Die Autoren bedanken sich bei Dr. Thomas Boland für die Idee, die HP DeskJet-Drucker für die Zell-Druck bestätigen. Finanzierung für dieses Projekt von NSF RII-EPS-0903795 und NIH-K25 HL0922280.

1. Die Umwandlung des HP DeskJet 500 Es sei darauf hingewiesen, dass diese Technik sollte mit vielen kommerziell Tintenstrahldrucker arbeiten. Allerdings neigen ältere Drucker besser zu funktionieren, wie sie Tintenpatronen mit größerem Durchmesser Düsen, die nicht verstopfen nicht so leicht zu benutzen. Darüber hinaus neigen ältere Drucker mechanische Papierzuführung Sensoren, die leichter zu umgehen können verwendet werden. Drucker mit optischen Sensoren kann ausgetrickst werden, aber mit einem kleinen Streifen Papier auf dem äußersten Rand des Druckers bei jedem Zyklus, ist aber ein bisschen schwieriger als das mechanische System zu &quot;Trick&quot;. Die derzeit im Handel erhältlichen Drucker, die die beste Arbeit haben niedrige Auflösung (DPI). Höhere Auflösung Drucker tendenziell leichter verstopfen. Die Auflösung des HP Deskjet 500 von 300 dpi. Es gibt viele im Handel erhältlichen Drucker (HP Deskjet Serie und andere), die eine Auflösung von 600 DPI haben. Diese Art von Drucker kann mit nur einem geringen Anstieg der Düse verwendet werdenFragen, die Verstopfung lindern mit sorgfältiger Reinigung werden (Abschnitt 3) können. <ol><li> Entfernen Sie die obere Plastikgehäuse des Druckers durch das Entriegeln mehrerer Kunststoff-Clips von der unteren Boden des Druckers und langsam Heben Sie die Spitze. </li><li> Abschrauben Taste / Anzeige Leuchtplatte von der Oberseite des Druckers, so dass es an den Drucker der Hauptplatine verbunden. </li><li> Reinigen Sie das Innere des Druckers, vor allem die Bereiche, in denen die Tintenpatrone ruht und wo Druck auftritt. </li><li> Suchen Sie die Kabel Stromversorgung der Papiertransportmechanismen und ziehen Sie sie aus dem Motherboard. <ol><li> In der HP DeskJet 500, werden diese direkt unter der Papierkassette auf die linke Seite der Vorderseite. </li></ol></li><li> Suchen Sie Papier Erkennungsmechanismus. Umgehen Sie den Mechanismus, durch Anbringen einer Schnur oder Drahtschlinge als Handzuggriff dienen. <ol><li> In der HP DeskJet 500 ist das Papier Mechanismus zur Erkennung einer grauen Kunststoff-Hebel oberhalb und hinter dem Druck / Papier Zuführmechanismus gefunden. </li></ol></li><li> Erstellen Sie eine Bühne vor den Papiereinzug (wo das Papier aus würde gefüttert werden und abgelagert), um die gewünschten Druck-Folien auf ein Niveau knapp unterhalb der Patronen-Druckkopf bringen. <ol><li> Für unsere Experimente wurde der Schaum Versandkosten Halter für 15 ml Zentrifugenröhrchen mit mehreren Objektträger in in dem Druckbereich mit Klebeband an die letzte Stufe der Folien auf die gewünschte Höhe zu bringen verwendet. </li></ol></li><li> Um aseptische Technik zu halten, kann der Drucker in einem Standard-biohazard Schrank oder auf dem Tisch Sterilbank platziert werden. </li><li> Es ist wichtig zu beachten, dass die Modifizierung eines handelsüblichen Tintenstrahl-Drucker wird in der Regel Schäden sind von der Herstellergarantie. </li></ol> 2. Konvertieren Stock HP Tintenpatronen (Schwarz HP 26 Tintenpatronen) <ol><li> Nehmen Sie die Patrone aus der Verpackung, so dass die schützende Schutzstreifen von den Kontakten und Drucker Druckkopf für den Augenblick. </li><li> Stabilisieren den Körperder Kartusche (schwarz Portion) entweder mit einer Klammer oder Schraubstock (einfach fest Greifen Sie die Patrone mit der Hand gearbeitet als auch in der Regel), so dass die grüne Spitze frei von jedem Hindernis. </li><li> Mit einer Zange oder einem verstellbaren Schraubenschlüssel, fassen Sie die grüne Oberseite der Patrone und drehen hin und her, einige Male, bis er bricht frei. <ol><li> Dies sollte nicht viel Kraft, aber die Spitze wird nicht mehr benötigt, so ist es okay, wenn es beim Entfernen sie bricht. </li></ol></li><li> Mit Schraubendreher, abhebeln durchsichtigen Kunststoff Stück jetzt ausgesetzt. <ol><li> Auch dies dürfte sich nicht viel Kraft, aber es wird nicht nötig sein, so ist es okay, wenn es während der Entfernung bricht. </li></ol></li><li> Restlicher aus dem Reservoir. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Schutz-Schutzstreifen von den Drucker-Kontakte und Druckkopf. </li><li> Gründlich spülen die Reservoirs mit Wasser. <ol><li> Verwenden Sie eine Pipette oder Spritze, um Wasser durch die Kanäle schieben. </li><li> Wasser wird wahrscheinlich aus dem Druckkopf lecken währendDieses Verfahren, das akzeptabel ist, und nicht nachteilig auf die Funktionalität der Patrone. </li></ol></li><li> Bei klarem Wasser läuft, lassen Sie die Patrone, um zu trocknen. </li></ol> 3. Reinigung Tintenpatrone <ol><li> Um eine saubere Druckumgebung zu halten, ist die Tintenpatrone vor und nach Gebrauch gereinigt werden. <ol><li> Dies hilft auch mit der Vermeidung Kristallisation von Salzen und anderen biologischen Materials in der Kartusche, die Verstopfungen führen kann. </li></ol></li><li> Voll tauchen die Patrone in ein Becherglas voll von de-ionisiertem Wasser, und beschallen für 15 Minuten vor und nach dem Druck. </li><li> Nach der Beschallung, entfernen Sie die Patrone aus dem Wasser, und schütteln Sie überschüssiges Wasser ab. </li><li> Spray 70% Ethanol in die Patrone, um eine keimfreie Umgebung zu schaffen. <ol><li> Sicherstellen, dass das Ethanol wurde vor Aufnahme des bioink Drucklösung getrocknet. </li></ol></li></ol> 4. Machen Zellsuspension - &quot;BioTinte &quot; <ol><li> Kultur-Zellen erst unmittelbar vor der Passage. <ol><li> Für 3T3-Fibroblasten: Samen Zellen auf T-75-Kolben bei etwa 1.3x10 4 Zellen / cm 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Kultur Zellen für zwei Tage in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Machen fluoreszierenden G-Aktin-Stammlösung mit einer Konzentration 50 ug / ml in Phosphatpuffer (PBS). </li><li> Passage-Zellen. <ol><li> Für 3T3 Fibroblasten: Entfernen Sie das Medium aus Kolben und zweimal mit PBS spülen. Decken-Zellen mit 5 ml 0,25% Trypsin + EDTA und Inkubation für 5 Minuten. </li><li> 5 ml frisches Medium pipettieren und die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. Saugen Sie verbrauchte Medium. </li></ol></li><li> Die Zellen in PBS mit fluoreszierenden G-Actin-Stammlösung zu bioink erstellen. <ol><li> Bioink sollte eine Endkonzentration von G-Aktin von 10 pg / ml und einer Zelle concentration von 1x10 5 Zellen / ml. Diese Konzentration wurde optimiert, um Anzahl von Zellen pro Tropfen und Verstopfen des Druckkopfes zu begrenzen. 8 </li><li> Beachten Sie, dass 250 ul bioink drei Deckgläser mit dem Muster in Abbildung 2 dargestellt druckt. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Power on und damit der Drucker sich aufzuwärmen. </li><li> Die gewünschte Druckoberfläche (hier verwenden wir 22 mm x 22 mm-Deckgläschen) auf der Mitte der Bühne im Schritt 1.6 hergestellt. </li><li> Erstellen Sie ein Druckmuster-Datei. <ol><li> Öffnen Sie Microsoft Word (oder ein anderes Zeichen-Programm), und ziehen Sie das gewünschte Muster. </li><li> Wählen Sie einen gewünschten Druckmuster für die Zell-Druck in der vorgefertigten Datei. </li></ol></li><li> Legen Sie das vorbereitete Kartusche mit gewünschten Zellsuspension. <ol><li> Pipette Suspension in die kleine kreisförmige auch an der Unterseite der Kartuschenkammer. Verwenden Sie etwa 100-120 ul Lösung. Die gedruckte Tropfengröße ist etwa 130Picoliter. 8 </li></ol></li><li> Drucken Sie die Datei mit dem HP Deskjet 500 Drucker. <ol><li> Für beste Ergebnisse ausdrucken kleinere Muster mehrfach (5), durch Änderung der Anzahl von Kopien im Textverarbeitungsprogramm gewünscht. </li></ol></li><li> Drucker wird wieder aufwärmen, dann Kartusche wird auf die &quot;ready position&quot; zu bewegen. </li><li> Als Patrone in die Ausgangsposition (leicht nach links von der Tinte tropft deutlich unter und bleibt dort) bewegt, ziehen Sie den Papiereinzug Draht und Drucken beginnen sollte. <ol><li> Für mehrere Kopien des Druckens wird die Papiervorschubmechanismusabschnitt müssen nach jedem Zyklus oder gedruckt erscheinen. Die Kassette wird dann an den &quot;ready&quot;-Position zurück, und der Papiereinzug Draht sollte wieder angehoben werden. </li></ol></li><li> Der Drucker wird auf das Deckglas auf die Mitte der Druckphase in Schritt 5.2 gesetzt (siehe Abbildung 2) zu drucken. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse &lt;/ P&gt; Die repräsentativen Ergebnisse der gesamten Umwandlungsprozess von einem Standard, off-the-shelf HP Deskjet 500, werden Standard-Patronen HP 26 Serie einen Drucker mit der Möglichkeit des Druckens Zelle Lösungen für viele Arten der Analyse, wie oben angegeben. Die fertige Drucker nach der Umwandlung wird in 3 gezeigt, mit einem Druck bis das Mikroskop Deckglas auf platzieren. Der Drucker kann in der Analyse nützlich in vielen Bereichen, einschließlich aber nicht beschränkt auf: einzelne Zelle Mechanik, Tissue Engineering, Gentransfektion, Biosensor Mikrostrukturierung und direkte Zelltherapien 1-10, 16-22. In diesem Beispiel wurden ein HP Deskjet 500 Drucker und HP 26 Serie Tintenpatronen für Bioprinting geändert. Mit Hilfe dieser Einrichtung des Druckers mit einem bioink bestehend aus einem Fibroblasten-Zell-Suspension in einem G-Aktin Monomer-Lösung wurden die Zellen auf Glas-Mikroskop-Deckgläsern gedruckt. Abbildung 1 zeigt repräsentative res<html> ultate von gedruckten Fibroblasten-Zellen, die eingearbeitet fluoreszierende Aktin Monomere zeigen. Die Ergebnisse wurden in einer kontrollierten aseptischen Umgebung, in der die Zellen in gestaltbare Mustern bedruckt wurden erhalten. Das Muster in diesem Beispiel verwendet wurde in Microsoft Word (2) erstellt. Dieses Muster erzeugt eine durchgehende Linie von der Druck-Lösung über die Mehrheit der Objektträger. Abbildung 4 zeigt die gerade Linie, in der die Zellen gegenseitig bioink und abgelagert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass unmittelbar nach dem Drucken, gibt es eine Zunahme der Hintergrund-Fluoreszenz, da die bioink Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, enthält freie überschüssigen fluoreszierenden Actinmonomeren werden. Diese Hintergrundfluoreszenz signifikant abnimmt nach der Zugabe von Wachstumsmedium auf die Zellen (Abbildung 1), die überschüssige Monomer wäscht aus dem Substrat. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Repräsentative Bilder 3T3 Fibroblasten 3 Stunden nach dem Druck mit dem modifizierten Tintenstrahldrucker. Das Innere der Zellen zeigen eingearbeitet fluoreszierend markierten Aktin-Monomeren. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendet werden, um bioink Printdesign. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Abbildung 3. Drucker nach der Konvertierung mit Styrofoam Bühne. Das orange Kabel in der Mitte umgeht den Papiervorschub Hebel-Sensor. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> 4. Repräsentatives Bild-3T3-Fibroblasten in einem lokalisierten Druckzone gedruckt. Mikroskopie aufgenommene Bild 5 Minuten nach dem Druck bei 20-facher Vergrößerung. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Fluoreszenzbild (40fache Vergrößerung) 3 Stunden nach dem Druck, die einen Fibroblasten mit verinnerlichten fluoreszierende Actinmonomeren genommen. Maßstabsbalken repräsentiert 50 um. <img alt="Abbildung 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> 6. Fluoreszenzmikroskopie (20-facher Vergrößerung) einer Zelle 15 Minuten nach dem Druck gemacht. Das Bild zeigt sowohl g-Aktin (grün) und den Kern (blau). Von links nach rechts: G-Aktin mit Alexa Fluor 488, Kern mit DAPI, und einem Overlay aus beidem. <img alt="Abbildung 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> 7. Fluoreszenzmikroskopie zeigt zwei Fibroblasten in einem Linienmuster 3 Stunden nach dem Drucken. Bild links zeigt fluoreszenzmarkierten Actinmonomeren innerhalb der Zellen. Bild rechts ist eine Überlagerung der Fluoreszenz-Kanal mit dem Hintergrundbild zu zeigen, dass obwohles können einige Rückstände auf der Folie (unten links) sein, ist das nicht fluoresziert. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um, wenn Größe nicht angegeben Ganz rechts ist eine Kontrollgruppe von nicht bedruckten Zellen für 3 Stunden mit fluoreszierend markierten Monomeren inkubiert. Diese Kontrolle soll zeigen, dass Monomere konnte nicht die Zellmembran zu durchdringen, ohne Membranpermeabilisierung Zelle durch Druck.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Der Prozess um einen handelsüblichen Tintenstrahl-Desktop-Drucker für Bioprinting konvertieren ist nicht besonders schwierig. Die größte Herausforderung Schritt ist die Bestimmung, wie man den Papiereinzug, die abhängig von der Marke und Modell des Druckers verwendet wird, ist zu umgehen. Dies ist jedoch relativ einfach, wenn die Papierzuführung Sensor mechanische wie hier beschrieben. Bei Modellen mit optischen Sensoren Feeds können auch andere Techniken müssen eingesetzt werden, um den Drucker zu denken, es wird die Verwendung von Papier Trick sein, zum Beispiel, kann man ein kleines Stück Papier durch den Drucker laufen, während es auf dem Objektträger druckt. Umgehen der Papiereinzug ist wahrscheinlich der schwierigste Schritt bei der Anwendung dieser Verfahren auf verschiedene Druckermodelle zu sein. Wenn er eine Bühne, um die Deckgläser zum Drucken zu halten, ist es wichtig, die richtige Ausrichtung und Höhe festzulegen. Die Phase sollte das Deckglas in der Mitte des Druckbereichs gebracht werden können. Darüber hinaus sollte es plACE das Deckglas in ausreichender Höhe, damit Freiraum für die Druckpatrone zu übergehen die Folie ohne Unterbrechung es. Die genaue Höhe der Bühne wird vom Druckermodell ab. Um sicherzustellen, dass Zellen nicht gedruckten weggewaschen zu werden, wurden die Objektträger in einem Inkubator sofort nach dem Druck für etwa 30 Minuten, um die Zellanheftung zu ermöglichen, bevor zusätzliche Wachstumsmedium zugegeben angeordnet. Da die Zellen wurden in einer Lösung, die große Mengen PBS werden die Zellen nicht austrocknen und lebensfähig geblieben sind gedruckt. Die Zellen wurden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Verteilung der markierten Aktinmonomere innerhalb der Zelle (Fig. 1, 5-7) zu visualisieren. Beim Drucken mit 3T3-Fibroblasten, zeigt 5 ein repräsentatives Ergebnis, wobei die Aktin was viel der Zelle zu fluoreszieren, aber präsentiert Linien erhöhter Helligkeit. Der Einbau von fluoreszenzmarkierten G-Aktin in das Zytoskelett istnützlich für das Studium der Zytoskelett-Dynamik und zelluläre Mechanik. 12-15 Ein Problem bei dieser Vorgehensweise ist, dass es nur für Moleküle und Proteine, die einen Durchmesser kleiner als etwa 10 nm ist. Um sicherzustellen, dass die Zellen tatsächlich wurden durch die umgewandelte Drucker verarbeitet wurde DAPI (1:5000 in PBS) an die bioink anstelle von Hälfte des Volumens an reinem PBS gegeben. Die Fluoreszenzfarbstoff DAPI bindet an Amino Säure-reichen Abschnitten der DNA im Kern lokalisiert. Deshalb DAPI ist ein nützliches Fleck in fluoreszierend bildgebenden Kerne der gedruckten Zellen. Abbildung 6 zeigt ein repräsentatives Bild einer Zelle angezeigt werden sowohl Alexa Fluor 488 (Aktin) und DAPI (Nukleus) mit einem Fluoreszenz-Overlay-Bild von beiden. Abbildung 7 zeigt auch, wie die Zellen werden einmal fluoreszieren die Aktinmonomere aufgenommen wurden, während nicht-biologische Material, das in der Probe abgeschieden wurde nicht aufgrund der Fluoreszenz absence von G-Aktin-Monomeren. Eine wichtige Überlegung für Bioprinting ist das wässerige Medium wird für die bioink verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Standard-Zellwachstum Medien mit Serum ergaben widersprüchliche Ergebnisse. Dies ist höchstwahrscheinlich aufgrund einer Verstopfung der Düsen-Druckkopf durch Serumproteine. Die Verwendung von PBS erhöht die Konsistenz der gedruckten Muster, und die Anzahl der Zellen abgeschieden. Ein Nachteil bei der Benutzung PBS ist, dass Zellen nicht in die Suspension für längere Zeit bleiben. Jedoch waren Fibroblasten in diesen Beispielen können die bioink Bedingungen für mindestens eine Stunde ohne Änderung der Lebensfähigkeit der Zellen zu tolerieren. Dies steht im Einklang mit mehreren vorherigen Befunden, wonach Zellen über Thermo-Inkjet-Mechanismen gedruckt wurde gezeigt, dass hohe Überlebensraten haben berichten. 8.2 Dieser modifizierte Drucker-Setup kann für andere Anwendungen als Zell-Druck verwendet werden. 16-22 Matrixproteine, wie Kollagen oder fibronectin, kann problemlos auf Substraten mit dieser Technik, die nützlich sein können für Zell-Musters gedruckt werden. Zum Beispiel, Kollagen Typ I in Linienmuster wird in Kollagen ausgerichtet Substrate, die für In-vitro-Untersuchungen an Zellkulturen. 17 verwendet werden Zusätzlich zu Matrixproteine, anderen Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren führen kann gedruckt werden, können zuverlässig auf Substrate werden für die Zell-Studien lokalisiert und Potenzial für therapeutische Anwendungen. 18 Eine wesentliche Einschränkung des Designs in den oben beschriebenen Schritte ist, dass der Drucker nicht drucken kann in mehr als einer Dimension. Dies begrenzt das Potential für die Verwendung in Anwendungen wie strukturiert Gerüst Druck. Um 3D-Druck zu ermöglichen, muss eine spezielle Stufe verwendet werden. Die Bühne muss inkrementelle Höhenverstellungen für Schicht-für-Schicht-Abscheidung von bioink haben. Bioprinting hat Versprechen als effizientes und kostengünstiges Verfahren für das Tissue Engineering gezeigt, Gentransfektion, Mikrostrukturierung und Microarray-Fertigung 1-12, 16-22 Die zukünftige Anwendungen dieser Art von Gerät es zahlreiche, unter anderem:. Schaffung gesteuert und strukturiert zelluläre Mikroumgebung, die Aufnahme von Makromolekülen in Zytoplasma, und die Ablagerung von Zellen auf Gerüsten und Strukturen, die natürlicherweise nicht vorkommen oder effizient.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> HP DeskJet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Nicht mehr vom Hersteller. Gekaufte refurbished Dezember Trader. </td></tr><tr><td> HP 26 Black Ink Cartridge </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> Aktin aus Kaninchen-Muskel, Alexa Fluor 488 konjugiert, 200 ug </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Einsatz bei 0,5% in Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Einsatz bei 0,5% in Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Unidirektionalen Fluss Reinluftarbeitsplatz </td><td> Envirco </td><td> VLF-797 </td><td> Optional Gehäuse für die Aufbewahrung Drucker aseptische </td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprinting verfügt über eine breite Palette von Anwendungen und die Bedeutung, einschließlich Tissue Engineering, direkte Zell-Therapien Anwendung, und Biosensor-Mikrofabrikation. 10.1 Vor kurzem hat Thermo-Inkjet-Druck auch für die Gen-Transfektion verwendet worden. 8,9 Der Thermo-Inkjet-Druckverfahren wurde gezeigt, zeitweilig den Zellmembranen ohne Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Die transiente Poren in der Membran verwendet werden, um Moleküle, die ansonsten zu groß, um durch die Membran hindurchgehen, würde in das Cytoplasma der Zelle. 8,9,11 einzuführen Die Anwendung, die hier gezeigt ist die Verwendung von thermischen Tintenstrahldruck für den Einbau von fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere in Zellen. Der Vorteil der Verwendung thermischen Tintenstrahldruck, um Moleküle in Zellen zu injizieren ist, dass die Technik relativ gutartigen für Zellen ist. 8, 12 Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Drucken wurde gezeigt, dass ähnlich wie Standard-Zelle PLAting-Methoden 1,8. Darüber hinaus können Tintenstrahldrucksystem Tausende von Zellen in Minuten verarbeiten, der viel schneller, als wenn die Mikroinjektion. Die Poren, die durch Druck erstellt wurde gezeigt, dass innerhalb von zwei Stunden zu schließen. Es gibt jedoch eine Grenze für die Größe der Poren erzeugt (~ 10 nm) mit dieser Drucktechnik, die die Technik begrenzt, um die Injektion von Zellen mit kleiner Proteine ​​und / oder Partikel. 8,9,11 Ein Standard-Drucker HP DeskJet 500 wurde modifiziert, um für die Zell-Druck zu ermöglichen. 3, 5, 8 Die Abdeckung des Druckers wurde entfernt und der Papiereinzug war umgangen werden mit Hilfe eines mechanischen Hebels. Eine Bühne wurde geschaffen, um für die Platzierung von Objektträgern und Deckgläsern direkt unter dem Druckkopf zu ermöglichen. Tintenpatronen geöffnet wurden, wurde die Tinte entfernt und sie wurden vor ihrer Verwendung mit Zellen gereinigt. Die Druckmuster wurde erstellt unter Verwendung von Standard-Software Zeichnung, die dann kontrolliert den Drucker über einen einfachen Befehl print. 3T3-FibroBlasten wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, mit Trypsin behandelt, und dann in Phosphat-gepufferter mit löslichen fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere Kochsalzlösung. Die Zellsuspension wurde in die Tintenpatrone pipettiert und Zeilen-Zellen wurden auf Glas-Deckgläschen gedruckt. Die Live-Zellen wurden aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie und Aktin wurde während der gesamten Zytoplasma gefunden. Der Einbau von fluoreszierenden Aktin in die Zelle ermöglicht zum Abbilden der Kurzzeit-Zytoskeletts und wurde für eine breite Palette von Anwendungen nützlich. 13-15

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K Aufrufe.  Clemson University. Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.

Serie: Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Steigende cDNA Erträge aus Einzel-Zell-Mengen von mRNA in Standard Laboratory Reverse-Transkriptase-Reaktionen mit Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.