עבודה זו נתמכה על ידי משרד החקלאות מענקים 1999-35212-8680, 2005-01378, ו 2010-04288-01, USDA קרנות פורמולה ומדינת גרנט לרפואה וטרינרית של גאורגיה המחקר החקלאי. פרוטוקול המתוארים בפרסום זה פותחה לשימוש על ידי סטודנטים במסגרת קורסי מחקר מכוון: MIBO 4900L, ג&#39;ין 4960H, BCMB 4960L ו 4960H Biol באוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה בשימוש על ידי התלמידים על מספר פרויקטים של מחקר באפידמיולוגיה מולקולרית של מאורר מעבדה. אנו רוצים להודות סטודנטים רבים אשר ביצעו מחקר מאורר ולי מעבדות, ויו&quot;ר המחלקה שלנו, ג&#39;ון Glisson לתמיכה מאמצינו לשלב הוראה לתואר ראשון עם המחקר.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

רוב זמינים מסחרית בדיקות PCR לזיהוי מטרות גנים סלמונלה ייחודית הסוג (דוגמה invA). עם זאת, לא סלמונלה כולם שווים ביכולתם לגרום למחלה בבני אדם או שכיחות בקרב אוכלוסיות בעלי חיים. זיהוי מוקדם של הבדלים antigenic ב סלמונלה LPS-אנטיגן O ו flagellinH1 ו אנטיגנים H2 יש להוביל הבידול של סלמונלה אל מעל 2500 serovars מבוסס על ההבדלים הללו antigenic. ישנם 46 אנטיגנים O נבדל ברורה flagellin 86 (H) אנטיגנים מזוהה סלמונלה הסוג. סלמונלה יכול להחזיק אחד (H1) או שניים שונים (H1 &amp; H2) flagellins. שילוב שונה של O, H1, H2 ו אנטיגנים להסביר את serovars סלמונלה 2500 מוכרת היום. Serovar מוקצה מבוסס על הנוסחה antigenic נגזר זיהוי של O הפרט אנטיגנים H. הנוסחה antigenic כתוב כמו O: H1: H2, והיכן &quot;-&quot;, מתייחס בהעדר H1 או H2 flagellin ו &quot;NT&quot; (לא typeable) עבור סלמונלה שלילי אנטיגן-O. לדוגמה, Typhimurium serovar מוקצה ס enterica לבודד עם הנוסחה antigenic ב: אני: 1,2 בעוד enteritidis ניתן לבודד עם D1 הנוסחה: g, מ &#39;: -. זו וריאציה antigenic באוכלוסייה סלמונלה היא הביטוי החיצוני של הבדלים ברמת נוקלאוטיד כי ולכן ניתן לנצל בקלות על ידי PCR. זיהינו את ההבדלים הגנטיים הקשורים O ספציפיים אללים H לפתח allelotyping PCR לזיהוי ס enterica serovars: enteritidis, הדר, היידלברג, Typhimurium ו (3). המשימה דיווח נכון של סלמונלה serovar דורש בדיקה של כל אללים הקשורים O: H1: נוסחאות H2 antigenic עבור enteritidis (D1: g, מ &#39;: -), הדר (C2: Z10: e, n, x), היידלברג (B : r: 1,2), ו Typhimurium (B: i: 1,2). ללא ידע של האלל O או אנטיגן, הממצא של גרם H1, אלל מ &#39;לבד לא בהכרח לזהות סלמונלה לבודד כמו enteritidis כמו סלמונלה serovars אחרים: Agona, קליפורניה, מונטווידאו, גם להחזיק את זה אלל זהה. בעוד ה-PCR allelotyping תוכנן במקור כדי לזהות ביטוי שהוזכר serovars סלמונלה, בדיקה זו ניתן לזהות נוסף 19 serovars (לוח 3). PCR allelotyping שלנו תוכנן במקור כדי לזהות אללים O ו-H. בפועל, זה הפך להיות מעשי יותר וחסכונית לנו לזהות את O-אנטיגן על ידי מבחן התלכדות שקופיות, באמצעות O-antisera ספציפיים, ולא לבצע את allelotyping O PCR כאשר עובדים עם תרבויות סלמונלה מבודדים. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש allelotyping O PCR אם המעבדה שלך משתמשת PCR כמסך (2) או להקליד סלמונלה מבודד שהוגשו על FTA כרטיסים (6), וכוללים סלמונלה ספציפי PCR עם מסך הראשון של דגימות (4 ). הגבל את PCRs allelotyping רק דגימות אלה המזוהות סלמונלה על ידי PCR או בדיקות ביוכימיות / antigenic. הפרוטוקול המתואר במאמר זה כבר מותאם לשימוש עם טכנולוגיה איידהו Rapidcycler, thermocycler אוויר חם אשר מאפשר להקטין כרכים התגובה ורץ התנאים התגובה בפחות זמן מאשר thermocyclers לחסום רבים חימום. כדי להתאים את פרוטוקול לשימוש עם thermocycler בלוק חימום עשויים לדרוש אופטימיזציה התנאים התגובה אמפירית על ידי הפחתת / העלאת הטמפרטורה חישול, התאמת ריכוזי פריימר, או התאמת MgCl 2 בריכוז. לדוגמה, אנו צריכים להתאים את פרוטוקול המחקר MJ-200 PTC thermocycler כדלקמן. עבודה עם הכרכים אותה התגובה המתוארת בטבלה 1, מניות הפועלים concentrationof קבוצת פריימר הייתי מדולל ל -2.5 מיקרומטר, הטמפרטורה חישול ירדה מ 55 ° C עד 45 ° C, ופעמים הדגירה על denaturation, חישול הרחבה צעדים הוארך עד s 20 עבור i / g, מ allelotyping PCR. לאחר שולט חיוביות ושליליות המתאים חיוניים עד תחילת אופטימיזציה ראשונית לכל PCR, לרבות הפרוטוקולים שפורסמו. אנו ממליצים על רכישת serovars סלמונלה ידוע, במיוחד Anatum (E1: e, h: 1,6), enteritidis (D1: ז, מ &#39;: -), הדר (C2: Z10: e, n, x), היידלברג (B: r : 1,2), מונטווידאו (C1: g, m, s: 1,2,7) ו Typhimurium (B: i: 1,2); ו Escherichia coli K12 מעבדה זן (DH5α, LE393, JM109 וכו &#39; ) כפקדי חיובי ושלילי בהתאמה עבור בדיקות PCR allelotyping המתואר במאמר זה. כמה אלה serovars סלמונלה ישמש שולטת חיובי או שלילי, בהתאם אלל נבדק. אמצעי זהירות מסוימים והנחיות צריך להיות מלווה בעת ביצוע זה אחרת אבחון PCR. ראשית, ההפרדה הפיזיתהכנת תבנית, PCR הגדרת, ועל ג&#39;ל אלקטרופורזה היא קריטית במניעת PCR ניתן לשאת על זיהום דיווח מוטעה של תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, הכללת הבקרות המתאימות יש צורך בכל PCR שגרתיות כמו פקדים אלה לזהות בעיות כשהן מתעוררות לסייע בפרשנות של התוצאות (5). והכי חשוב, עקביות היא חיונית, במיוחד בכל הקשור לתנאים electrophoretic עבור andestimation (PCR מוצר) זיהוי amplicon גודל amplicon. כדי להמחיש את הנקודה הזו, אנחנו בכוונה מושעה אלקטרופורזה מוקדם יותר נועד באיור 1 א. סטנדרטים משקל מולקולרי (נתיבים 1 ו 13) ושליטה חיובית (מסלול 2) לא מופרדים מספיק כדי להעריך במדויק בגדלים או לצפות הפרדה של שברי DNA שבו יש הבדלים קטנים (~ 50 נ&quot;ב) בגדלים. הפרדה נאותה של קטעי DNA, בעיקר סטנדרטים משקל מולקולרי, חיונית כמו דיווח חיוביות תלויה אמידה מדויקת של גודל amplicon ו הבחנה &quot;חיובי אמיתי&quot; מתוך הלא ספציפית amplicons כי הם נצפו לעתים בניהול היומיומי של כל ה-PCR (5 ). לדוגמה, יש amplicon שאינם ספציפיים 1B איור, מסלול 7 (~ 700 נ&quot;ב בגודל). אילו אלקטרופורזה הופסק מוקדם מדי, כאשר מול לצבוע רק בשלב חצי הדרך הג&#39;ל agarose, לא תהיה הבחנה קטנה בין 500 לבין 700 נ&quot;ב נ&quot;ב שברי DNA. לכן, מדגם בנתיב 7 היה דווח בטעות חיובי הן עבור i ו-g, אללים מ. לבסוף, צריך להכיר את מגבלות הקשורות מבחן כלשהו. כמה allelotyping H1/H2 PCR אין לי כוח מפלה להבחין הבדלים גנטיים קלים אללים השייכים H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 מורכב אנטיגן, דואר, n, x / e , n, z15 מורכב אנטיגן ואת מורכבות G H1 אנטיגן, הכוללת את, גרם אלל מ. אחד או שניים שינויים חומצת אמינו להסביר את epitopes שונה נוכח אלה אנטיגנים flagellar. זה היה קשה עבורנו ולכן לעיצוב primers שעלול לנצל זוג אלה בודד לפעמים בסיס הבדלים ברצף הגן flagellin (3). לדוגמה, סלמונלה serovars דבלין (D1: g, p: -) וברטה (D1: F, G, t: -) גם PCR חיובי עם g שלנו, mallelotyping primers. Allelotyping primers H2 אינה יכולה להבחין Typhimurium (B: i: 1,2) מ לאגוס (B: i: 1,5), היידלברג (B: r: 1,2) מ ברדפורד (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), או רמו (B: r: 1,7), או הדר (C2: Z10: e, n, x) מ Glostrup (C2: Z10: e, n, z15). בעוד הסבירות להיתקל בכמה serovars אלה: לאגוס, ברדפורד, Winneba, רמו או Glustrup הוא מרוחק, היא האפשרות דורש גם מתן הצהרה על הגבלה של בדיקות או בדיקה נוספת מאשרות. לסיכום, זה serotyping PCR מבוססי במהירות מזהה ס enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג Typhimurium, ו-O, H1, H2 ו אללים הקשורים serovars 19 נוספים. Assay זהו מהירה, חסכונית מיקרוביולוגית חלופית לגישה המסורתית סלמונלה serotyping.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומר שם </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערה </th></tr><tr><td> לוריא Bertani </td><td></td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> Microfuge צינורות </td><td> 1.5 מ&quot;ל כושר </td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> 200 הוכחה </td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ביולוגיה מולקולרית כיתה </td><td> סיגמא </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה: PCR בלבד) </td></tr><tr><td> 10 x-PCR חוצץ: </td><td> 20 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td> (חיץ מגיע עם ארגון ה-BSA, Ficoll ו Tartrazine) </td></tr><tr><td></td><td> 30 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> רוש </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> תקי פולימראז ה-DNA </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> נימי pipettes </td><td> 10 μl נפח </td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ראפיד Cycler </td><td></td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EEO נמוכה; כיתה לביולוגיה מולקולרית </td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> 50 X או טה הצפת מאגר TBE 5X </td><td></td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אופקי, הצוללת קאמרית ג&#39;ל אלקטרופורזה בג&#39;ל עם עובש </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אספקת חשמל </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> מולקולרית Imager ג&#39;ל דוק מערכת </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr></tbody></table> טבלה 4. חומרים

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

בדיקות שוטפות PCRs מסחרי לזיהוי היעד סלמונלה גנים ייחודיים הסוג הזה. עם זאת, ישנם שני מינים, שישה מינים, ומעל 2,500 serovars סלמונלה שונים, לא כולם שווים משמעותם לבריאות הציבור. לדוגמה, מציאת ס enterica תתי IIIa אריזונה על חווה ביצה שולחן שכבה הוא חסר משמעות לעומת בידוד ש &#39; תת המין enterica אני serovar enteritidis, הגורם המוביל סלמונלה קשור לצריכה של ביצים השולחן. Serovars מזוהים על בסיס הבדלים antigenic ב lipopolysaccharide (LPS) (אנטיגן O) flagellin (H1 ו-H2 אנטיגנים). הבדלים אלו הם antigenic החיצונית של גיוון של גנים אללים גנים הקשורים פנוטיפ זה. פיתחנו allelotyping, זמנית PCR כי המפתחות על הבדלים גנטיים בין ארבע הגדולות ס enterica תתי serovars מצאתי עופות הקשורים במחלה האנושית משמעותית בארה&quot;ב. זוגות פריימר PCR היו ממוקדות גנים מפתח או רצפים ייחודיים serovar סלמונלה ספציפיים נועד לייצר amplicon עם גודל מסוים עבור הגן או האלל. סלמונלה serovar מוקצה לבודד מבוסס על שילוב של תוצאות ה-PCR מבחן ספציפי LPS ו flagellin אללים גנים. PCRs זמנית המתוארות במאמר זה הן ספציפיות לגילוי ש תת המין enterica אני serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש PCRs זמנית כדי לזהות serovar עבור סלמונלה לבודד.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K Views.  University of Georgia. אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל...

Video: An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד<em&gt; ס Typhimurium</em&gt; חיידקים

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...