Los autores desean agradecer al Dr. Thomas Boland, de la idea de utilizar las impresoras HP Deskjet para la impresión de la célula. La financiación de este proyecto de la NSF-RII EPS 0903795 y NIH K25 HL0922280.

1. La conversión de la HP Deskjet 500 Cabe señalar que esta técnica debe trabajar con muchas impresoras de inyección de tinta comercialmente. Sin embargo, las impresoras más antiguas tienden a funcionar mejor ya que utilizan cartuchos de tinta con boquillas de mayor diámetro, los cuales no obstruir con la misma facilidad. Además, las impresoras más antiguas tienden a utilizar sensores mecánicos de alimentación de papel que son más fáciles de sortear. Las impresoras con sensores ópticos pueden ser engañados, pero con una pequeña tira de papel en el extremo más alejado de la impresora en cada ciclo, pero es un poco más difícil que el sistema mecánico de &quot;engañar&quot;. Las impresoras actualmente disponibles en el mercado que mejor funcionan tienen una resolución baja (DPI). Más altos de resolución de las impresoras tienden a obstruir con mayor facilidad. La resolución de la impresora HP Deskjet 500 es de 300 DPI. Hay muchas impresoras disponibles en el mercado (HP Deskjet serie y otros) que tienen una resolución de 600 DPI. Este tipo de impresora se puede utilizar con sólo un pequeño aumento en la boquillaobstrucción de las cuestiones que pueden aliviarse con una limpieza cuidadosa (sección 3). <ol><li> Quite la cubierta superior de plástico de la impresora mediante el desbloqueo de algunos clips de plástico de la base inferior de la impresora y levantando lentamente la parte superior fuera. </li><li> Desenrosque el botón / luz de la pantalla del panel de la parte superior de la impresora, dejándolo conectado a la placa base de la impresora. </li><li> Limpiar el interior de la impresora, especialmente las áreas donde se asienta el cartucho de tinta y donde se produce la impresión. </li><li> Ubique los cables que suministran energía a los mecanismos de alimentación de papel y desconectar de la placa base. <ol><li> En el HP DeskJet 500, éstos se encuentran justo debajo de la bandeja de papel hacia la izquierda de la parte delantera. </li></ol></li><li> Busque mecanismo de detección de papel. Omitir el mecanismo de fijación por una cuerda o lazo de alambre para servir como un mango de tracción manual. <ol><li> En el HP DeskJet 500, el mecanismo de detección de papel es una palanca de plástico gris encuentra por encima y detrás del mecanismo de alimentación de impresión / papel. </li></ol></li><li> Crear un escenario delante del mecanismo de alimentación de papel (donde el papel se alimenta desde y depositados) con el fin de llevar las diapositivas de impresión deseados a un nivel justo por debajo del cabezal de impresión del cartucho. <ol><li> Para nuestros experimentos, el titular de embalaje de espuma para los tubos de 15 ml de centrífuga se utiliza con varios portaobjetos en el lugar correspondiente en la región de impresión para que el nivel final de las diapositivas a la altura deseada. </li></ol></li><li> Para mantener la técnica aséptica, la impresora puede ser colocada dentro de un gabinete estándar de riesgo biológico o una campana de flujo laminar de mesa. </li><li> Es importante señalar que la modificación de un comercialmente disponible de chorro de tinta por lo general se anulará la garantía de la impresora fabricante. </li></ol> 2. Conversión de las imágenes de archivo cartuchos de tinta HP (HP 26 cartucho de tinta Negro) <ol><li> Retire el cartucho de su embalaje, dejando la cinta protectora que cubre los contactos de la impresora y el cabezal de impresión, por el momento. </li><li> Estabilizar el cuerpodel cartucho (parte de color negro) o bien con una pinza o tornillo de banco (simplemente toma firmemente el cartucho de la mano por lo general funcionado tan bien), dejando el verde claro encima de cualquier obstáculo. </li><li> Con unos alicates o una llave ajustable, tome la parte superior verde bajo el cartucho y gire hacia atrás y adelante varias veces hasta que se libera. <ol><li> Esto no debería tener mucha fuerza, pero la parte superior ya no es necesaria, por lo que está bien si se rompe al sacarlo. </li></ol></li><li> Uso de destornilladores, saque la pieza de plástico transparente ahora expuestos. <ol><li> Una vez más, esto no debería tener mucha fuerza, pero no será necesaria, por lo que está bien si se rompe durante la extracción. </li></ol></li><li> Vacíe cualquier resto del depósito. </li><li> Retire la cinta protectora de plástico que cubre los contactos de la impresora y la cabeza de impresión. </li><li> Lavar los depósitos con agua. <ol><li> Utilice una pipeta o una jeringa para empujar el agua a través de los canales. </li><li> El agua es probable que escape de la cabeza de impresión duranteeste proceso, lo que es aceptable, y no causa ningún daño a la funcionalidad del cartucho. </li></ol></li><li> Cuando el agua salga clara, permita que el cartucho se seque. </li></ol> 3. Limpieza de cartuchos de tinta <ol><li> A fin de mantener un ambiente de impresión limpio, el cartucho de tinta debe ser limpiado antes y después del uso. <ol><li> Esto también ayuda a evitar la cristalización de las sales y otros materiales biológicos en el cartucho que podrían causar obstrucciones. </li></ol></li><li> Totalmente sumergir el cartucho en un vaso lleno de agua desionizada, y sonicar durante 15 minutos antes y después de la impresión. </li><li> Después de ultrasonidos, retire el cartucho del agua, y sacuda el exceso de agua. </li><li> Aerosol etanol 70% en el cartucho para crear un ambiente más aséptico. <ol><li> Asegúrese de que el etanol se ha secado antes de añadir la solución de impresión bioink. </li></ol></li></ol> 4. Hacer que la suspensión de la célula - &quot;Biotinta &quot; <ol><li> Las células de cultivo hasta el momento de pasaje. <ol><li> Para los fibroblastos 3T3: las células de semillas en matraces T-75 a unos 1.3x10 4 células / cm 2 en Dulbeccos Eagles medio modificado (DMEM) con suero fetal bovino al 10% (FBS). Las células de cultivo para dos días en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Hacer fluorescente g-actina solución madre a una concentración de 50 ug / ml en solución tampón de fosfato (PBS). </li><li> Las células de paso. <ol><li> Para los fibroblastos 3T3: Quite el papel del matraz y enjuagar dos veces con PBS. Cubrir las células con 5 ml de 0,25% de tripsina + EDTA y se incuba durante 5 minutos. </li><li> Añadir 5 ml de medio fresco y pipetear la suspensión de células en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Aspirar pasado medio. </li></ol></li><li> Resuspender las células en PBS con una solución fluorescente de acciones del G-actina para crear bioink. <ol><li> Bioink debe tener una concentración final de g-actina de 10 ug / ml y un co célulancentration de 1x10 5 células / ml. Esta concentración se ha optimizado para limitar la cantidad de células por gota y la obstrucción de la cabeza impresora. 8 </li><li> Nótese que 250 l de bioink imprime tres cubreobjetos con el modelo mostrado en la Figura 2. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Encienda la impresora y deje que se caliente. </li><li> Lugar deseado superficie de impresión (aquí, se utiliza 22 mm x 22 mm cubreobjetos) en el centro de la etapa preparada en la etapa 1.6. </li><li> Crear un archivo de patrones de impresión. <ol><li> Abra Microsoft Word (o cualquier otro software de dibujo), y dibujar el patrón deseado. </li><li> Elija un patrón de impresión deseada para la impresión de células en el archivo preparado de antemano. </li></ol></li><li> Cargar el cartucho preparado con suspensión celular deseada. <ol><li> Pipeta suspensión en la circular pequeñas bien en la parte inferior del compartimento de cartucho. Utilice aproximadamente 100-120 l de solución. El tamaño de la gota impreso es de alrededor de 1308 picolitros. </li></ol></li><li> Imprimir el archivo con la impresora HP Deskjet 500. <ol><li> Para obtener los mejores resultados, imprima los patrones más pequeños varias veces (5), cambiando la cantidad de copias que desea en el programa de procesamiento de textos. </li></ol></li><li> La impresora se caliente de nuevo, a continuación, el cartucho se moverá a la &quot;posición de arranque&quot;. </li><li> Cuando el cartucho se mueve hacia la posición de preparado (un poco a la izquierda de que el goteo de tinta muy por debajo y se queda allí), tire hacia arriba del alambre de mecanismo de alimentación de papel y la impresión comenzará debe. <ol><li> Para obtener copias múltiples de la impresión, el mecanismo de alimentación de papel tendrá que ser liberada después de cada ciclo o página impresa. El cartucho y luego volverá a la &quot;lista&quot; de posición, y el cable de alimentación de papel mecanismo debe ser levantado otra vez. </li></ol></li><li> La impresora imprime en el cubreobjetos colocado en el centro de la etapa de impresión en el paso 5,2 (ver Figura 2). </li></ol> 6. Resultados representativos &lt;/ P&gt; Los resultados representativos del proceso de conversión de un Deskjet serie, fuera de la plataforma HP-500, estándar HP 26 cartuchos de la serie va a crear una impresora con la capacidad de las soluciones de impresión móviles para muchos tipos de análisis como se dijo antes. La impresora completado después de la conversión se muestra en la Figura 3, con una etapa de impresión para colocar el cubreobjetos sobre microscopio. La impresora puede ser útil en el análisis en muchos campos, incluyendo pero no limitados a: la mecánica de células individuales, ingeniería de tejidos, transfección génica, micropatterning biosensor, y terapias directas de células 1-10, 16-22. En este ejemplo, una impresora HP Deskjet 500 y HP 26 cartuchos de tinta de la serie se modificaron para bioprinting. Utilizando esta configuración de la impresora con un bioink que consta de una suspensión de células de fibroblastos en una solución de monómero g-actina, las células se imprimen sobre cubreobjetos de vidrio para microscopio. Figura 1 ilustra RES representativos<html> ULTS de células de fibroblastos impresos, que muestran incorporados monómeros de actina fluorescentes. Los resultados se obtuvieron en un ambiente controlado aséptico en la cual las células se imprimen en patrones adaptable. El patrón usado en este ejemplo fue creado en Microsoft Word (Figura 2). Este patrón creado una línea continua de la solución de impresión a través de la mayoría de los portaobjetos de microscopio. Figura 4 muestra la línea recta en la que están mutuamente la bioink y las células depositadas. Cabe señalar que, inmediatamente después de la impresión, hay un aumento de la fluorescencia de fondo porque la solución bioink, en el que las células se suspenden, contiene monómeros libres de exceso de actina fluorescentes. Esta fluorescencia de fondo disminuye significativamente tras la adición de medios de crecimiento en las células (Figura 1), que se lava el exceso de monómero a partir del sustrato. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Las imágenes representativas de los fibroblastos 3T3 3 horas después de la impresión utilizando la impresora de inyección de tinta modificado. El interior de las células muestran incorporados marcado con fluorescencia monómeros de actina. Las barras de escala representan 50 micras. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Figura 2. Diseño utilizado para imprimir bioink. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Figura 3. De la impresora después de la conversión con la etapa de espuma de poliestireno. El cable de color naranja en el medio no pasa por el sensor de la palanca de alimentación de papel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen representativa de los fibroblastos 3T3 impresas en una zona de impresión localizada. Imagen de microscopía toma 5 minutos después de la impresión a 20x de aumento. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. La imagen de fluorescencia (40x) se toma 3 horas después de la impresión que muestra un fibroblasto con internalizadas monómeros de actina fluorescente. Barra de escala representa 50 micras. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> Figura 6. Microscopía de fluorescencia (20 aumentos) de una célula tomada 15 minutos después de la impresión. La imagen muestra el G-actina (verde) y el núcleo (azul). De izquierda a derecha: g-actina con Alexa Fluor 488, el núcleo con DAPI, y una superposición de ambos. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> Figura 7. Microscopía fluorescente que muestra dos fibroblastos en un patrón de línea 3 horas después de la impresión. Imagen a la izquierda muestra la etiqueta fluorescente monómeros de actina dentro de las células. Imagen de la derecha es una superposición del canal fluorescente con la imagen de fondo para mostrar que a pesar depuede haber algunos restos de la diapositiva (en la esquina inferior izquierda), no fluorescente. Las barras de escala representan 50 micras, si no se indica el tamaño de la extrema derecha es un grupo control de no impresas las células se incubaron durante 3 horas con monómeros marcado con fluorescencia. Este control es mostrar que los monómeros no podía penetrar la membrana celular sin permeabilización de la membrana celular mediante impresión.

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No tenemos nada que revelar.

El proceso para convertir una impresora de inyección de tinta de escritorio estándar para bioprinting no es particularmente difícil. El paso más difícil es determinar la manera de eludir el mecanismo de alimentación de papel, que depende de la marca y modelo de impresora utilizado. Sin embargo, esto es relativamente simple cuando el sensor de alimentación de papel es mecánico como se describe aquí. Para los modelos con sensores ópticos de alimentación, otras técnicas puede ser necesario emplear para engañar a la impresora para que piense que es el uso de papel, por ejemplo, uno puede ejecutar un pequeño trozo de papel a través de la impresora mientras se imprime en el portaobjetos de un microscopio. Sin pasar por el mecanismo de alimentación de papel es probable que sea el paso más difícil en la aplicación de estos procedimientos para modelos de impresoras diferentes. Cuando se construye una etapa para mantener los cubreobjetos para la impresión, es importante para asegurar la alineación apropiada y la altura. La etapa debería permitir el cubreobjetos para ser colocado en el centro del área de impresión. Además, se debe plel as de los cubreobjetos a una altura adecuada para dejar espacio para el cartucho de impresión para pasar por encima de la diapositiva sin interrumpir la misma. La altura exacta de la etapa dependerá del modelo de impresora. Para asegurar que las células impresas no se lavan lejos, los portaobjetos se colocaron en una incubadora inmediatamente después de la impresión durante aproximadamente 30 minutos para permitir la fijación de las células antes adicionales medios de crecimiento de células se añadió. Debido a que las células fueron impresos en una solución que incluye grandes cantidades de PBS las células no se secan y se mantuvo viable. Las células fueron imágenes mediante microscopía de fluorescencia para visualizar la distribución de los etiquetados actina G-monómeros dentro de la célula (Figuras 1, 5-7). Cuando se imprime con fibroblastos 3T3, la Figura 5 muestra un resultado representativo, con la actina causando gran parte de la célula para fluorescencia, pero mostrando las líneas de brillo mayor. La incorporación de etiquetado fluorescente g-actina en el citoesqueleto esútil para el estudio de la dinámica del citoesqueleto y mecánicos celulares. 12-15 Una limitación de esta técnica es que sólo es aplicable para las moléculas y proteínas que tienen diámetros menores de aproximadamente 10 nm. Para asegurar que las células estaban siendo procesada por la impresora convertido, DAPI (1:5000 en PBS) se añadió a la bioink en lugar de la mitad del volumen de PBS puro. La mancha fluorescente DAPI se une a las porciones de aminoácidos ricos de ADN localizadas en el núcleo. Por lo tanto DAPI es un útil mancha en los núcleos de imágenes con fluorescencia de las células impresos. La figura 6 muestra una imagen representativa de una célula mostrando tanto Alexa Fluor 488 (actina) y DAPI (núcleo) de fluorescencia con una imagen de superposición de ambos. Figura 7 ilustra también cómo las células fluorescentes una vez que los monómeros de actina G-se han incorporado mientras que los no-material biológico que ha sido depositado en la muestra no presenta fluorescencia debido a la absence de G-actina monómeros. Una consideración importante para bioprinting es el medio acuoso que se utilizan para la bioink. Se encontró que el uso de medios estándar de crecimiento de células con suero producido resultados inconsistentes. Esto es más probable debido a la obstrucción de los inyectores del cabezal de impresión por parte de las proteínas séricas. El uso de PBS aumentó la consistencia de los patrones impresos y depositado el número de células. Una desventaja de usar PBS es que las células no se debe dejar en la suspensión durante períodos prolongados de tiempo. Sin embargo, los fibroblastos en estos ejemplos fueron capaces de tolerar las condiciones bioink por lo menos una hora sin ningún cambio en la viabilidad celular. Esto es consistente con varios hallazgos anteriores, que dan cuenta de que las células impresos a través de los mecanismos de inyección de tinta térmica se ha demostrado que tienen altos índices de viabilidad. 2-8 Esta configuración de la impresora modificado puede ser utilizado para otras aplicaciones de impresión de la célula. 16-22 proteínas de la matriz, tales como colágeno o fibroneCTIN, se pueden imprimir fácilmente sobre sustratos con esta técnica, que pueden ser útiles para el patrón celular. Para el tipo de colágeno ejemplo, yo impresa en patrones de líneas se traducirá en sustratos de colágeno alineadas que pueden ser utilizados para estudios in vitro de cultivo celular. 17 Además de las proteínas de la matriz, otras moléculas, incluyendo factores de crecimiento, pueden ser localizados de forma fiable sobre sustratos para los estudios de células y las posibles aplicaciones terapéuticas. 18 Una limitación importante del diseño descrito en los pasos anteriores es que esta impresora no es capaz de imprimir en más de una dimensión. Esto limita el potencial para su uso en aplicaciones tales como la impresión estampadas andamio. Para permitir la impresión en 3D, una etapa especializado necesita ser utilizado. La etapa necesita tener ajustes incrementales de altura para deposición de capa por capa de bioink. Bioprinting ha mostrado prometedor como un método eficiente y rentable para la ingeniería de tejidos, El gen de la transfección, micropatterning y la fabricación de microarrays de 1-12, 16-22 Las futuras aplicaciones de este tipo de dispositivos son numerosos, incluyendo:. Creación de microambientes controlados y con diseños celulares, la incorporación de macromoléculas en el citoplasma de la célula, y la deposición de las células en los andamios y las estructuras que no se producen de forma natural o de manera eficiente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> HP Deskjet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Descontinuado por el fabricante. Comprado reformado Trader diciembre </td></tr><tr><td> HP 26 Negro Cartucho de tinta </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> La actina de músculo de conejo, Alexa Fluor 488 conjugada, 200 ug </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado Eagles (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> La anfotericina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Se utiliza en el 0,5% en medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Se utiliza en el 0,5% en medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Banco de flujo unidireccional Limpio </td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td> Carcasa opcional para mantener la impresora aséptica </td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprinting tiene una amplia gama de aplicaciones y la importancia, incluyendo la ingeniería de tejidos, tratamientos directos de la aplicación de células, y microfabricación biosensor. 1.10 Recientemente, la impresión de inyección de tinta térmica se ha utilizado también para la transfección de genes 8,9. El proceso de impresión térmica de inyección de tinta se demostró que temporalmente interrumpir las membranas celulares sin afectar la viabilidad celular. Los poros transitorios en la membrana puede ser utilizado para introducir moléculas, que de otro modo serían demasiado grandes para pasar a través de la membrana, en el citoplasma celular. 8,9,11 La aplicación se ha demostrado aquí es el uso de impresión de inyección de tinta térmica para la incorporación de la etiqueta fluorescente g-actina monómeros en las células. La ventaja de utilizar térmica de chorro de tinta de impresión para inyectar moléculas en las células es que la técnica es relativamente benignos de las células. 8, 12 viabilidad de la célula después de la impresión se ha demostrado que es similar a la célula estándar PLAting métodos 1,8. Además, la impresión de inyección de tinta puede procesar miles de células en cuestión de minutos, que es mucho más rápido que la microinyección de instrucciones. Los poros creados por impresión se han mostrado para cerrar dentro de aproximadamente dos horas. Sin embargo, existe un límite al tamaño del poro creado (~ 10 nm) con esta técnica de impresión, lo que limita la técnica para la inyección de células con proteínas pequeñas y / o partículas. 8,9,11 Un estándar HP DeskJet 500 impresora fue modificada para permitir la impresión de la célula. 3, 5, 8 La cubierta de la impresora se eliminó y el mecanismo de alimentación de papel fue puenteado utilizando una palanca mecánica. Una etapa ha sido creado para permitir la colocación de láminas de microscopio y cubreobjetos directamente debajo del cabezal de impresión. Los cartuchos de tinta se abrieron, la tinta se separó y se limpian antes de su uso con las células. El patrón de la impresión se ha creado con el software de dibujo estándar, que controlaba la impresora a través de un comando de impresión simple. 3T3 fibroblastos se cultivaron hasta confluencia, se tripsinizaron y, a continuación se resuspendieron en tampón fosfato salino con solubles marcadas fluorescentemente actina G-monómeros. La suspensión celular se pipetearon en el cartucho de tinta y las líneas de células se imprimen en hojas de vidrio de cubierta de microscopio. Las células vivas son imágenes utilizando microscopía de fluorescencia y actina se encuentra en todo el citoplasma. Incorporación de actina fluorescente en la célula permite obtener imágenes de corto tiempo la dinámica del citoesqueleto y es útil para una amplia gama de aplicaciones. 13-15

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Una descripción de los métodos utilizados para convertir una impresora HP Deskjet 500 en un bioprinter. La impresora es capaz de procesar las células vivas, lo que provoca poros transitorios en la membrana. Estos poros se pueden utilizar para incorporar pequeñas moléculas, incluyendo fluorescente G-actina, en las células impresos.

Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K vistas.  Clemson University. Una descripción de los métodos utilizados para convertir una impresora HP Deskjet 500 en un bioprinter. La impresora es capaz de procesar las células vivas, lo que provoca poros transitorios en la membrana. Estos poros se pueden utilizar para incorporar pequeñas moléculas, incluyendo fluorescente G-actina, en las células impresos.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Investigación

Bioingeniería

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de la transcriptasa inversa con microcorrientes acústica

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilidad de Bioprinted celulares Construye El uso de un Tres Impresora cartesiana dispensador

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.