Bisolfito di conversione di protocollo Un protocollo standard per la conversione di 2 mg di DNA genomico è descritto di seguito. Quantità più piccole o più grandi di DNA genomico (100 pg-200 mg) può essere trattata con successo bisolfito. Queste condizioni di reazione risultato in completa conversione (99,5-99,7%) di quasi tutte le sequenze di DNA 3. 1. Preparazione del DNA Preparare i campioni di DNA genomico incubazione con tampone Lysis bisolfito DNA (2 mg t RNA, 280 ng / mL proteinasi K, 1% SDS) in un volume totale di 18 microlitri per 1 ora a 37 ° C. Nota: Questo è importante da raggiungere bisolfito di conversione massimo, soprattutto con DNA isolato da campioni clinici in cui ci possono essere ancora delle proteine ​​associate al DNA. 2. Denaturazione del DNA <ol><li> Denaturare il DNA 2 mg in un volume di 20 l, aggiungendo 2 ml di NaOH 3M appena preparati ad un finale concentration di 0.3M. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C per 15 minuti in un bagno d&#39;acqua, seguita da incubazione a 90 ° C per 2 minuti in un blocco di calore. Immediatamente posto i tubi in ghiaccio per 5 min. </li><li> Centrifugare le provette a 4 ° C per 10 s a 10.000 g, per garantire il DNA è alla base del tubo. </li></ol> 3. Deaminazione bisolfito Solfonazione e deaminazione idrolitica <ol><li> Preparare soluzioni fresche di 10 mm Quinol e saturi pH 5,0 metabisolfito di sodio (7,6 g di Na 2 S 2 O 5 con 464 ml di NaOH 10 M, composta da 15 ml con acqua). La soluzione di bisolfito di sodio saturo si ottiene capovolgendo delicatamente il reagente / miscela H 2 O, con minimo di miscelazione e l&#39;aerazione. Se necessario, regolare il pH con NaOH 10 M, per la dissoluzione completa del metabisolfito. Nota: Trattandosi di una soluzione satura, grumi di piccole dimensioni può ancora indisciolto. </li><li> Aggiungere 208microlitri della metabisolfito saturi e 12 ml di Quinol 10mM al DNA denaturato (20 l), in un volume finale di 240 microlitri di una concentrazione finale di 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0. Mescolare delicatamente tutti i reagenti e centrifugare per 10 secondi per assicurare tutte le goccioline sono alla base del tubo. </li><li> Sovrapposizione dei campioni con 200 ml di olio minerale. Incubare i campioni a 55 ° C in un bagno d&#39;acqua, per 4-16 ore. La durata del trattamento bisolfito dipende dalla quantità e qualità del DNA da convertire. Per il DNA di scarsa qualità o DNA degradato, limitare il tempo di incubazione di 4 ore. Nota: è importante che che la conversione bisolfito si svolge al buio per evitare l&#39;ossidazione, quindi se questo non è possibile avvolgere i tubi in un foglio prima di incubazione . </li><li> Al termine del periodo di incubazione del caso, girare i tubi brevemente in una microcentrifuga utilizzata per assicurare tutto il liquido è al fondo della provetta. </li><li> Recuperare il DNA bisolfito trattatida sotto lo strato di petrolio con attenzione pipettamento la soluzione di DNA dalla parte inferiore del tubo, senza occupare uno degli oli minerali. </li></ol> Dissalazione <ol start="5"><li> Rimuovere eventuali ioni liberi bisolfito passando attraverso una colonna di dissalazione e di eluizione in 50 ml di acqua Milli-Q (MQH 2 O). A seconda della quantità e qualità del DNA genomico e come si è preparato, diverse colonne di dissalazione possono essere utilizzati. Noi abitualmente uso Promega Wizard Clean up colonne, come queste colonne sono adatti per rimuovere le SDS utilizzate nella preparazione del DNA prima della conversione. </li></ol> Desulphonation alcali <ol start="6"><li> L&#39;addotto bisolfito viene rimosso dal ring da uracile desulphonation. Desulphonate con l&#39;aggiunta di 5,5 ml di NaOH 3M appena preparati ad una concentrazione finale di 0,3 M, poi incubare i campioni a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Centrifugare brevemente e aggiungere 1 l di t RNA (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; Neutralizzare la soluzione con l&#39;aggiunta di 33 ml di acetato di ammonio (NH 4 O Ac), pH 7.0 a una concentrazione finale di 3M. </li><li> Etanolo-precipitare il DNA con l&#39;aggiunta di 330 ml di etanolo freddo ghiaccio al 100%, mescolare bene per inversione. Lasciare a-20μC per 1 ora a notte. Centrifugare a 14.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere tutte le tracce di surnatante e asciugare il DNA precipitato per circa 20 min. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri di DNA / mg di 0,1 TE (10mM Tris-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8,0) o H 2 O. Lasciate a temperatura ambiente per circa 2 ore. Occasionalmente vortice i tubi per garantire il DNA è disciolto, seguito da una centrifuga veloce. </li><li> Utilizzare immediatamente per l&#39;amplificazione PCR, o conservare a -20 ° C per 1-10 anni a seconda della quantità e qualità del DNA. </li></ol> 4. PCR di amplificazione Primer di progettazione <ol><li> La progettazione efficace di PCR bisolfito di conversione specifici primer è Crucial per assicurare efficienti, imparziali di amplificazione del DNA completamente convertito verifica. Le seguenti linee guida sono utilizzati per facilitare la progettazione primer. </li></ol> Primer Linee guida di progettazione <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Per verificare proporzionale amplificazione del DNA metilato e non metilato, utilizzare un metilato 50:50 / non metilato campione completamente bisolfito controllo convertiti e amplificare con il bisolfito di conversione specifici primer sotto l&#39;ottimizzazione delle condizioni di reazione PCR (Figura 3). Per le 50:50 metilato: non metilato di controllo, l&#39;uso in vitro del DNA metilato e SSSI sia interi genomi amplificati (WGA) DNA o DNA sangue intero. Si prega di essere consapevole del fatto che alcuni geni saranno naturalmente metilato nel sangue e quindi in questi casi è meglio usare solo WGA DNA come il controllo &quot;non metilato&quot;. </li><li> Preparare miscele di reazione PCR di amplificazione a 100 &amp; mu; aliquote l contenente 2 ml di bisolfito di DNA genomico convertito, 200 mM dNTP, 1 primer mM, 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8,3 e 0,15 microlitri di Taq polimerasi. </li><li> In un termociclatore gradiente di temperatura, impostare la reazione eseguito in un gradiente di + / - 3 ° C previsto dalla Tm del primer in 10 tubi </li></ol><img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Per verificare che la ampliconi metilato e non metilato sono stati amplificati in proporzione, il amplicone può essere digerito con un enzima di restrizione informativo, come Taq 1 (TCGA), che si digeriscono il DNA metilato, ma non digerire il DNA metilato quando il sito enzima di restrizione è alterato dopo la conversione al bisolfito TTGA. L&#39;entità della digestione possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 3a). In alternativa, SYBRGreen (0,2 ml di diluizione 1:1000) possono essere aggiunti alla reazione PCR eil grado di metilazione può essere valutata effettuando calore trame dissociazione in real-time PCR termociclatore (Figura 3B). </li><li> Miscela di reazione PCR compresi MgCl2 condizioni di concentrazione e termici aver bisogno di essere regolata per aumentare l&#39;efficienza della PCR o per garantire proporzionale amplificazione dei frammenti di PCR metilato e non metilato. </li><li> Una volta che le condizioni di PCR sono ottimizzati, PCR può essere eseguita su campioni di bisolfito di conversione. Nota: Una volta che il Tm è ottimizzato un gradiente di temperatura PCR non devono essere utilizzati. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di ottimizzazione bisolfito di amplificazione PCR è mostrata in Figura 3. Condizioni ottimali di PCR dovrebbe amplificare ampliconi metilato e non metilato in proporzione e senza pregiudizi. La figura 3A mostra un gel di agarosio con un profilo di temperatura di amplificazione gradiente di PCR da una miscela di DNA metilato 50% e non metilato. The ampliconi della PCR sono stati trattati con un enzima di restrizione, Taq 1 (TCGA), che si digeriscono metilato (M) del DNA, ma non digerire non metilato (U) del DNA come il sito enzima di restrizione è alterato dalla conversione bisolfito di TTGA. Una pari quantità di taglio e non tagliato prodotto di PCR è previsto se il DNA metilato e non metilato è amplificato in proporzione. Esso può essere visto su questo gel che le condizioni ottimali per thermocyling non pregiudizi amplificazione è a 56,1 ° C (T). Conversione completa del DNA bisolfito possono anche essere analizzati mediante digestione con la citosina-site specifico enzima, come Hpa III (CCGG). Hpa III digerire solo se la conversione non è riuscita, in quanto il sito di restrizione sarà mantenuto. Se la conversione è completa il sito di restrizione verrà convertito in TCGG o TTGG a seconda dello stato di metilazione del DNA. Conversione totale del DNA bisolfito può essere visto in Figura 3A (H). Figura 3B mostra un vero e proprio complotto dissociazione tempopuò essere utilizzato anche come strumento per determinare se vi siano pregiudizi amplificazione in base alla temperatura alla quale le diverse molecole si dissociano. In questa figura si può notare che la PCR ha amplificato metilato (M) e non metilato (U) del DNA in proporzione da un mix di DNA metilato 50% e non metilato rispetto al controllo di amplificazione del DNA completamente metilato e non metilato che si dissociano in 82.1μC e 78.9μC rispettivamente. Dopo l&#39;ottimizzazione delle condizioni di reazione e thermocyling bisolfito campioni trattati può essere amplificato con filamento primer specifici e bisolfito specifico in un singolo o semi reazione di nested PCR. I frammenti di PCR risultante può essere visualizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio e sequenziato in modo diretto (Figura 4A) o con la clonazione e il sequenziamento. Dopo la clonazione e il sequenziamento lo stato di metilazione delle singole molecole possono essere tabulati, in una mappa bisolfito (Figura 4B), di visualizzare l&#39;eterogeneità deimetilazione. Alta velocità di analisi quantitativa di metilazione può essere eseguita utilizzando la tecnologia come quella utilizzata dal metodo EpiTYPER Sequenom. Utilizzando questo metodo, bisolfito DNA convertito con bisolfito viene amplificato specifico primer PCR e seguita da un processo di scissione proprietry. I frammenti risultanti sono quantificato mediante MALDI-TOF spettrometria di massa con lo spettro specifico dipende dalla presenza di cytosines metilata (Figura 5A). Una sintesi dei rapporti di metilazione nel campione può quindi essere estrapolati sotto forma di un epigramma (Figura 5B) o la trama di metilazione (Figura 5C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Figura 1. CpG metilati schematica. Nella cella normale, promotore associati isole CpG sono prevalentemente non metilato (grigio), mentre i siti CpG in seno agli organi geni sono scarsi e generalmente metilato (rosso). Il pannello a destra espande la struttura molecolareure di DNA in un singolo sito di metilazione CpG e mostra con una molecola CH3 al carbonio 5 della citosina. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Figura 2. . Chimici schematica conversione analisi della metilazione del DNA comprende quattro fasi principali, come mostrato, denaturazione, bisolfito di conversione, amplificazione PCR e analisi. Nel pannello di destra, le modifiche alla molecola citosina che si verificano durante la conversione bisolfito sono raffigurati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Figura 3. Ottimizzazione della PCR di amplificazione. A. Elettroforesi su gel di agarosio con un profilo di gradiente di temperatura amplificazione PCR da una miscela di 50% di DNA metilato e non metilato. Frammenti sono stati digeriti con uno Taq1 (T) o HpaIII (H) che digeriscono il DNA metilato e non DNA bisolfito convertiti rispettivamente. B. Calore analisi mostra una curva di dissociazione equazioneproporzione l di DNA metilato e non metilato (linea rossa mix 50/50) rispetto al controllo di amplificazione completamente metilati (linea rosa, M) e il DNA metilato (linea verde, U), che si dissociano a 82,1 ° C e 78,9 ° C rispettivamente. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Figura 4. Esempio di sequenziamento diretto e una mappa bisolfito. A. Tracciare la sequenza di tre diverse linee cellulari con i siti CpG evidenziato in giallo. Linea cellulare X visualizza il 100% di metilazione in tutti e tre i siti CpG mentre linee cellulari Y e Z mostrano vari gradi di metilazione come si vede dalla sovrapposizione G / A segnali. B. Rappresentante bisolfito mappa che mostra la densità di metilazione (punti rossi) a singoli siti CpG, come determinato dal sequenziamento diretto dei singoli cloni. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Figura 5. Un elevato throughput di metilazione del DNA utilizzando Sequenom. A. Spettro vista utilizzando la tecnologia Sequenom epiTYPER. Frammenti di DNA visualizzare spettri specifici, a seconda della quantità di DNA presente metilazione. B. Epigramma sintesi della percentuale di metilazione del DNA in ogni sito CpG per quattro diverse linee cellulari. Riassunto metilazione C. trama deriva dalla Epigramma Sequenom.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Metilazione del DNA mediante sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito è un metodo ben definito e versatile che facilita l&#39;identificazione e quantificazione di metilazione del DNA a singolo nucleotide risoluzione. Tuttavia, la conversione bisolfito e successiva analisi si basa sulla premessa che il DNA è stato completamente convertito, con ogni citosina non metilato essere deaminata a uracile e solo cytosines metilato rimanente non-reattivi. Se la conversione è incompleta, possono sorgere problemi con l&#39;analisi in quanto non convertito cytosines non metilato può essere erroneamente interpretato come cytosines metilato. Bisolfito di conversione può essere ottimizzato in varie fasi di massimizzare la percentuale di conversione. Per DNA per essere pienamente convertito prima deve essere a singolo filamento in modo che i residui di citosina sono esposti agli ioni bisolfito. Il primo passo, denaturazione del DNA, è critica e può essere fonte di conversione incompleta se il DNA non è completamente denaturato. Per garantireche il DNA è completamente denaturato, è importante che i parametri di reazione compresi l&#39;allontanamento di tutte le proteine ​​associate, concentrazione salina del caso, temperatura di incubazione e il tempo sono adatti a mantenere il DNA a singolo filamento conformazione. E &#39;importante usare fresca NaOH 3M e per consentire un tempo adeguato di incubazione. Se il DNA sta resistendo denaturazione, alcune modifiche al protocollo compresi l&#39;estensione del tempo di incubazione di 30 minuti o frammentazione del DNA prima di denaturazione può facilitare la denaturazione del DNA. Inoltre, DNA a singolo filamento (ssDNA), può ri-tempra di DNA a doppio filamento (dsDNA) durante la reazione di conversione bisolfito. Effettuare la reazione a una temperatura più alta (90-95 ° C) in modo periodico, o continuamente durante la reazione bisolfito può aiutare il mantenimento di ssDNA. Tuttavia, è importante essere consapevoli che la degradazione del DNA è notevolmente accelerato a queste temperature superiori. Reagenti diversi può anche essere aggiunto per interrompere la ricottura del secolofilamenti di DNA e, come l&#39;urea. La concentrazione del DNA e la sua qualità può colpire anche l&#39;efficienza della reazione bisolfito ed ultima resa PCR. Degradazione del DNA è una limitazione del protocollo di conversione bisolfito. Il trattamento chimico del DNA presenta rotture di filamenti diversi ssDNA e alcune delle dure condizioni necessarie per la completa conversione bisolfito compresa la concentrazione bisolfito alta, lunghi tempi di incubazione possono accelerare la degradazione del DNA. Nelle condizioni di reazione standard descritto, la degradazione del DNA non è un problema comune però, se le modifiche del protocollo vengono introdotti, come per le sequenze che sono refrattari alla conversione, per i modelli di DNA che sono degradati o di scarsa qualità, come campioni FFPE, allora la degradazione del DNA può diventare una limitazione significativa. Formalina fisso, paraffina (FFPE) e campioni di DNA degradato può essere efficacemente bisolfito convertita ed amplificata utilizzando questo protocolloTuttavia modifiche per garantire che il DNA non è ulteriormente degradata si consiglia. L&#39;uso di un vettore RNA come t RNA è raccomandato. Anche glicogeno può essere aggiunto come un vettore quando la concentrazione di DNA è bassa (&lt;200 ng). Perché il DNA isolato nei tessuti FFPE è già frammentata e ulteriore frammentazione avviene durante deaminazione, bisogna fare attenzione a ridurre al minimo un ulteriore degrado. Non frammenti di DNA ulteriormente prima di denaturazione e limitare il tempo di incubazione per la reazione bisolfito a 4 ore. Progettazione ampliconi non più grande di 300 bp a causa di DNA frammentato. Un altro fattore che può influenzare l&#39;amplificazione PCR che la conversione bisolfito di cytosines non metilato riduce la complessità del modello di DNA. Il seguente protocollo di progettazione fondo di cui al punto 4.1, lunghezza innesco aumentato e nested PCR possono contribuire ad aumentare la specificità e la resa della PCR. Infine, poiché il modello del DNA è alterato durante bisulphite di conversione, il bias di amplificazione può essere una preoccupazione. Assicurarsi che l&#39;amplificazione proporzionale PCR di modelli metilato e non metilato è verificata con un controllo 50/50 M / U mix di DNA, come indicato nel protocollo, si veda la Figura 3. Assicurarsi inoltre che l&#39;amplificazione dei modelli convertiti solo si sta verificando con enzima di restrizione HpaIII e elettroforesi su gel (Figura 3). Le condizioni di PCR può avere bisogno di essere ottimizzato variando la concentrazione di temperatura e / o magnesio o allungando il tempo di estensione. Alcuni modelli sembrano essere particolarmente problematico e la posizione del primer può essere necessario regolare o degenerare primer può essere necessario utilizzare. Prossima generazione di tecniche di sequenziamento sono in rapida evoluzione per ottenere una risoluzione simile a bisolfito di sequenziamento genomico, e la terza sequenza molecola singola generazione ha il potenziale per permettere l&#39;analisi di entrambe le primarie e la metilazione del DNA senza la necessità di sequenziamento bisolfito. Tuttavia, ampia disponibilità e specificheificity di queste tecniche rimangono ancora molto tempo. Sequenziamento genomico bisolfito è il gold standard per l&#39;analisi di metilazione ed è un protocollo robusto. Il metodo è progredita al punto in cui i problemi più comuni ed i limiti sono stati risolti e le applicazioni si sono ampliate dalle analisi di geni singoli throughput elevato e l&#39;analisi dell&#39;intero genoma descritta da Clark et al. 2006 4. Linee guida risoluzione dei problemi e ulteriori raccomandazioni sono riportate nella Tabella 1. Si suggerisce che l&#39;approccio migliore è quello di seguire inizialmente il protocollo standard e solo introdurre la modifica se e quando sorge un problema. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabella 2" /> Tabella 1. Linee Guida alla risoluzione dei problemi

<ol><li> Di sodio metabisolfito (Ajax Finechem) </li><li> Idrochinone (Merck) </li><li> Wizard DNA-clean-up del sistema (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenetica descrive le modifiche ereditabili nella funzione del gene che si verificano in modo indipendente per la sequenza del DNA. Le basi molecolari della regolazione genica epigenetica è complessa, ma riguarda essenzialmente modifiche alla stessa DNA o le proteine ​​con che associa DNA. La modifica predominante epigenetici del DNA nei genomi dei mammiferi è metilazione di nucleotidi citosina (5-MEC). Metilazione del DNA fornisce istruzioni alle macchine di espressione genica da dove e quando il gene deve essere espresso. La sequenza target primario per la metilazione del DNA nei mammiferi è 5&#39;-CpG-3 &#39;dinucleotidi (Figura 1). Dinucleotidi CpG non sono distribuite uniformemente in tutto il genoma, ma sono concentrati nelle regioni di sequenze genomiche CpG ripetitivi e &quot;isole&quot;, comunemente associato con i promotori dei geni (Figura 1). Metilazione del DNA sono nelle prime fasi di sviluppo, modulato durante la differenziazione dei tessuti specifici e interrotto in molti stati patologici tra cui il cancro. Per understand il ruolo biologico della metilazione del DNA e del suo ruolo nelle malattie umane, preciso, efficace e riproducibile i metodi sono necessari per rilevare e quantificare i singoli 5-MEC. Questo protocollo per la conversione di bisolfito è il &quot;gold standard&quot; per l&#39;analisi di metilazione del DNA e facilita l&#39;identificazione e quantificazione di metilazione del DNA a singolo nucleotide risoluzione. La chimica della citosina deaminazione da bisolfito di sodio comporta tre fasi (Figura 2). (1) solfonazione: L&#39;aggiunta di bisolfito al legame doppio 5-6 della citosina (2) Hydrolic deaminazione: deaminazione idrolitica del conseguente citosina-bisolfito derivati ​​per dare un uracile-bisolfito derivati ​​(3) Desulphonation Alcali: La rimozione del solfonato gruppo da un trattamento alcalino, per dare l&#39;uracile. Bisolfito deamina preferenzialmente citosina a uracile nel DNA a singolo filamento, mentre la 5-MEC, è refrattario al bisolfito-mediata deaminazione. Su PCR, uracile è amplificatocome timina mentre 5-MEC residui permangono come cytosines, permettendo CpG metilati deve essere distinta da CpG non metilato dalla presenza di una &quot;C&quot; contro citosina timina residuo &quot;T&quot; durante la sequenza. Modificazione del DNA mediante conversione bisolfito è una consolidata protocollo che può essere sfruttato per molti metodi di analisi di metilazione del DNA. Dal momento che la rilevazione di 5-MEC di conversione bisolfito per la prima volta dimostrato da Frommer et al. 1 e Clark et al. 2, basati su metodi di conversione bisolfito di conto DNA genomico per la maggior parte dei nuovi dati sulla metilazione del DNA. Diversi metodi di analisi post-PCR può essere utilizzata, a seconda del grado di specificità e risoluzione di metilazione richiesto. La clonazione e il sequenziamento è ancora il metodo più facilmente disponibile che può dare singolo nucleotide risoluzione per metilazione attraverso la molecola di DNA.

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DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Il gold standard per l&#39;analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l&#39;accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.

Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

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Research

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Biology

103.9K Views.  Garvan Institute of Medical Research. Il gold standard per l'analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l'accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.

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PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS fabbricazione del dispositivo e la modifica della superficie

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Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell&#39;endosperma

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Ridotto gravità ambiente hardware Dimostrazioni di un prototipo miniaturizzato Citofluorimetro e Companion Microfluidic tecnologia di miscelazione

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...