Os autores gostariam de agradecer o Dr. Thomas Boland para a idéia de usar as impressoras HP Deskjet para impressão célula. O financiamento para este projeto da NSF RII-EPS 0903795 e NIH K25 HL0922280.

1. Convertendo o HP DeskJet 500 Deve notar-se que esta técnica deve trabalhar com muitas impressoras de jacto de tinta comercialmente. No entanto, as impressoras mais velhos tendem a funcionar melhor como eles usam os cartuchos de tinta com bicos de maior diâmetro, o que não entupir tão facilmente. Além disso, as impressoras mais velhos tendem a utilizar sensores mecânicos de alimentação de papel que são mais fáceis de contornar. Impressoras com sensores ópticos pode ser enganado, mas com uma pequena tira de papel na extremidade da impressora durante cada ciclo, mas é um pouco mais difícil do que o sistema mecânico de &quot;truque&quot;. As impressoras que estão atualmente disponíveis no mercado que funcionam melhor em baixa resolução (DPI). Impressoras de alta resolução tendem a obstruir mais facilmente. A resolução da HP Deskjet 500 é 300 DPI. Há muitas impressoras disponíveis no mercado (HP Deskjet série e outros) que têm uma resolução de 600 DPI. Este tipo de impressora pode ser usado com apenas um pequeno aumento no bocalentupimento questões que podem ser atenuadas com limpeza cuidadosa (seção 3). <ol><li> Remova a tampa plástica caso da impressora, desbloqueando vários clips de plástico a partir da base inferior da impressora e, lentamente, levantando a fora superior. </li><li> Desaperte painel luminoso do botão / display de cima da impressora, deixando-o ligado à placa-mãe da impressora. </li><li> Limpar o interior da impressora, especialmente as áreas onde o cartucho de tinta repousa e onde ocorre impressão. </li><li> Localize os cabos que fornecem energia para os mecanismos de alimentação de papel e desligue-os da mãe. <ol><li> Na HP DeskJet 500, estes se encontram logo abaixo do tabuleiro de papel para a esquerda da frente. </li></ol></li><li> Localizar mecanismo de detecção de papel. Ignorar o mecanismo pela aposição de um barbante ou fio de loop para servir como uma alça de puxar manual. <ol><li> Na HP DeskJet 500, o mecanismo de detecção de papel é uma alavanca em plástico cinzento encontrada acima e atrás do mecanismo de alimentação de impressão / papel. </li></ol></li><li> Criar uma fase à frente do mecanismo de alimentação de papel (onde o papel seriam alimentados a partir de e depositada) a fim de trazer as lâminas de impressão desejadas para um nível abaixo da cabeça de impressão do cartucho. <ol><li> Para as nossas experiências, o detentor do transporte de espuma para tubos de centrífuga de 15 ml foi utilizado com várias lâminas de microscópio gravadas no lugar da região de impressão para trazer o nível final das lâminas para a altura desejada. </li></ol></li><li> Para manter a técnica asséptica, a impressora pode ser colocado dentro de um gabinete padrão de risco biológico ou capuz mesa de fluxo laminar. </li><li> É importante notar que a modificação de um comercialmente disponível impressora de jacto de tinta será geralmente anular a garantia da impressora fabricante. </li></ol> 2. Conversão de ações da HP de cartuchos de tinta HP 26 (cartucho de tinta preto) <ol><li> Remova o cartucho de sua embalagem, deixando a fita protetora que cobre os contatos da impressora ea cabeça de impressão para o momento. </li><li> Estabilizar o corpodo cartucho (parte preta) ou com uma pinça ou vício (simplesmente segurando firmemente o cartucho pela mão geralmente funcionou tão bem), deixando clara a verde cima de qualquer obstáculo. </li><li> Utilizando um alicate ou uma chave ajustável, puxe a parte superior verde do cartucho e torcer frente e para trás várias vezes até que ele se liberta. <ol><li> Isto não deve levar muita força, mas o topo não é mais necessário, por isso é ok se quebra quando removê-lo. </li></ol></li><li> Usando chaves de fenda, retire o pedaço de plástico transparente agora exposta. <ol><li> Novamente, isto não deve ter muita força, mas não vai ser necessário, por isso é bom em caso de quebra durante a remoção. </li></ol></li><li> Esvaziar qualquer remanescente a partir do reservatório. </li><li> Remova a fita plástica cobrindo os contatos da impressora ea cabeça de impressão. </li><li> Lavar bem os reservatórios com água. <ol><li> Usar uma pipeta ou uma seringa para empurrar a água através dos canais. </li><li> A água provavelmente vai vazar da cabeça de impressão duranteNeste processo, o que é aceitável, e não causa qualquer dano para a funcionalidade do cartucho. </li></ol></li><li> Quando a água corre claro, permitir que o cartucho para secar. </li></ol> 3. Limpeza Tinteiro <ol><li> A fim de manter um ambiente de impressão limpo, o cartucho de tinta deve ser limpo antes e após a utilização. <ol><li> Isto também ajuda a evitar com cristalização de sais e outro material biológico no cartucho que poderia causar bloqueios. </li></ol></li><li> Totalmente submergir o cartucho num copo cheio de água desionizada, e sonicar durante 15 minutos antes e após a impressão. </li><li> Após sonicação, remover o cartucho da água, e agitar para fora o excesso de água. </li><li> Pulverização de etanol 70% para dentro do cartucho para criar um ambiente mais asséptico. <ol><li> Assegurar que o etanol foi seca antes da adição da solução de impressão bioink. </li></ol></li></ol> 4. Fazer Suspensão Cell - &quot;Biotinta &quot; <ol><li> Células em cultura até o momento de passagem. <ol><li> Para fibroblastos 3T3: células de sementes em frascos T-75 a cerca de 1.3x10 4 células / cm 2 no Dulbecco Modificado Eagles (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Células de cultura para dois dias numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Fazer solução stock fluorescente g-actina em concentração de 50 ug / ml em solução de tampão fosfato (PBS). </li><li> Células de passagem. <ol><li> Para fibroblastos 3T3: Remova a mídia de frasco e lavar duas vezes com PBS. Cobrir as células com 5 ml de 0,25% de tripsina + EDTA e incubar durante 5 min. </li><li> Adicionar 5 ml de meio fresco e pipetar a suspensão da célula em um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Aspirado gasto médio. </li></ol></li><li> Ressuspender as células em PBS com fluorescente de solução stock g-actina para criar bioink. <ol><li> Bioink deve ter uma concentração final de G-actina de 10 ug / ml e um co célulancentration de 1x10 5 células / ml. Esta concentração foi otimizado para limitar a quantidade de células por queda e entupimento da cabeça de impressão 8. </li><li> Note-se que 250 uL de bioink imprime três lamelas com o padrão mostrado na Figura 2. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Ligue e deixe a impressora aquecer. </li><li> Local desejado superfície de impressão (aqui, usamos 22 mm x 22 mm lamelas) no centro da fase preparado no passo 1.6. </li><li> Crie um arquivo padrão de impressão. <ol><li> Abra o Microsoft Word (ou qualquer outro software de desenho), e desenhar o padrão desejado. </li><li> Escolha um padrão de impressão desejada para a impressão de célula no arquivo premade. </li></ol></li><li> Carregar o cartucho preparada com a suspensão de célula desejado. <ol><li> Pipetar suspensão para as pequenas circular bem na parte inferior do compartimento de cartucho. Use aproximadamente 100-120 ml de solução. O tamanho de gota é de cerca de 130 impresso8 picolitros. </li></ol></li><li> Imprima o arquivo com a HP Deskjet 500 Printer. <ol><li> Para melhores resultados, imprimir padrões menores várias vezes (5), por alteração da quantidade de cópias desejadas no programa de processamento de texto. </li></ol></li><li> Printer vai esquentar de novo, então cartucho vai mover para a posição &quot;pronto&quot;. </li><li> Quando cartucho se move para a posição de pronto (ligeiramente para a esquerda do gotejamento tinta bem abaixo e permanece aí), puxar para cima sobre o fio mecanismo de alimentação de papel, e de impressão deve ser iniciada. <ol><li> Para várias cópias do impressão, o mecanismo de alimentação de papel terá de ser libertado depois de cada ciclo, ou página impressa. O cartucho irá retornar para a posição &quot;pronto&quot;, eo papel do fio mecanismo de alimentação deve ser aumentada novamente. </li></ol></li><li> A impressora vai imprimir sobre a lamela colocado no centro da fase de impressão na etapa 5,2 (ver Figura 2). </li></ol> 6. Resultados representativos &lt;/ P&gt; Os resultados representativos do processo de conversão inteira de uma norma, off-the-shelf HP Deskjet 500, padrão HP 26 cartuchos série irá criar uma impressora com capacidade de impressão de soluções de celulares para muitos tipos de análise como mencionado anteriormente. A impressora concluída após a conversão é mostrado na Figura 3, com uma fase de impressão para colocar o lamela de microscópio em. A impressora pode ser útil em análise em muitos campos, incluindo, mas não se limitam a: simples mecânica de células, engenharia de tecidos, a transfecção de genes, micropatterning biossensor, e terapias de células directos 1-10, 16-22. Neste exemplo, uma impressora HP Deskjet 500 impressora e cartuchos de tinta HP 26 da série foram modificadas para bioprinting. Utilizando esta configuração impressora com um bioink consistindo de uma suspensão de células de fibroblastos em uma solução de monómero G-actina, as células foram impressas em lamelas de vidro para microscópio. A Figura 1 ilustra res representativos<html> ÜLTS de células de fibroblastos impressos, que mostram incorporados monómeros de actina fluorescentes. Os resultados foram obtidos num ambiente controlado asséptica na qual as células foram impressas em padrões de personalização. O padrão usado neste exemplo foi criado no Microsoft Word (Figura 2). Este padrão criada uma linha contínua da solução de impressão em toda a maioria da lâmina de microscópio. A Figura 4 mostra a linha recta na qual o bioink e as células são mutuamente depositado. Deve notar-se que, imediatamente após a impressão, há um aumento de fluorescência de fundo, porque a solução bioink, no qual as células são suspensas, contém livres excesso monómeros de actina fluorescentes. Esta fluorescência de fundo diminui significativamente após a adição de meios de crescimento nas células (Figura 1), que lava monómero excesso a partir do substrato. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Imagens representativos de fibroblastos 3T3 de 3 horas após a impressão usando a impressora de jacto de tinta modificada. O interior das células mostram incorporados monómeros de actina fluorescente etiquetado. Barras de escala representam 50 um. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Figura 2. Projeto usado para imprimir bioink. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Figura 3. Printer após a conversão com o estágio de isopor. O fio de laranja no meio ignora o papel sensor de alavanca de alimentação. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem representativas de fibroblastos 3T3 impressas em uma zona de impressão localizada. Imagem de microscopia retiradas 5 minutos após a impressão, com ampliação de 20x. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Imagem de fluorescência (ampliação de 40x) tomado 3 horas após a impressão a exibir um fibroblasto com internalizadas monómeros de actina fluorescentes. Barra de escala representa 50 um. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> Figura 6. Microscopia de fluorescência (ampliação de 20x) de uma célula tomado 15 minutos após a impressão. A imagem mostra tanto g-actina (verde) eo núcleo (azul). Da esquerda para a direita: g-actina com Alexa Fluor 488, núcleo com DAPI, e uma sobreposição de ambos. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> Figura 7. Microscopia de fluorescência mostrando dois fibroblastos em um padrão de linha de 3 horas após a impressão. Imagem do lado esquerdo mostra monómeros de actina fluorescente etiquetado dentro das células. Imagem à direita é uma sobreposição do canal fluorescente com a imagem de fundo para mostrar que, emborapode haver alguns detritos na corrediça (canto inferior esquerdo), não fluorescente. Barras de escala representam 50 um se não o tamanho indicado a extrema-direita é um grupo controle de não-impressos células incubadas por 3 horas com monômeros fluorescente etiquetado. Este controlo é mostrar que os monómeros não pode penetrar a membrana da célula sem permeabilização da membrana através de impressão célula.

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Não temos nada a divulgar.

O processo para converter uma impressora jato de tinta para desktop padrão bioprinting não é particularmente difícil. O passo mais difícil é determinar a forma de contornar o mecanismo de alimentação de papel, que é dependente da marca e modelo de impressora usado. No entanto, isso é relativamente simples quando o sensor de alimentação de papel é mecânico como descrito aqui. Para os modelos com sensores ópticos de alimentação, outras técnicas podem precisar de ser empregada para enganar a impressora em pensar que está usando papel, por exemplo, pode-se executar um pequeno pedaço de papel através da impressora, enquanto ele imprime na lâmina de microscópio. Ignorando o mecanismo de alimentação de papel é provável que seja o passo mais difícil na aplicação destes procedimentos para diferentes modelos de impressoras. Ao construir uma fase para segurar as lamelas para impressão, é importante para garantir o alinhamento correcto ea altura. A fase deve permitir a lamela para ser colocado no meio da área de impressão. Além disso, deve-se plÁs lamela a uma altura adequada para permitir uma folga para o cartucho de tinta para passar sobre a lâmina sem interromper-lo. A altura exacta da fase dependerá do modelo da impressora. Para assegurar que as células não são impressos lavados, as lâminas foram colocadas numa incubadora imediatamente após a impressão, durante aproximadamente 30 minutos para permitir a ligação de células antes de meios de crescimento adicionais de células foi adicionado. Como as células foram impressas em uma solução que inclui grandes quantidades de PBS as células não secar e permaneceu viável. As células foram visualizados utilizando microscopia de fluorescência para visualizar a distribuição dos etiquetados g de actina-monómeros dentro da célula (Figuras 1, 5-7). Quando a impressão com fibroblastos 3T3, a Figura 5 mostra um resultado representativo, com a actina causando muito da célula para fluorescência, mas mostrando linhas de brilho aumentado. A incorporação de fluorescentemente marcado g-actina no citoesqueleto éútil para o estudo da dinâmica do citoesqueleto e mecânicos celulares. 12-15 Uma limitação desta técnica é que ela só é aplicável para moléculas e proteínas que têm diâmetros menores do que cerca de 10 nm. Para assegurar que as células foram realmente a ser processado pela impressora convertido, DAPI (1:5000 em PBS) foi adicionada à bioink no lugar de metade do volume de PBS puro. O DAPI fluorescente mancha liga-se a porções de aminoácidos ricas de DNA localizados no núcleo. Portanto DAPI é uma mancha útil na fluorescência núcleos das células de imagem impressos. A Figura 6 mostra uma imagem representativa de uma célula apresentando tanto Alexa Fluor 488 (actina) e DAPI de fluorescência (núcleo) com uma imagem de sobreposição de ambos. Figura 7 ilustra também como as células fluorescem uma vez que os monómeros de actina-g foram incorporadas enquanto não biológico material que foi depositado na amostra não fluorescência devido à absence de G-actina monómeros. Uma consideração importante para bioprinting é os meios aquosos sendo usados ​​para a bioink. Verificou-se que a utilização de meios de crescimento de células normais com soro produziu resultados inconsistentes. Isso é mais provável devido ao entupimento dos bicos da cabeça de impressão de proteínas séricas. A utilização de PBS aumentou a consistência de padrões impressos e do número de células depositadas. Uma desvantagem de usar PBS é que as células não deve ser deixado na suspensão por períodos prolongados de tempo. No entanto, fibroblastos em estes exemplos foram capazes de tolerar as condições bioink para pelo menos uma hora, sem qualquer alteração da viabilidade celular. Isto é consistente com várias conclusões anteriores, que relatam que as células impressas por meio de mecanismos de jacto de tinta térmicos têm sido demonstrado que têm taxas de viabilidade elevadas. 2-8 Esta configuração da impressora modificado pode ser utilizado para outras aplicações do que a impressão célula. 16-22 proteínas da matriz, tais como colagénio ou fibronectin, pode ser facilmente impressa sobre substratos com esta técnica, que pode ser útil para padronização célula. Por exemplo tipo de colagénio, I impresso em padrões de linhas irá resultar em substratos de colagénio alinhadas que podem ser utilizados em estudos de cultura in vitro de células. 17 Além das proteínas da matriz, outras moléculas, incluindo factores de crescimento, pode ser fiavelmente localizada sobre substratos para estudos de células e potenciais aplicações terapêuticas. de 18 Uma limitação importante na concepção do descrito nas etapas acima é que esta impressora não é capaz de imprimir em mais de uma dimensão. Isto limita o potencial para a utilização em aplicações tais como a impressão estampados andaime. Para permitir a impressão em 3D, uma fase especializado precisa de ser utilizado. O estágio precisa ter ajustes de altura incrementais para camada por camada, deposição de bioink. Bioprinting mostrou a promessa como um método eficiente e custo-eficaz para a engenharia de tecidos, Fabricação gene micropatterning transfecção e microarray 1-12, 16-22 As aplicações futuras deste tipo de dispositivo são numerosos, incluindo:. Criação de controlados e padronizados microambientes celulares, incorporação de macromoléculas no citoplasma da célula, e deposição de células para andaimes e estruturas que não ocorrem naturalmente ou de forma eficiente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> HP DeskJet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Descontinuado do fabricante. Comprado remodelado Trader dezembro </td></tr><tr><td> HP 26 Cartucho de tinta preto </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> Actina de músculo de coelho, conjugado com Alexa Fluor 488, 200 mg </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) </td><td> Biomedicals MP </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado Eagles (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> A anfotericina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Usado em 0,5% em meio de cultura de células </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Usado em 0,5% em meio de cultura de células </td></tr><tr><td> Bench fluxo unidirecional Limpo </td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td> Habitação opcional para impressora mantendo asséptica </td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprinting tem uma vasta gama de aplicações e de significância, incluindo a engenharia de tecidos, as terapias de aplicação directa de células, e microfabricação biossensor. 1-10 Recentemente, a impressão a jacto de tinta térmica também tem sido utilizado para a transfecção de genes. 8,9 O processo de impressão a jacto de tinta térmica foi mostrado para interromper temporariamente as membranas celulares, sem afectar a viabilidade celular. Os poros transientes na membrana pode ser usada para introduzir moléculas, que de outra forma seriam demasiado grande para passar através da membrana, para o citoplasma da célula. 8,9,11 A aplicação a ser demonstrado aqui é o uso de impressão a jacto de tinta térmica para a incorporação de fluorescente etiquetado G-actina em células monómeros. A vantagem de utilizar a impressão por jacto de tinta térmica para injectar moléculas nas células é que a técnica é relativamente benigna para as células. 8, a viabilidade celular 12 após a impressão tem sido demonstrado ser semelhante ao padrão de células PLAting métodos 1,8. Além disso, a impressão a jacto de tinta pode processar milhares de células em minutos, que é muito mais rápido do que microinjecção manual. Os poros criados por impressão têm sido mostrados para fechar dentro de cerca de duas horas. No entanto, existe um limite para o tamanho do poro criado (~ 10 nm), com esta técnica de impressão, o que limita a técnica de injecção com células pequenas proteínas e / ou partículas. 8,9,11 Um padrão de HP DeskJet 500 impressora foi modificado para permitir a impressão célula. 3, 5, 8 A tampa da impressora foi removido eo mecanismo de alimentação de papel foi contornado usando uma alavanca mecânica. Um palco foi criado para permitir a colocação de lâminas de microscópio e lamínulas diretamente sob a cabeça de impressão. Os cartuchos de tinta foram abertos, a tinta foi removido e foram limpos antes da utilização com as células. O padrão de impressão foi criado usando o software de desenho padrão, que então controlava a impressora através de um comando de impressão simples. Fibro 3T3blastos foram cultivadas até à confluência, tripsinizadas e, em seguida ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato com solúveis fluorescente etiquetado g de actina-monómeros. A suspensão de células foi pipetado para dentro do cartucho de tinta e as linhas de células foram impressas em lapsos de vidro de cobertura do microscópio. As células vivas foram fotografadas usando a microscopia de fluorescência e actina foi encontrado por todo o citoplasma. Incorporação de actina fluorescente para dentro da célula permite a criação de imagens de curto tempo dinâmica do citoesqueleto e é útil para uma vasta gama de aplicações. 13-15

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Uma descrição dos métodos utilizados para converter uma HP DeskJet 500 impressora em um bioprinter. A impressora é capaz de processar as células vivas, o que provoca poros transientes na membrana. Estes poros pode ser utilizada para incorporar pequenas moléculas, incluindo fluorescente G-actina, para dentro das células impressas.

Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K visualizações.  Clemson University. Uma descrição dos métodos utilizados para converter uma HP DeskJet 500 impressora em um bioprinter. A impressora é capaz de processar as células vivas, o que provoca poros transientes na membrana. Estes poros pode ser utilizada para incorporar pequenas moléculas, incluindo fluorescente G-actina, para dentro das células impressas.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desenvolvimento personalizado Ovário de Hamster Chinês hospedar-Cell ensaios de proteína utilizando a Tecnologia micropartícula Acústico Membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Bioengenharia

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentar os rendimentos cDNA Single-cell quantidades de mRNA em Laboratório Padrão Reações transcriptase reversa usando Microstreaming Acústico

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.