עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).

1. הגדרת ההקלטה חדר ההקלטה הוא רכוב על המיקרוסקופ ניקון TE2000U אקליפס הפוך עם אופטיקה לעומת השלב בו מצויד על שולחן אוויר וחשמל מוגן באמצעות כלוב פאראדיי. חדר הקלטת פרספקס מורכב משני חלקים מופרדים באופן חלקי על ידי מחסום והודבק על גבי זכוכית silanized. בחלקו האחד של החדר משמש ליישב את התאים ואילו השני משמש לגירוי חשיפה במהלך ההקלטה המוקדמת כדי למזער את החשיפה של התיישב אך עדיין אינם בשימוש תאים לodorant. הגדרת ההקלטה מורכבת מפיפטה שאיבה (ראה בהמשך) עלתה בבעל פיפטה pelleted והאלקטרודה קרקע. פיפטה היניקה תמוקם באמצעות micromanipulator. פתרוני תמריצים מיושמים באמצעות צינור מרובע זכוכית משולשת חבית, עם כל צינור מרובע להיות 0.7 מ&quot;מ x 0.7 מ&quot;מ. הזכוכית משולשת החבית הייתה קשורה למערכת ממונעת מהירה צעד זלוף רכוב על מניפולטור (Sutter SF-77B, וורנר מכשירים) ונכנסו לחדר ההקלטה בזווית של 45 מעלות ~. סוף כוס החבית המשולשת היה משופע בזווית של 45 מעלות שוב כאלה שהפנים הסופיים (פתיחה) של הזכוכית משולשת החבית היו אנכיים, כדי לאפשר מיקום קרוב של פיפטה. האלקטרודה פיפטה יניקה מלאה פתרון סטנדרטי יונקי רינגר והאלקטרודה הקרקע מחוברת לheadstage 1 GΩ של מגבר מהדק תיקון (PC-501A, וורנר מכשירים) במצב מהדק מתח. האות האנלוגית מהמגבר (נמוך לעבור סינון בשעת 5 קילוהרץ) מוצגת באוסצילוסקופ דיגיטלי לנטר את האות בזמן אמת וגם מחוברת ל8-מוט Bessel מסנן (קרוהן-הייט) שבו האות נמוכה לעבור סינון בתדר 50 רץ. שני האותות (נמוך לעבור סינון בkHz 5 ו 50 הרץ) מוזנים לתוך / D ממיר (MKII קיימברידג&#39; האלקטרונית עיצוב המייקר 1401) אשר מחובר למחשב נתונים לרכישה. הנתונים נרשם באמצעות האותות 3 ACQuisition תוכנה (עיצוב אלקטרוני קיימברידג&#39;) בתדר דגימה של 10 קילוהרץ. האות מוקלטת בשני התדרים השונים כדי להקליט את הקולטן הנוכחי יחד עם פוטנציאל פעולה על גבי זו ולאחר מכן הקולט הנוכחי בלבד (ראה איור. 2) 1. מערכת זלוף משמשת כדי לעבור במהירות בין פתרון רינגר (שליטה) וגירויי odorant או כל פתרון של קומפוזיציה רצויה והוא נשלט על ידי 3 תוכנת המחשב ואותות. הפתרונים כלולים ב60 מיליליטר מזרקים וקצב הזרימה נשלט על ידי וסת זרימת עירוי רפואי בדרגה. בדרך כלל, קצב הזרימה מוגדר 1 מ&quot;ל / דקה. השאיבה בפיפטה ההקלטה נשלטת באופן הבא: יציאת הצד של בעל פיפטה מחוברת לקו נפט אשר בתורו מחובר למאגר נפט הגובה מתכוונן. העלאה או הורדת המאגר מבטיחה שלחץ פיפטה ולכן זרימת רינגר דרך קצה עמ &#39;ipette הוא מינימאלי ומעט חיובי. שאיבה או לחץ נוספת יכולה להיות מיושמת באמצעות צינורית מחוברת למרחב האווירי של המאגר בשופר בקצה השני למצוץ גוף התא של orn מבודד בקצה פיפטה ההקלטה. הניסויים מבוצעים על 37 מעלות צלזיוס, כדי לדמות את המצב הפיזיולוגי המולד של התא באופן הדוק. הטמפרטורה נשלטת על ידי עובר את הפתרונים דרך הסקת מחוייט אשר מורכבת מנגדים קרמיים שדרך צינורות נירוסטה המכילים את הפתרונים שהם עברו 10. הטמפרטורה היא פיקוח באמצעות מדחום תרמי (פלוק). 2. פתרונות הפתרון של רינגר יונקים (מ&quot;מ): 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA, 10 HEPES, 10 גלוקוז. PH הותאם ל 7.5 עם NaOH. 10% תמיסה מדוללת של רינגר שמשה למדידה לצומת נוכחית. Odoraפתרוני nt: Acetophenone וeugenol הוכנו יומי בתמיסה של רינגר 20 ממניות DMSO מ&quot;מ. 3. ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זכוכית ורוסיליקט unfilamented נימים בחולץ סאטר P-97 micropipette ולמשוך micropipette עם להתחדד ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פיפטה לבעל micropipette מחוייט רכוב על מיקרוסקופ Eclipse E200 ניקון אשר בתורו המצויד בreticle בעינית וסכין יהלום מטלטלין רכובים על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד על קצה פיפטה תחת 20x האובייקטיבי ובאמצעות reticle כמדריך; עדינות הסופר פיפטה בזווית של 90 מעלות באמצעות סכין יהלום מחוייט בי פיפטה היא רחבה 10 מיקרומטר (קוטר חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את סכין יהלום נוסף לקראת הקצה ובהדרגה תפעיל לחץ על הקצה עם סכין היהלום. קצה פיפטה צריך לשבור נקי בנקודה שבה היה לשייף. </li></ol> לחלופין צעדים 3.1 ל3.4 ניתן לשלב וpipettes ניתן משך עם ממדים רצויים ישירות ללא צורך לחתוך את קצה פיפטה, למרות שזה יכול להוכיח קשה יותר למשוך אמין pipettes בקוטר כה גדול עצה וקצוות נחתכו באופן מדויק. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אובייקטיבי 40X, לפטר ללטש קצה פיפטה לקוטר פנימי של 5 מיקרומטר באמצעות חוט חשמלי מחומם. פעם סיים, micropipette מוכן לשמש להקלטה מזרמי ORNs עכבר. התנגדות פיפטה הפתוחה צריכה להיות סביב 1 MΩ כאשר התמלא רינגר. </li></ol> 4. בידוד של תאי עצב קולטני ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר בעקבות הנחיות ותקנות מוסדיות. הסר את ראשו, מקלף את העור שמעל הגולגולת ומדיאלית חוצה את הראש לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את 2 hemi-הראשים תחת stereomicroscope לנתח, לשלוף את מחיצת האף ולהסיר את turbinates הריח. מניח את כל הרקמות בצלחת פטרי עם ג גלוקוזontaining פתרון Ringer של יונקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל אפיתל ההרחה את הסחוס הבסיסי משתי turbinates ולהעביר את הרקמה לתוך צינור המכיל אפנדורף רינגר μl 250. אנו משתמשים ברקמה מ2 turbinates כדי לקבל את הצפיפות הנכונה של תאים לגודל של חדר ההקלטה שלנו. אחסן את הרקמה שנותרה ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור אפנדורף מכיל אפיתל ההרחה פעמים לזמן קצר ל1 שניות במהירות בינונית. צעד זה מוביל לניתוק מכאני של ORNs מהאפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פתרון רינגר המכיל את ORNs ניתק בתא ההקלטה. הסר פיסות גדולות של רקמה גם בהווה בהשעיה באמצעות מלקחיים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן ORNs להתפשר על 20 דקות לפני תחילת superfusion הרציף עם צלצול ולהמשיך להקלטות. </li></ol> 5. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את האלקטרודה היניקה המחוברת לקו השמן לתוך תא ההקלטה וregulאכלתי את הגובה של מאגר הנפט להקים לחץ חיובי מעט בקצה פיפטה. ניתן לעשות זאת על ידי התבוננות פסולת תא למשל מתרחקת (לחץ חיובי) או לכיוון (לחץ שלילי) פיפטה. נסה שלא לזהם את קצה פיפטה בפסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את חדר ההקלטה לorn מבודד שיכול להיות מוכר על ידי המורפולוגיה דו הקוטבית הטיפוסית שלה באמצעות הגדלה של 20-40X. העבר את החוט הרושם לקרבה של גוף תא orn. מתחיל למצוץ בעדינות, כך שהגוף נכנס לתא קצה פיפטה. לאט ובזהירות ימשיך לחול יניקה עד שגוף התא כולו נשאב אל קצה פיפטה היניקה, עוזב דנדריט והריסים נחשפו לפתרון האמבטיה. לקבלת תמונות של ORNs ינק וצורות פיפטה לראות 7,11. ודא שברגע שאין יניקה מוחלת, orn לא זז פנימה או החוצה של פיפטה. אם כך, להתאים את הגובה של מאגר הנפט בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימושmicromanipulators, להעביר את צינורית השאיבה מהמקטע המכיל את ORNs התיישב לסעיף ההקלטה של ​​קאמרי. זהירות למקם את פיפטה היניקה מול הצינור 3-הקנים להחלפת פתרון. פיפטה היניקה צריכה להיות ממוקמת קרוב מספיק לפתיחת הצינור 3-הקנים כך שorn חשוף לזרימה למינרית וכך להימנע ממערבולת ערבוב ולהשיג תמורה מהירה פתרון. חילופי הפתרון מושגים על ידי דריכת הממשק בין זרמים מקבילים של פתרון זורם על פני קצה פיפטה היניקה. כמובן הזמן של חילופי הפתרון הוא בדרך כלל סביב 20 מילישניות, נמדדו מהצומת הנוכחית עורר על ידי דריכת התא בין פתרונות של הרכב יוני שונה (ראה איור. 2). פתרונות מועברים על ידי כוח הכביד. </li></ol> &lt;כיתת תוחלת = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. נציג תוצאות <img alt="איור 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> איור 1). A נוירונים קולטניים דו קוטבי בנורת חוש הריח. B) מכונות מעבר אותות בסופו של דבר מובילות לריסים מעוררי גל נוכחי. שלילת הקוטביות התפתחה מפעילה דור פוטנציאל פעולה בגוף התא. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> תרשים 2 מציג את המהירות ואמינות של חילופי פתרון. פיפטה הוגברה מרגיל לצלצול דילול של 10% עבור 100 אלפית נוכחי הצומת כתוצאה מהריכוז יוני השונה נרשם. עקבות השחורות היא השדזעם של 5 ניסויים, אדום להתחקות SD שלה. השינוי הקטן בSD במהלך חילופי הפתרון מוכיח אמינות של חילופי פתרון ממשפט למשפט וחוסר הרעש עודף בזרם או פתרון. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> איור 3 מציג תשובת eugenol מושרה מorn באמצעות טכניקת פיפטה יניקה. Orn נחשף לeugenol מיקרומטר 100 עבור 1 שני כפי שצוין על ידי הבר מעל ההקלטה. באיור. 3A (עקבות שחורות) הנוכחי הקולט היה מסונן ברוחב פס 0-50 הרץ כדי להציג את הקולטן הנוכחי רק איור.. 3B מציג את אותה קלטת, מסוננת עכשיו ברוחב הפס הרחב של 0-5000 רץ (אדום זכר) גם כדי להציג פוטנציאל פעולה (APS, מסומנת בחיצים). ההבלעה מציגה את אותו זכר בזמנים הרחיבו כדי להמחיש בצורה ברורה יותר נקודתי גישה בתחילת התגובה. <img alt="איור 4." srג = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; איור 4. משפחת מנת תגובה של orn eugenol-מגיב (). Eugenol שמש בריכוזים הנעים בין 0.3 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, משך הגירוי היה 1 של עקבות וסוננו ב0-50 רץ. עלייה הדרגתית בריכוז odorant הובילה לתגובה גדולה יותר ומהירה יותר, שגם הסתיימה בקצב איטי יותר לאחר חשיפת odorant הופסקה. ORNs יכול להציג דפוס תגובת oscillatory במהלך גירויים ארוכים בריכוזי odorant ביניים (איור 4 ב). הנה acetephenone (3 מיקרומטר) orn היענות היה מגורה במשך 8 שניות. לאחר שיא תגובה מהירה וחולפת בתחילת גירוי סדרה של תגובות קטנות יותר, חוזרות ונשנות הם נצפו. רוחב פס ההקלטה היה 0-50 רץ.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

המחברים אין לי מה לחשוף.

<p class="jove_content"&gt; טכניקת יניקת פיפטה היא שיטת אלקטרו שמשמש להקלטה נוכחי ריח המושרה האיטיים הקולטן ואת פוטנציאל הפעולה פאזית המהיר מorn בו זמנית. מאז קרום הפלזמה של התא לא נסדק, שיטה זו מותירה סביבה באין מפריע התאית להבטיח שתגובות odorant אינן משתנית בשל שינויים של ריכוזי cytoplasmic יון או הדילול של גורמים תאיים. ת?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של החומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> קטלוג / מספר דגם </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שולחן אוויר </td><td> ציוד </td><td> ניופורט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> משאבת אוויר </td><td> ציוד </td><td> ניופורט </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה פולר </td><td> ציוד </td><td> סאטר </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית </td><td> ציוד </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> ניקון אקליפס מיקרוסקופ ההפוך </td><td> ציוד </td><td> ניקון </td><td> TE2000U </td><td> מצויד במנורה כספית, GFP מסנן ויעדים 20X 5X ולפחות </td></tr><tr><td> המגבר PC-501A </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> סכין יהלום </td><td> ציוד </td><td> מחוייט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitizer Mikro1401 / D </td><td> ציוד </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> יחידת סינון 3382 </td><td> ציוד </td><td> קרון הייט תאגיד </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לאותת </td><td> תוכנה </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Molded Ag / AgCl גלולה </td><td> ציוד </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> בעל פיפטה </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0997 </td><td> מותאם אישית שונה כדי להתאים headstage </td></tr><tr><td> חדר הקלטה </td><td> ציוד </td><td> מחוייט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator MP85-1028 </td><td> ציוד </td><td> מכשיר סאטר </td><td> Micromanipulator MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> שמן מינרלים </td><td> פתרון </td><td> סיגמא </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> TDS אוסצילוסקופ 1001 </td><td> ציוד </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שפופרת זכוכית המרובעת של שלושה עם הקנה </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0119 </td><td> מזהה מ&quot;מ 0.6, 5 סנטימטרים ארוכים </td></tr><tr><td> שסתום </td><td> ציוד </td><td> החברה לי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td> ציוד </td><td> אוטומציה מדעית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צעד מהיר זלוף SF-77B </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert &amp; זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל - ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4. בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של &quot;טכניקת יניקת פיפטה&quot; לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.

Watch this Scientific Journal Video about Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique at JoVE.com

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Monell Chemical Senses Center. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

Video: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

שימוש יחיד Sensillum הקלטה לזיהוי תגובות חוש הריח Neuron של באגס במיטה לSemiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...