוכיחו כי רמות גלוטמין הסלולרי ניתן דמיינו באמצעות חיישני גלוטמין סריג כזה 10. חיישנים אלה כוללים תורם סריג (mTFP1) מוכנס לתוך חלבון גלוטמין מחייב חיידקי glnH, וacceptor סריג (ונוס) בC-Termini של glnH (איור 1). סריג יעילות של חיישנים אלה להקטין על הכריכה של גלוטמין, וכתוצאה מכך הירידה של יחס עוצמת acceptor / תורם. ויסות עדינה של תהליכי הובלת גלוטמין היא חשובה בתהליכים ביולוגיים כגון neurotransm14 ission, 15 והתחזוקה של מחזור אוריאה בכבד 1, 16, 17. כאן אנו מראים את המתודולוגיה של ניתוח פעילות תחבורה עם חיישני סריג לגלוטמין, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום ההגדרה. המטרה של ניסויים המוצגים כאן הן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד ולבחון את הספציפיות מצע של טרנספורטר הביע transiently.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. מגוון עצום של חיישנים כאלה למולקולות ביולוגיות הפך זמין בשנים האחרונות 15, שחלקם הפך לכלי חיוני המשמשים באופן שיגרתי במעבדות רבות. אחד היישומים המרגשים של חיישני מקודדים גנטי הוא השימוש בחיישנים אלה בחקירת תהליכי הובלה תאיות. מאפיינים של מובילים כגון קינטיקה וספציפיות מצע יכולים להיחקר ברמה תאית, המספקים אפשרויות לניתוחי תאים מסוג מסוימים של פעילות הובלה. במאמר זה, נדגים כיצד ניתן לצפות דינמיקת טרנספורטר באמצעות חיישן גלוטמין מקודד גנטי לדוגמא ירושלים. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו.

ניסויים בזמן קורס טיפוסיים מיוצגים באיור 2. בניסויים אלו, סריג חיישני גלוטמין עם זיקות של 8 מ&quot;מ (FLIPQTV3.0_8m, איור 2 א ו -2) ו100 מיקרומטר (FlipQTV3.0_100 μ C ו-D) היו שיתוף הביע עם ASCT2 חובה מחליף חומצת אמין 18 בתאי cos7 10. זרם של גלוטמין הוא זוהה כשינוי ביחסי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Virginia Tech.  מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי ייד?...

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

טיסה חרקים באיתור ובסיווג עם חיישנים זולים

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

פילוח סיבים עצביים ספינלי לטיפול גירוי מוחי עמוק באמצעות דגמים אינטראקטיביים, מטופל ספציפי

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...