עבודה זו נתמכה על ידי OTKA (קרן הונגרית למחקר מדעי) D45933, T049621, ט (הונגריה מדע וטכנולוגיה קרן) A4/04, Arg-17/2006 ו SIN, Bolyai, מלגות Öveges ו TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 ו - 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. ברצוננו להודות Gesztes ויליאם למתן את הקריינות.

1. הכנת H9c2 תאים cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts עכברוש התקבלו ATCC (Wesel, גרמניה) התרחבה גלוקוז גבוהה (4.5 גר &#39;/ ל&#39;) DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. H9c2 התא קו myoblast נגזר לב עוברי חולדה, הוא משמש מודל במבחנה עבור השריר הן השלד לב 8,9. הכן 12 צלחת היטב H9c2 תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי H9c2 של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם 5 מ&quot;ל PBS ולעכל עם 2-3 מ&quot;ל 0.05% טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ&quot;ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30,000 זרעים H9c2 תאים 2 מ&quot;ל לכל DMEM גם בצלחת 12 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C-CO 2 באינקובטור למשך 24 שעות. </li></ol> 2. איסכמיה reperfusion סימולציה / איסכמיה / reperfusion היה מדומה במבחנה על ידי ביצוע גלוקוז חמצן קיפוח (OGD) H9c2 על תרביות תאים. הליך זה בוצע על הבמה של המיקרוסקופ confocal Zeiss עם מערכת תא הדגירה Pecon (Erbach, גרמניה) המאפשר תצפית של תאים במהלך OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה מהצלחת 12 היטב H9c2 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם תאים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל גלוקוז בינוני חינם לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך מערכת הדגירה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל גז חנקן לטהר את החמצן מחוץ למערכת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד לרמה של 0.5% חמצן מגיע ואז להפעיל את הטיימר. חמצן 0.5% כלומר כ 3 מ&quot;מ כספית מתח חלקי. תאים בכפוף 150 דקות של איסכמיה מדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של איסכמיה מדומה, להסיר את המדיום גלוקוז חופשי מן התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 מ&quot;ל בינוני תרבות נורמלי הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 12 היטב במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO 2 באינקובטור, זוהי &quot;תקופת reperfusion&quot;. </li></ol> 3. הכנת mesenchymal הצלה בתאי גזע מוח עצם ממקור אנושי נלקח T75 צלוחיות ו מדולל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בינוני תרבות המכיל 10% עוברית עגל בסרום (FCS), 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין ו 1 g / l גלוקוז. צלוחיות הודגרו ב 37 ° C באווירה humidified מלא של 5% CO 2 למשך 3 ימים. לאחר תקופת דגירה BMSCs דבקו פני השטח של צלוחיות ואת המרכיבים הנותרים של מח העצם בוטלו על ידי שטיפה עם PBS. BMSCs בשימוש היו בין 1 ל 5 קטעים הניסויים. IDENtity של תאים אושרה על ידי נוכחות של שושלת ספציפית משטח סמנים תא עם cytometry הזרימה. Hematopoietic linage הסמנים הספציפיים פני השטח (CD34, CD45) ו סמנים משטח mesenchymal (CD73, CD90, CD105 ו CD166) נחקרו. במהלך איסכמיה מדומה, להכין הצלה בתאי גזע mesenchymal להשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את צבע פלואורסצנטי Vybrant האם ביחס 1:200 במדיום תרבות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני מתאי הצלה להוסיף 300 DMEM μl עם Vybrant עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי של בתאי גזע mesenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם 5 מ&quot;ל PBS ולעכל עם 2-3 מ&quot;ל 0.05% טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ&quot;ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות בסוף reperfusion להוסיף 20,000 בתאי גזע mesenchymal לכל היטב את H9c2 myoblasts postischemic לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שיתוף התרבות של תאים לתוך 37 ° C-CO 2 באינקובטור למשך 24 שעות. </li></ol> 4. ניתוח עם מיקרוסקופיה confocal לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות לשטוף תאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים פתרון 500 גר / מת μl לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 4 תאים / מ&quot;ל). </li></ol> ההערכה של תמונות confocal עבור תאים חיים ומתים נבחר על ידי המורפולוגיה הקרינה ניתן לבצע עם התוכנה ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה&quot;ב). במקרה של גO-תרבויות, MSCs ניתן להבחין בין תאים H9c2 בשל Vybrant תיוג שלהם תא האם. היחס של תאים מתים ניתן להעריך ב 4 שדות עצמאית של תצוגה (אובייקטיבי 10x) עבור כל תרבות בצורה עיוורת 10. H9c2 cardiomyoblasts תרבותי coverslips על 42 מ&quot;מ זכוכית יכול גם להיחקר עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו במהלך ואחרי פציעה איסכמיה / reperfusion באמצעות מערכת תא הדגירה של המיקרוסקופ confocal. תא אל תא אינטראקציות כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר ניתן ללמוד לאורך זמן. 5. ניתוח עם זרימת cytometry לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, קציר התקשורת והתרבות. חשוב מאוד לאסוף את המדיום תרבות גם בגלל כמה תאים מתים יכול להיות מנותקת מן השטח צלחת תרבות incuba במהלך 24 שעותtion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם תאים PBS ולעכל עם 0.05% טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא עם טריפסין בינוני תרבות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים המדיום תרבות שנקטפו ב 1200 סל&quot;ד (בערך 150-200 גרם) במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בתמיסה 500 גר / מת μL לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 4 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לזרום צינורות cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה Pro CellQuest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את זרימת cytometer למדידה, בקרה להכין דגימות של תאים חיים ומתים. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H9c2 פלייט תאים בצפיפות של 3x10 4 ב 12 גם צלחות כפי שמתואר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לחיות עם trypsinisation שולטת תא בודד כמתואר נקודה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שולטת תאים מתים על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר H 2 O 2 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר trypsinisation, resuspenד חי ושולט התא מת פתרון 500 גר / מת μl צבען (5 nM calcein-AM ו - 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות המכשיר צריך להיות מותאם כך התאים החיים הם חיוביים calcein ו ethidium homodimer שלילי, בעוד תאים מתים הם שליליים calcein ו ethidium homodimer חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האחוז של אוכלוסיות אלה ניתן לבטא ברים על הגרף וניתוח סטטיסטי יכול להתבצע על ערכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את קבוצות הניסוי השונות. </li></ol> 6. נציג תוצאות: התוצאות שלנו הראו כי הוסיף בתאי גזע mesenchymal יכול לשפר את ההישרדות של תאים לב postischemic. תמונות מיקרוסקופיה confocal חשף ישיר התא אל התא אינטראקציות, כגון חיבור קרום חלקי או צינורות אינטר, אשר ככל הנראה תפקיד חשוב בהגנה על נצפו 10. צינורות אלה משתרעים על פני מרחקים של התא ד מספרiameters, בקטרים ​​שלהם היו בין 200 ל 500 ננומטר (חצים לבנים). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. היווצרות Nanotube בין תאים. היווצרות Nanotube (חץ לבן) נצפתה בין cardiomyoblasts Vybrant Dio שכותרתו ועשה Vybrant תאים שכותרתו mesenchymal גזע. Cytometry ניתוח תזרים הראה את אוכלוסיות לשרוד cardiomyoblasts נמקי ותאי גזע mesenchymal. מעניין, אנחנו גם ציין שלישי, &quot;פצוע&quot; cardiomyoblast תא האוכלוסייה שהכיל calcein אך הכיל גם את החיווי של תאים מתים, ethidium homodimer (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. נציג הדוט העלילה של אוכלוסיות תאים שונות לאחר איסכמיה מדומה. ההערכה של מספר ניסויים shoד &#39;כי תוספת של תא גזע mesenchymal כדי cardiomyoblast H9c2 postischemic גדל באופן משמעותי את אחוז התאים החיים לעומת myoblasts לב בתרבית לבד לאחר איסכמיה (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="איור 3" /> באיור 3. . השפעת הטיפול בתאי גזע על cardiomyoblasts postischemic אחוז תאים חיים צומצם משמעותית לאחר איסכמיה מדומה לעומת שליטה (שליטה מול IR דגם: 90.36 ± 2.60 לעומת 10.52 ± 0.48, *** p&gt; 0.001), שגברה לאחר תוספת של בתאי גזע mesenchymal (IR מודל מול IR + BMSC: 10.52 ± 0.48 לעומת 25.21 ± 2.13, *** p&gt; 0.001). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי של הנתונים בוצע באמצעות חד סטרי ניתוח שונות עם פוסט השוואה של מספר טיוקי הוק הבדיקה.

<ol>
	<li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction.">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li><li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases:+A+review.">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li><li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside.">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li><li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-based+CD133++cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy.">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li><li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research.">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li><li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair:+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche.">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, S21-S21 (2007).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li><li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death.">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li><li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+biochemical,+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+(H9c2)+line+from+rat+heart.">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li><li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections.">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li><li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia.">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li><li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes.">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li><li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/Reoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line.">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li><li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+(oxygen-glucose+deprivation)+models.">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li><li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies.">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology &#38; Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li><li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury.">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li><li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia/Reperfusion+Conditions.">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li><li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro.">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול הפגינו הוא בגישה חוץ גופית לנושא הרבה יותר מורכב של טיפול בתאי גזע של אוטם שריר הלב, עם כל היתרונות והחסרונות של מודל כזה. ברור שזה לא יכול לשקף את מורכבות (למשל, מערכת החיסון) האירועים המתרחשים במהלך ואחרי האוטם בשריר הלב, אך ניתן למקד את ההשפעות הישירות של תא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> calcein-AM </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ethidium homodimer-2 </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> האם Vybrant </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הדגירה Pecon תא מערכת מיקרוסקופים Zeiss </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> 2. טבלה ציוד.

stem cell transplantation in an in vitro simulated ischemia/reperfusion model

השתלת תא גזע פרוטוקולים מוצאים את דרכם לתוך הפרקטיקה הקלינית 1,2,3. קבלת תוצאות טובות יותר, מה שהופך את הפרוטוקולים חזקים יותר, ולמצוא מקורות חדשים עבור תאים להשתלה הם מוקד של מחקר שנעשה לאחרונה 4,5. בחינת היעילות של טיפולים בתא אינה משימה קלה, כלים חדשים נדרשים כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בתהליך הטיפול 6. תכננו פרוטוקול הניסוי של איסכמיה / reperfusion כדי לאפשר תצפית של חיבורי הסלולר מנגנוני subcellular גם במהלך הפציעה איסכמיה / reperfusion ואחרי השתלת תא גזע כדי להעריך את היעילות של טיפול בתא. H9c2 תאים cardiomyoblast הונחו על תרבות צלחות התא 7,8. איסכמיה היה מדומה עם 150 דקות בתווך גלוקוז חופשי עם רמת חמצן מתחת 0.5%. ואז, מדיה נורמלי רמות החמצן היו מחדש כדי לדמות reperfusion. לאחר שלילת חמצן גלוקוז,התאים שנפגעו טופלו השתלה של מח עצמות אדם נגזר תווית בתאי גזע mesenchymal ידי הוספתם התרבות. בתאי גזע mesenchymal עדיפים בניסויים קליניים משום שהם נגישים בקלות עם ניתוח פולשני מינימלי, ניתן להרחבה בקלות עצמיים. לאחר 24 שעות של עיבוד משותף, התאים היו מוכתמות calcein ו-ethidium homodimer להבדיל בין תאים חיים ומתים. התקנה זו מאפשרת לנו לחקור את הקשרים אינטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ו לכמת את שיעור ההישרדות של תאים postischemic ידי cytometry הזרימה. מיקרוסקופיה Confocal הראה את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות תאים כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר. Cytometry ניתוח תזרים חשף 3 אשכולות של תאים פגומים אשר ניתן להתוות על הגרף ונותחו סטטיסטית. אוכלוסיות אלה יכולים להיחקר בנפרד ניתן להסיק על נתונים אלה על האפקטיביות של סימולציהtherapeutical גישה.

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model at JoVE.com

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

אנו מדגימים כיצד להקים<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה / reperfusion מודל כיצד להעריך את ההשפעה של טיפול בתאי גזע לתאי לב על postischemic.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

14.0K Views.  Semmelweis University. אנו מדגימים כיצד להקים במבחנה איסכמיה / reperfusion מודל כיצד להעריך את ההשפעה של טיפול בתאי גזע לתאי לב על postischemic.

Video: Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

דגם איסכמיה reperfusion של פגיעה חריפה בכליות ופגיעים ההודעה פיברוזיס בעכברים

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

שתיים, כלי סגר דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

מודל מפרה קליני לחקר איסכמיה-reperfusion פציעה במיקרו-כירורגיה משחזרת

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...