Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Thomas Boland per l&#39;idea di utilizzare le stampanti HP DeskJet per la stampa delle cellule. Il finanziamento per questo progetto da NSF RII-EPS 0903795 e NIH K25 HL0922280.

1. Conversione del HP DeskJet 500 Occorre notare che questa tecnica dovrebbe funzionare con molte stampanti a getto d&#39;inchiostro commercialmente. Tuttavia, le vecchie stampanti tendono a lavorare meglio come usano cartucce con ugelli di diametro maggiore, che non intasare la stessa facilità. Inoltre, le vecchie stampanti tendono ad usare sensori meccanici di alimentazione della carta che sono più facili da ignorare. Le stampanti con sensori ottici possono essere ingannati, ma con una piccola striscia di carta sul bordo opposto della stampante durante ogni ciclo, ma è un po &#39;più difficile che il sistema meccanico di &quot;trucco&quot;. Le stampanti attualmente disponibili in commercio che funzionano meglio sono a bassa risoluzione (DPI). Stampanti ad alta risoluzione tendono a intasare più facilmente. La risoluzione della HP Deskjet 500 è 300 DPI. Ci sono molte stampanti disponibili in commercio (HP Deskjet serie e altri) che hanno una risoluzione di 600 DPI. Questo tipo di stampante può essere utilizzata con solo un piccolo aumento di ugellointasamento problemi che possono essere alleviati con la pulizia accurata (sezione 3). <ol><li> Togliere il coperchio superiore in plastica della stampante sbloccando diversi clip di plastica dalla base inferiore della stampante e lentamente sollevando la parte superiore off. </li><li> Svitare il pulsante / display del pannello di luce dall&#39;alto della stampante, lasciandolo collegato alla scheda madre della stampante. </li><li> Pulire l&#39;interno della stampante, in particolare le zone in cui la cartuccia d&#39;inchiostro poggia e dove avviene la stampa. </li><li> Individuare i cavi che alimentano i meccanismi di alimentazione della carta e staccare la spina dalla scheda madre. <ol><li> Nella HP DeskJet 500, questi si trovano proprio sotto il vassoio verso sinistra anteriore. </li></ol></li><li> Individuare meccanismo di rilevamento della carta. Bypass il meccanismo mediante apposizione di una stringa o un anello di filo di servire come una maniglia manuale. <ol><li> Nel HP DeskJet 500, il meccanismo di rilevamento della carta è una leva di plastica grigia trovato sopra e dietro la stampa / carta meccanismo di alimentazione. </li></ol></li><li> Creazione di una fase di fronte al meccanismo di alimentazione della carta (dove la carta verrebbe alimentato da e depositati) per portare i vetrini di stampa desiderato ad un livello appena sotto la testina di stampa della cartuccia. <ol><li> Per i nostri esperimenti, il titolare di spedizione schiuma per provette da 15 ml per centrifuga è stato utilizzato con vetrini per microscopio diversi registrate in atto nella regione di stampa per portare il livello finale delle diapositive fino all&#39;altezza desiderata. </li></ol></li><li> Per mantenere una tecnica asettica, la stampante può essere inserito all&#39;interno di un armadio standard di rischio biologico o cappa da tavolo flusso laminare. </li><li> È importante notare che modificando un disponibile in commercio a getto d&#39;inchiostro di solito decadere garanzia produttore della stampante. </li></ol> 2. Conversione archivio cartucce d&#39;inchiostro HP (HP 26 cartuccia di inchiostro nero) <ol><li> Estrarre la cartuccia dalla confezione, lasciando il nastro protettivo che copre i contatti della stampante e testina di stampa per il momento. </li><li> Stabilizzare il corpodella cartuccia (parte nera) o con una pinza o morsa (semplicemente afferrando saldamente la cartuccia a mano di solito lavora pure), lasciando il verde chiaro superiore di qualsiasi ostacolo. </li><li> Con una pinza o una chiave regolabile, afferrare la parte superiore verde della cartuccia e girare avanti e indietro diverse volte fino a quando non si libera. <ol><li> Questo non dovrebbe prendere molta forza, ma la cima non è più necessario, quindi va bene se si rompe durante la rimozione. </li></ol></li><li> Utilizzando cacciaviti, Scalzare il pezzo di plastica trasparente ora esposti. <ol><li> Ancora una volta, questo non dovrebbe assumere molta forza, ma non sarà necessario, quindi è bene se si rompe durante la rimozione. </li></ol></li><li> Svuotare ogni residuo dal serbatoio. </li><li> Rimuovere il nastro di plastica protettiva che copre i contatti della stampante e testina di stampa. </li><li> Lavare i serbatoi con l&#39;acqua. <ol><li> Utilizzare una pipetta o una siringa per spingere l&#39;acqua attraverso i canali. </li><li> Acqua probabilmente fuoriuscire dalla testina di stampa durantequesto processo, questo è accettabile, e non causa danni alla funzionalità della cartuccia. </li></ol></li><li> Quando l&#39;acqua scorre chiara, permettono la cartuccia asciugare. </li></ol> 3. Cartuccia di pulizia inchiostro <ol><li> Per mantenere un ambiente pulito di stampa, la cartuccia d&#39;inchiostro deve essere pulito prima e dopo l&#39;uso. <ol><li> Questo aiuta anche evitare cristallizzazione di sali e altro materiale biologico nella cartuccia che potrebbe causare ostruzioni. </li></ol></li><li> Immergere completamente la cartuccia in un bicchiere pieno di acqua deionizzata, e ultrasuoni per 15 minuti prima e dopo la stampa. </li><li> Dopo sonicazione, rimuovere la cartuccia dall&#39;acqua, e scuotere l&#39;acqua in eccesso. </li><li> Spray etanolo al 70% nella cartuccia per creare un ambiente più asettico. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;etanolo è asciugata prima di aggiungere la soluzione di stampa bioink. </li></ol></li></ol> 4. Fare sospensione cellulare - &quot;Bioinchiostro &quot; <ol><li> Cellule di coltura fino al momento di passaggio. <ol><li> Per fibroblasti 3T3: le cellule semi su T-75 palloni a circa 1.3x10 4 cellule / cm 2 a Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Cellule di coltura per due giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Fai fluorescente g-actina soluzione madre alla concentrazione di 50 ug / ml in tampone fosfato (PBS). </li><li> Passage cellule. <ol><li> Per fibroblasti 3T3: Rimuovere i supporti dal pallone e lavare due volte con PBS. Coprire le cellule con 5 ml 0,25% tripsina + EDTA e incubare per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 5 ml di mezzo fresco e pipettare la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml centrifuga conica e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Aspirare speso media. </li></ol></li><li> Risospendere le cellule in PBS con quelle fluorescenti g-actina soluzione madre per creare bioink. <ol><li> Bioink dovrebbe avere una concentrazione finale di g-actina di 10 ug / ml e un co cellulancentration di 1x10 5 cellule / ml. Questa concentrazione è stata ottimizzata per limitare la quantità di cellule per goccia e intasamento della testina di stampa. 8 </li><li> Si noti che 250 pl di bioink stampa tre vetrini coprioggetto con il disegno illustrato nella figura 2. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Accendere la stampante e lasciate scaldare. </li><li> Posizionare desiderata superficie di stampa (qui, usiamo 22 mm x 22 mm coprioggetti) al centro della scena preparato nella fase 1,6. </li><li> Creare un file di configurazione di stampa. <ol><li> Apri Microsoft Word (o qualsiasi altro software di disegno), e disegnare il modello desiderato. </li><li> Scegli un modello di stampa desiderato per la stampa delle cellule nel file premade. </li></ol></li><li> Caricare la cartuccia preparata con sospensione cellulare desiderato. <ol><li> Sospensione con pipetta nelle piccole e circolare nella parte inferiore del vano cartuccia. Utilizzare circa 100-120 ml di soluzione. Le dimensioni delle gocce di stampa è di circa 1308 picolitri. </li></ol></li><li> Stampa il file con la HP Deskjet 500 Printer. <ol><li> Per i migliori risultati, stampare piccoli motivi più volte (5), cambiando la quantità di copie desiderato nel programma di elaborazione testi. </li></ol></li><li> Stampante si riscalda di nuovo, poi la cartuccia si sposterà nella &quot;posizione pronto&quot;. </li><li> Quando la cartuccia si sposta nella posizione di pronto (leggermente a sinistra della goccia d&#39;inchiostro ben al di sotto e rimane lì), tirare il filo meccanismo di alimentazione della carta e la stampa deve iniziare. <ol><li> Per copie multiple di stampa, il meccanismo di alimentazione della carta dovrà essere rilasciato dopo ogni ciclo o pagina stampata. La cartuccia viene poi tornare alla posizione di &quot;ready&quot;, e il filo di alimentazione della carta meccanismo dovrebbe essere nuovamente sollevata. </li></ol></li><li> La stampante stampa sul vetrino coprioggetti posto al centro della fase di stampa nella fase 5,2 (vedi Figura 2). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi &lt;/ P&gt; I risultati rappresentativi del processo di conversione di una norma, off-the-shelf HP Deskjet 500, standard HP 26 cartucce della serie creerà una stampante con la possibilità di soluzioni di stampa cellulari per molti tipi di analisi, come detto prima. La stampante completato dopo la conversione è mostrata in figura 3, con una fase di stampa per posizionare il coprioggetto sul microscopio. La stampante può essere utili in analisi in molti campi, inclusi ma non limitati a: meccanica singola cella, ingegneria tessutale, trasfezione del gene, micropatterning biosensore e terapie cellulari diretti 1-10, 16-22. In questo esempio, uno HP Deskjet 500 stampante HP 26 e cartucce d&#39;inchiostro serie sono stati modificati per bioprinting. Usando questa configurazione della stampante con una bioink costituita da una sospensione cellulare in un fibroblasto g-actina soluzione di monomero, le cellule sono state stampate su vetrini coprioggetto per microscopio in vetro. Figura 1 illustra res rappresentativi<html> ÜLTS di cellule di fibroblasti stampati, che mostrano incorporati monomeri di actina fluorescenti. I risultati sono stati ottenuti in un ambiente controllato asettico in cui sono stampate le cellule in schemi personalizzabili. Il modello usato in questo esempio è stato creato in Microsoft Word (Figura 2). Questo modello ha creato una linea continua della soluzione di stampa attraverso la maggior parte del vetrino da microscopio. Figura 4 mostra la retta in cui la bioink e le cellule sono reciprocamente depositati. Si noti che immediatamente dopo la stampa, vi è un aumento di fluorescenza di fondo perché la soluzione bioink, in cui sono sospese le cellule, contiene monomeri liberi eccesso actina fluorescenti. Questa fluorescenza di fondo diminuisce significativamente dopo l&#39;aggiunta di mezzi di crescita sulle cellule (Figura 1), che lava monomero in eccesso dal substrato. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Immagini rappresentative di fibroblasti 3T3 3 ore dopo la stampa con la stampante a getto d&#39;inchiostro modificate. L&#39;interno delle cellule mostrano incorporati monomeri di actina fluorescente tag. Barre di scala rappresentano 50 micron. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Figura 2. Di progettazione utilizzati per la stampa bioink. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Figura 3. Stampa dopo la conversione con stadio Styrofoam. Il filo arancione in mezzo bypassa il feed sensore della carta leva. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> Figura 4. Immagine rappresentativa di fibroblasti 3T3 stampati in una zona localizzata di stampa. Microscopia immagine presa 5 minuti dopo la stampa di ingrandimenti a 20x. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Immagine di fluorescenza (ingrandimento 40x) preso 3 ore dopo la stampa mostrando un fibroblasto con interiorizzate monomeri di actina fluorescenti. Barra della scala rappresenta 50 micron. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> Figura 6. Microscopia fluorescente (20x) di una cellula presa 15 minuti dopo la stampa. L&#39;immagine mostra sia g-actina (verde) e il nucleo (blu). Da sinistra a destra: g-actina con Alexa Fluor 488, nucleo con DAPI, e una sovrapposizione di entrambi. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> Figura 7. Microscopia fluorescente mostra due fibroblasti in un modello di linea 3 ore dopo la stampa. Immagine a sinistra mostra monomeri di actina fluorescente all&#39;interno delle cellule. Immagine a destra è una sovrapposizione del canale fluorescente con l&#39;immagine di sfondo per mostrare che, sebbeneci possono essere alcuni detriti sul vetrino (in basso a sinistra), non è fluorescente. Barre di scala rappresentano 50 micron, se non indicato taglia l&#39;estrema destra è un gruppo di controllo non-stampati cellule incubate per 3 ore con monomeri fluorescente tag. Questo controllo è quello di mostrare che i monomeri non poteva penetrare la membrana cellulare, senza permeabilizzazione della membrana cellulare dalla stampa.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il processo di convertire un normale stampante a getto d&#39;inchiostro per bioprinting non è particolarmente difficile. Il passo più difficile è determinare il modo per bypassare il meccanismo di alimentazione della carta, che dipende dalla marca e il modello della stampante utilizzata. Tuttavia, questo è relativamente semplice, quando il sensore alimentazione carta è di tipo meccanico come qui descritto. Per i modelli con sensori ottici di alimentazione, altre tecniche potrebbe essere necessario essere impiegati per ingannare la stampante a pensare che sta usando la carta, per esempio, si può eseguire un piccolo pezzo di carta attraverso la stampante durante la stampa sul vetrino da microscopio. Bypassare il meccanismo di alimentazione della carta è probabilmente il passo più difficile l&#39;applicazione di tali procedure per differenti modelli di stampante. Quando si realizza uno stadio per contenere i coprioggetti per la stampa, è importante assicurare un corretto allineamento e altezza. La fase dovrebbe consentire la coprioggetto da essere collocato al centro dell&#39;area di stampa. Inoltre, dovrebbe place del vetrino ad una altezza sufficiente per permettere l&#39;autorizzazione per la cartuccia di stampa a passare alla diapositiva, senza turbarlo. L&#39;altezza esatta della fase dipenderà dal modello di stampante. Per assicurare che le cellule stampati non viene lavato via, i vetrini sono stati posti in un incubatore immediatamente dopo la stampa per circa 30 minuti per permettere l&#39;adesione delle cellule prima di ulteriori mezzi di crescita delle cellule è stato aggiunto. Poiché le cellule sono state stampate in una soluzione che contiene grandi quantità di PBS delle cellule non seccano e rimasti vitali. Le cellule sono state ripreso utilizzando microscopia a fluorescenza per visualizzare la distribuzione dei tag g-actina monomeri all&#39;interno della cella (figure 1, 5-7). Quando si stampa con fibroblasti 3T3, la figura 5 mostra un risultato rappresentativo, con l&#39;actina causando gran parte della cella di fluorescenza, ma mostra linee di maggiore luminosità. L&#39;incorporazione di fluorescenza con tag g-actina nel citoscheletro èutile per lo studio della dinamica citoscheletrici e meccanica cellulari. 12-15 Un limite di questa tecnica è che è applicabile solo per le molecole e proteine ​​che hanno diametri inferiori a circa 10 nm. Per garantire che le cellule sono state effettivamente elaborato dalla stampante convertito, DAPI (1:5000 in PBS) è stato aggiunto al bioink in luogo della metà del volume di PBS puro. Il colorante fluorescente DAPI lega a porzioni di amminoacidi ricchi di DNA che si trova nel nucleo. Pertanto DAPI è utile in una macchia fluorescente nuclei delle cellule immagini stampate. Figura 6 mostra una immagine rappresentativa di una cella di visualizzazione sia Fluor Alexa 488 (actina) e DAPI (nucleo) fluorescenza con un&#39;immagine sovrapposizione di entrambi. Figura 7 illustra anche come le cellule fluorescenza quando le g-actina monomeri sono stati inseriti, mentre non materiale biologico che è stato depositato nel campione non emette fluorescenza a causa del absence g-actina di monomeri. Una considerazione importante per bioprinting è il mezzo acquoso e utilizzate per bioink. Si è riscontrato che l&#39;uso di normali mezzi di crescita delle cellule con il siero prodotto risultati inconsistenti. Ciò è probabilmente dovuto a intasamento delle ugelli della testina di stampa da parte di proteine ​​del siero. L&#39;uso di PBS aumentato la consistenza di motivi stampati e il numero di cellule depositato. Uno svantaggio dell&#39;utilizzo PBS è che le cellule non dovrebbe essere lasciato in sospensione per periodi di tempo prolungati. Tuttavia, fibroblasti in questi esempi sono stati in grado di tollerare le condizioni bioink per almeno un&#39;ora senza modifica vitalità cellulare. Ciò è coerente con diversi ritrovamenti precedenti, che riportano stampati che le cellule con meccanismi a getto d&#39;inchiostro termico hanno dimostrato di avere tassi di redditività elevati. 2-8 Questa configurazione della stampante modificato potrà essere utilizzato per applicazioni diverse da stampa cell. 16-22 proteine ​​della matrice, come il collagene o fibronectin, possono essere facilmente stampati su substrati con questa tecnica, che può essere utile per patterning cella. Ad esempio, collagene di tipo I stampato in modelli di linea si tradurrà in substrati collagene allineati che possono essere utilizzati per studi in vitro hanno. 17 Oltre alle proteine ​​della matrice, molecole, compresi fattori di crescita, può essere localizzato in modo affidabile su substrati per studi cellulari e potenziali applicazioni terapeutiche 18. Una limitazione importante della progettazione descritta nei passaggi precedenti è che la stampante non è in grado di stampare in più di una dimensione. Questo limita la possibilità di utilizzo in applicazioni modellate come la stampa scaffold. Per consentire la stampa 3D, una fase specializzato deve essere usato. La fase deve avere regolazioni in altezza incrementali per layer-by-layer deposizione di bioink. Bioprinting ha mostrato risultati promettenti come un metodo efficace e conveniente per l&#39;ingegneria tissutale, Gene trasfezione, micropatterning e microarray fabbricazione 1-12, 16-22 Le applicazioni future di questo tipo di dispositivo sono molteplici, tra cui:. Creazione di controllate e modellata microambienti cellulari, l&#39;incorporazione di macromolecole nel citoplasma delle cellule, e deposizione di cellule su ponteggi e strutture che non presenti in natura o in modo efficiente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> HP DeskJet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Fuori dal produttore. Acquistato ristrutturato Trader dicembre </td></tr><tr><td> HP 26 Cartuccia inchiostro nero </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> Actin dal muscolo di coniglio, coniugato con Alexa Fluor 488, 200 mcg </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Utilizzato al 0,5% in terreni di coltura cellulare </td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Utilizzato al 0,5% in terreni di coltura cellulare </td></tr><tr><td> Flusso unidirezionale Clean Bench </td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td> Alloggiamento opzionale per mantenere stampante asettica </td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprinting ha una vasta gamma di applicazioni e di significato, compresa l&#39;ingegneria tessutale, terapie dirette applicazione di cellule e microfabbricazione biosensore. 1-10 Recentemente, la stampa a getto d&#39;inchiostro termico è stato utilizzato anche per la trasfezione genica. 8,9 Il processo di stampa termica a getto d&#39;inchiostro è stato dimostrato che temporaneamente interrompere le membrane cellulari senza compromettere la vitalità cellulare. I pori transitori della membrana può essere utilizzato per introdurre molecole, che altrimenti sarebbero troppo grande per passare attraverso la membrana, nel citoplasma cellulare. 8,9,11 L&#39;applicazione viene mostrato qui è l&#39;uso di stampa a getto d&#39;inchiostro termica per l&#39;incorporazione di fluorescente g-actina monomeri in cellule. Il vantaggio di utilizzare termica a getto di inchiostro per iniettare molecole nelle cellule è che la tecnica è relativamente benigna alle cellule. 8, 12 La vitalità cellulare dopo che la stampa è stata dimostrata simile alla cella PLA normaMetodi Ting 1,8. Inoltre, stampa a getto d&#39;inchiostro in grado di elaborare migliaia di cellule in pochi minuti, che è molto più veloce microiniezione manuale. I pori creati dalla stampa hanno dimostrato di chiudere entro circa due ore. Tuttavia, esiste un limite alla dimensione del poro creato (~ 10 nm) con questa tecnica di stampa, che limita la tecnica di iniezione di cellule con piccole proteine ​​e / o particelle. 8,9,11 Uno standard HP DeskJet 500 stampante è stato modificato per consentire la stampa cella. 3, 5, 8 Il coperchio della stampante è stato rimosso e il meccanismo di alimentazione della carta è bypassato mediante una leva meccanica. Una fase è stata creata per consentire il posizionamento di vetrini da microscopio e vetrini coprioggetti direttamente sotto la testina di stampa. Cartucce d&#39;inchiostro sono stati aperti, l&#39;inchiostro è stato rimosso e sono stati ripuliti prima dell&#39;uso con le cellule. Il modello di stampa è stato creato con software standard di disegno, che poi controllato la stampante tramite un semplice comando di stampa. 3T3 fibroblasti sono state coltivate a confluenza, tripsinizzate, e quindi risospese in soluzione salina tamponata con fosfato solubili fluorescente g-actina monomeri. La sospensione cellulare è stata pipettano nella cartuccia d&#39;inchiostro e linee di cellule sono state stampate su scivola microscopio in vetro di copertura. Le cellule vive sono stati ripresi utilizzando microscopia a fluorescenza e actina è stata trovata nel citoplasma. L&#39;incorporazione di actina fluorescente nella cella permette l&#39;imaging di dinamica citoscheletrici breve tempo ed è utile per una vasta gamma di applicazioni. 13-15

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Una descrizione dei metodi utilizzati per convertire un HP DeskJet 500 stampante in un bioprinter. La stampante è in grado di elaborare le cellule viventi, che provoca transitori pori nella membrana. Questi pori possono essere utilizzati per incorporare piccole molecole, tra cui fluorescente G-actina e nelle cellule stampati.

Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d&#39;inchiostro standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K Views.  Clemson University. Una descrizione dei metodi utilizzati per convertire un HP DeskJet 500 stampante in un bioprinter. La stampante è in grado di elaborare le cellule viventi, che provoca transitori pori nella membrana. Questi pori possono essere utilizzati per incorporare piccole molecole, tra cui fluorescente G-actina e nelle cellule stampati.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.