著者らは、細胞の印刷は、HP DeskJetプリンタを使用してのアイデアのために博士トーマスボーランドを承認したいと思います。 NSF RII-EPS 0903795とNIH K25 HL0922280からこのプロジェクトのための資金。

1。のHP DeskJet 500を変換するこれは、この手法は多くの市販のインクジェットプリンタで動作するべきであることに注意する必要があります。ただし、古いプリンタでは、彼らが同じように簡単に詰まらせていない大径ノズルとインクカートリッジを使用しており、良い仕事する傾向があります。さらに、古いプリンタにはバイパスが容易である機械的な給紙センサーを使用する傾向があります。オプティカルセンサーを搭載したプリンタがだまされますが、各サイクル中にプリンタの遠端に紙の小片を使用していますが、 &quot;トリック&quot;への機械的なシステムよりも少し困難であることができます。最高の仕事は、現在市販されているプリンタは、低解像度（DPI）を持っています。 高解像度のプリンタでは、より簡単に詰まらせる傾向があります。のHP Deskjet 500の解像度は300 dpiです。 600 DPIの解像度を持っている多くの市販のプリンタ（HP DeskJetのシリーズなど）があります。このタイプのプリンタは、ノズルのわずかな増加に伴って使用することができます（セクション3）慎重にクリーニングを使用して軽減することができる問題を目詰まり。 <ol><li>プリンタの底部基地から、いくつかのプラスチック製のクリップのロックを解除し、ゆっくりと上部をオフに持ち上げてプリンタ上部のプラスチックケースを削除します。 </li><li>を外し、ボタン/プリンタの上部からの光パネルを表示し、それはプリンタのマザーボードに接続したまま。 </li><li>特に、プリンタの内部に、インクカートリッジがかかっていると印刷が発生した領域を清掃してください。 </li><li>紙送り機構に電力を供給するケーブルを見つけて、マザーボードからそれらのプラグを抜きます。 <ol><li>はHP DeskJet 500で、これらはちょうど正面の左側に向かって給紙トレイの下に発見された。 </li></ol></li><li>紙の検出メカニズムを見つけます。手動プルハンドルとして機能する文字列やワイヤループを貼り付けるためのメカニズムをバイパスしてください。 <ol><li>はHP DeskJet 500で、紙の検出機構は、印刷/紙送り機構の上と後ろに見つかった灰色のプラスチック製のレバーです。 </li></ol></li><li>ただカートリッジのプリントヘッドの下のレベルに所望の印刷スライドを実現するための紙送り機構（用紙はから供給され、堆積される場所）の前にステージを作成します。 <ol><li>私たちの実験のために、15 mLの遠心分離管の泡の出荷ホルダーは、所望の高さにスライドの最終レベルをもたらすために、印刷領域内の場所で録音し、いくつかの顕微鏡スライドを使用しました。 </li></ol></li><li>無菌性を維持するために、プリンタは、標準的なバイオハザードキャビネットまたは卓上層流フードの内側に配置することができます。 </li><li>市販のインクジェットプリンタを変更すると、通常のプリンタのメーカー保証が無効になりますことに注意することは重要です。 </li></ol> 2。変換証券HPインクカートリッジ（HP 26ブラックインクカートリッジ） <ol><li>当分の間、プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っている保護テープを残して、そのパッケージからカートリッジを取り外します。 </li><li>体を安定させるクランプまたは万力（単にしっかりと通常同様に働いて手でカートリッジをつかんで）のいずれかのカートリッジ（黒部分）の、いずれかの障害の緑の上を明確に残します。 </li><li>ペンチやモンキーレンチを使用して、カートリッジの緑色の上部をつかみ、それを自由に中断するまで、前後に数回ねじります。 <ol><li>これは非常に力を取るべきではありませんが、上部は必要なくなったので、それを削除するとき、それが起これば、それは大丈夫です。 </li></ol></li><li>ドライバーを使用して、現在露出した透明なプラスチック部分を無理に外そう。 <ol><li>繰り返しますが、これは非常に力を取るべきではありませんが、それは必要なされませんので、取り外しの際に壊れたときにそれは大丈夫です。 </li></ol></li><li>貯水池から残りを空にします。 </li><li>プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っているビニールの保護テープを取り外します。 </li><li>徹底的に水で貯水池をフラッシュします。 <ol><li>チャネルを介して水をプッシュするピペットまたはシリンジを使用しています。 </li><li>水の可能性が高い時に印字ヘッドから漏れます。このプロセスは、これは許容範囲内で、カートリッジの機能に損傷を与えることはありません。 </li></ol></li><li>水がきれいに実行すると、カートリッジが乾燥することができます。 </li></ol> 3。インクカートリッジのクリーニング<ol><li>きれいな印刷環境を維持するために、インクカートリッジは使用前と使用後に洗浄する必要があります。 <ol><li>これは、閉塞を引き起こす可能性がカートリッジ内に塩及びその他の生物材料の結晶化を回避に役立ちます。 </li></ol></li><li>完全に水没脱イオン水を完全にビーカー内のカートリッジ、印刷前と後の15分間超音波洗浄します。 </li><li>超音波処理した後、水からカートリッジを取り出し、余分な水を振る。 </li><li>より多くの無菌環境を作成するためのカートリッジに70％エタノールをスプレーします。 <ol><li>エタノールはbioink印刷ソリューションを追加する前に乾燥していることを確認します。 </li></ol></li></ol> 4。細胞懸濁液を作る - &quot;バイオインク &quot; <ol><li>通路に準備ができるまで培養細胞。 <ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）とDulbeccos改変イーグル培地（DMEM）で約1.3×10 4細胞/ cm 2でT-75フラスコにシード細胞：3T3線維芽細胞のために。 37℃インキュベーターで2日間培養細胞℃、5％CO 2。 </li></ol></li><li>リン酸緩衝液（PBS）中の濃度を50μg/ mlの蛍光G-アクチンのストック溶液を作成します。 </li><li>継代細胞。 <ol><li> 3T3線維芽細胞の場合：フラスコから培地を取り除き、PBSで2回すすいでください。 5分のために5ミリリットル、0.25％トリプシン+ EDTAとインキュベートした細胞をカバーしています。 </li><li>新鮮培地5mlを加え、5分間1000rpmで15 mlコニカル遠心チューブと遠心分離機に細胞懸濁液をピペットで。吸引は、媒体を過ごしました。 </li></ol></li><li> bioinkを作成するために蛍光灯G-アクチンのストック溶液をPBSで細胞を再懸濁します。 <ol><li> Bioinkは10μg/ mlのG-アクチンの最終濃度と細胞の共同が必要です1×10 5細胞/ mlのncentration。この濃度は、プリンタヘッドのドロップすると、目詰まりあたりのセルの量を制限するために最適化されています。8 </li><li> bioink250μlの図2に示すパターンを持つ3つのカバースリップを出力することに注意してください。 </li></ol></li></ol> 5。 Bioprinting <ol><li>の電源をオンにして、プリンタがウォームアップしましょう​​。 </li><li>ステップ1.6で調製したステージの中央の上に置き、目的の印刷面（ここでは、我々は22ミリメートル×22 mmのカバーガラスを使用します）。 </li><li>印刷パターンファイルを作成します。 <ol><li>開いているMicrosoft Word（または他の描画ソフトウェア）、および所望のパターンを描画します。 </li><li>既成のファイル内のセルの印刷の所望の印刷パターンを選択します。 </li></ol></li><li>所望の細胞懸濁液を調製したカートリッジをロードします。 <ol><li>よくカートリッジのコンパートメントの下部にある小さな円形のピペットの懸濁液。溶液を約100から120μlを使用しています。印刷された液滴サイズは130程度であるピコ8。 </li></ol></li><li> HP DeskJet 500プリンタを使用してファイルを印刷します。 <ol><li>最良の結果を得るには、ワードプロセッシングプログラムで希望するコピーの量を変化させることにより、より小さなパターンを複数回（5）を印刷します。 </li></ol></li><li>プリンタが再びウォームアップされ、次にカートリッジは &quot;レディポジション&quot;に移動します。 </li><li>カートリッジの準備が位置（わずかに下回ったインク滴の左側に、そこに留まる）に移動したとき、紙送り機構のワイヤ上でプルアップし、印刷は開始すべきである。 <ol><li>印刷の複数のコピーを、紙送り機構は、毎サイクル、またはページが印刷された後に解放する必要があります。カートリッジは、 &quot;準備完了&quot;の位置に戻りますと、紙送り機構のワイヤが再び提起されるべきである。 </li></ol></li><li>プリンタが（ 図2を参照）、ステップ5.2での印刷ステージの中央に置かカバースリップの上に印刷されます。 </li></ol> 6。代表的な結果&lt;/ P&gt; 標準的な既製のHP Deskjet 500の全体の変換プロセスの代表的な結果は、標準のHP 26シリーズカートリッジは、前に述べたように分析の多くの種類のセル·ソリューションの印刷機能を持つプリンタを作成します。変換後の完了したプリンタは、顕微鏡カバースリップの上に配置し、印刷段階で、 図3に示されています。プリンタは、次のような多くの分野での分析に有用であるが、これらに限定することはできません。単一細胞力学、組織工学、遺伝子導入、バイオセンサー微細、直接細胞療法1-10、16から22。 この例では、HP DeskJet 500プリンタおよびHP 26シリーズのインクカートリッジはbioprintingために変更されました。 G-アクチンモノマー溶液中で線維芽細胞懸濁液から成るbioink、このプリンタのセットアップを使用して、細胞をガラス顕微鏡カバースリップ上に印刷された。 図1は、代表的な解像度を示しています<html>組み込まれた蛍光アクチン単量体を示すプリント繊維芽細胞のults、。結果は、細胞がカスタマイズ可能なパターンに印刷された制御された無菌環境下で得られた。 この例で使用されるパターンは、Microsoft Word（ 図2）で作成されました。このパターンは、顕微鏡スライドの大半にわたって印刷ソリューションの連続線を作成しました。 図4は bioinkと細胞が相互に堆積された直線を示しています。それは細胞が中断されているbioinkソリューションは、無料の過剰蛍光アクチン単量体を含んでいるため、すぐに印刷した後、バックグラウンド蛍光の増加があることに留意すべきである。このバックグラウンド蛍光が大幅に基板から過剰のモノマーを洗浄細胞（ 図1）、上に増殖培地を添加した後に減少します。 <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：3時間変更されたインクジェットプリンタを使用して印刷した後、3T3線維芽細胞の代表的な画像。細胞の内部には組み込まれ蛍光標識アクチン単量体を示しています。スケールバーは50μmを表す。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> 図2デザインbioinkを印刷するために使用されます。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> 図3。発泡スチロール段と変換後のプリンタ。中央のオレンジ色の線は、紙送りレバーセンサーをバイパスします。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> 図4。ローカライズされた印刷ゾーンで印刷3T3線維芽細胞の代表的なイメージ。顕微鏡画像は、20倍の倍率で印刷した後、5分を撮影。 / files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; 図5：3時間内在蛍光アクチン単量体と線維芽細胞を示す印刷後に撮影した蛍光画像（40×倍率）。スケールバーは50μmを表す。 <img alt="図6。" src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> 図6 15分の印刷後に採取細胞の蛍光顕微鏡（20倍の倍率）。画像はG-アクチン（緑）、核（青）の両方を示しています。左から右へ：G-アクチンのAlexa Fluor 488、核DAPI、両方のオーバーレイである。 <img alt="図7。" src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> 図7。3時間、印刷後にラインパターンの2つの線維芽細胞を示す蛍光顕微鏡。左の画像は、細胞内の蛍光標識アクチン単量体を示しています。右の画像は、表示する背景画像と蛍光チャンネルのオーバーレイですが、ここではそのスライド（左下隅）のいくつかの破片があるかもしれません、それは蛍光を発することはありません。サイズは一番右が蛍光標識モノマーで3時間インキュベートした非印刷のセルのコントロール群であることが示されていない場合のスケールバーは50μmを表す。このコントロールは、単量体は、細胞印刷で膜透過せずに細胞膜を貫通することができなかったことを示すことである。

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我々は、開示することは何もありません。

bioprintingための標準的なインクジェットデスクトッププリンタを変換するプロセスは、特に難しいことではありません。最も困難なステップは、使用するプリンタのブランドやモデルに依存している紙送り機構をバイパスする方法を決定しています。ここで説明したように、給紙センサは機械的である場合ただし、これは比較的簡単です。光フィードセンサー付きモデルの場合、他の技術は、紙を使用している思考にプリンタをだますために採用する必要があるかもしれません、それは顕微鏡スライド上に印刷されながら、たとえば、1つはプリンタによって紙の小片を実行することができます。紙送り機構をバイパスすると、別のプリンタモデルにこれらの手順を適用する際の最も困難なステップとなる可能性があります。 印刷用カバーガラスを保持するためのステージを構築するときに、それは適切なアライメントと高さを確保することが重要です。ステージでは、印刷領域の中央に配置されるカバースリップを許可する必要があります。また、PLすべきエースプリントカートリッジは、それを中断せずにスライドを渡すためのクリアランスを可能にするために十分な高さでカバースリップ。ステージの正確な高さは、プリンタのモデルによって異なります。 印刷された細胞は洗い流さされないことを確認するために、スライドは、追加の細胞増殖メディアが追加される前に細胞接着を可能にするために約30分間印字直後インキュベーターに入れた。細胞をPBSを大量に含む溶液に印刷されたため細胞が乾燥して生存していませんでした。細胞は、細胞内のタグ付きG-アクチンモノマー（ 図1、図5-7）の分布を可視化する蛍光顕微鏡を用いて撮像した。 3T3線維芽細胞で印刷する場合、 図5は、アクチンが蛍光を発するための細胞の多くの原因が、増加した明るさのラインを披露して、代表的な結果を示しています。細胞骨格に蛍光標識G-アクチンの取り込みです。細胞骨格のダイナミクスと細胞の力学の研究に有用である。12-15この手法の制限は、約10nmより小さい直径を有する分子とタンパク質にのみ適用ということです。 その細胞は実際に変換されたプリンタによって処理されていたことを確認するには、DAPI（PBSで1:5000）は純粋なPBSの体積の半分の代わりにbioinkに追加されました。蛍光染色法DAPIは核内に位置するDNAのアミノ酸の豊富な部分に結合する。したがって、DAPIは、印刷された細胞の蛍光イメージング核の染色に有用である。 図6は、両方のオーバーレイイメージを使ってのAlexa Fluor®488（アクチン）およびDAPI（核）蛍光の両方を表示するセルの代表的なイメージを示しています。 図7は、またどのように示していますサンプルに寄託されている非生物学的物質が原因absencの蛍光を発するものではありませんが、細胞はG-アクチンモノマーが組み込まれている一度蛍光を発するG-アクチンモノマーのe。 bioprintingための重要な考慮事項の1つはbioinkに使用される水性媒体です。それは血清で標準的な細胞増殖培地を使用すると、矛盾する結果をもたらしたことが判明した。これが最も可能性の高い血清タンパク質によるプリントヘッドのノズルの目詰まりによるものです。 PBSの使用は、印刷パターンの一貫性を増加し、細胞の数は、堆積させた。 PBSを用いて1つの欠点は、細胞が長時間懸濁状態に残されるべきではないということです。しかし、これらの例では線維芽細胞は、細胞生存率の変化なしで少なくとも1時間のためにbioink条件を許容することができました。これは、サーマルインクジェット機構を介して印刷された細胞が高い生存率を有することが示されていることを報告し、いくつかの事前調査結果と一致している2-8 この変更されたプリンタのセットアップは、セルの印刷以外の用途に使用することができます。コラーゲンやfibroneとして16から22のマトリックスタンパク質、ctinはは、容易に細胞のパターニングのために役に立つことができ、この技術を持つ基板上に印刷することができます。例えば、コラーゲンタイプIはパターンがin vitroでの細胞培養研究のために使用することができます整列コラーゲン基質になりますラインに出力されます。成長因子を含むマトリックスタンパク質、他の分子に加えて、17は確実に細胞研究のための基板上に局在化させることができるおよび潜在的な治療への応用18。 上記の手順で説明したデザインの主要な制限は、このプリンタが複数の次元で印刷することができないということです。これは、足場印刷などのパターン化アプリケーションで使用するための可能性を制限します。 3Dプリントを可能にするために、専門の段階では、使用する必要があります。ステージでは、bioinkのレイヤーバイレイヤーの堆積のためのインクリメンタル高さ調整を持っている必要があります。 Bioprintingは、組織工学のための効率的かつ費用対効果の高い方法として約束を示している、遺伝子トランスフェクション、微細とマイクロアレイ製造1-12、16から22までこのタイプのデバイスの将来のアプリケーションは、数多くのとおりです。足場の上に制御し、パターン化細胞の微小環境、細胞質に高分子の取り込み、細胞の膜の作成と自然にまたは効率的に発生しない構造。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>のHP DeskJet 500 </td><td>ヒューレット·パッカード</td><td> C2106A </td><td>メーカーから中止した。改装されたDECのトレーダーを購入しました。 </td></tr><tr><td> HP 26インクカートリッジ黒</td><td>ヒューレット·パッカード</td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ筋肉からアクチンのAlexa Fluor®488コンジュゲート、200μgの</td><td>インビトロジェン</td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td> MPのバイオメディカル</td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos改変イーグル培地（DMEM） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td&gt; Sigma-Aldrich社</td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A2942 </td><td>細胞培養培地で0.5％で使用</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P4333 </td><td>細胞培養培地で0.5％で使用</td></tr><tr><td>一方向のフロークリーンベンチ</td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td>プリンタは無菌維持するためのオプションの住宅</td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprintingは、組織工学、直接セル·アプリケーションの治療、およびバイオセンサー微細加工などのアプリケーションと重要性の広い範囲を持っています。1月10日最近では、サーマルインクジェット印刷は、遺伝子トランスフェクションのために使用されています。8,9サーマルインクジェット印刷プロセスがに示された一時的に細胞の生存に影響を与えずに細胞膜を破壊する。膜の一時的な毛穴は、特に細胞質に、膜を通過するには大きすぎるであろう分子を導入するために使用することができます。8,9,11は、 ここに示されているアプリケーションは、細胞に蛍光標識したG-アクチンモノマーの取り込みのためのサーマルインクジェットプリントを使用することである。細胞内に分子を注入するためにサーマルインクジェット印刷を使用する利点は、技術が細胞に比較的良性であるということです。印刷後8、12細胞の生存率は、標準セルPLAと同様であることが示されているティンメソッドを1,8。さらに、インクジェット印刷は、手動マイクロインジェクションよりもはるかに高速である、数分で細胞の数千を処理することができます。印刷によって作成された孔は、約2時間以内に完了することが示されている。しかし、小さなタンパク質および/ ​​または粒子と細胞を注入する手法を制限し、この印刷技術とともに（〜10 nm）で作成された細孔のサイズに制限があります。8,9,11 プリンタの標準のHP DeskJet 500プリンタは、セルの印刷を可能にするために変更されました。3、5、8カバーを取り外し、紙送り機構は、機械的なレバーを使用して取り消されました。ステージは、直接プリントヘッドの下に顕微鏡スライドとカバースリップの配置を可能にするために作成されました。インクカートリッジは、開かれたインクを除去し、それらが細胞を使用する前に洗浄した。印刷パターンは、単純な印刷コマンドを使用してプリンタを制御する標準的な描画ソフトウェアを使用して作成されています。 3T3線維爆発は、コンフルエンスまで増殖トリプシン処理し、リン酸塩に再懸濁させた水溶性の蛍光標識されたG-アクチンモノマーと酸緩衝生理食塩水。細胞懸濁液は、インクカートリッジに分注した、細胞の行は、ガラス顕微鏡カバースリップ上に印刷された。生細胞は蛍光顕微鏡を用いて画像化され、アクチンは細胞質全体に発見されました。細胞への蛍光アクチンの取り込みは、短時間細胞骨格ダイナミクスのイメージングを可能にし、幅広い用途に有用である。13から15

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

bioprinterにHP DeskJet 500プリンタを変換するために使用されるメソッドの説明を参照してください。プリンタは、膜に一時的な毛穴の原因となる生きた細胞を処理することができます。これらの孔は印刷された細胞に蛍光G-アクチンを含む小分子を、組み込むために利用することができる。

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K ビュー.  Clemson University. bioprinterにHP DeskJet 500プリンタを変換するために使用されるメソッドの説明を参照してください。プリンタは、膜に一時的な毛穴の原因となる生きた細胞を処理することができます。これらの孔は印刷された細胞に蛍光G-アクチンを含む小分子を、組み込むために利用することができる。

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

生物工学

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.