Bu çalışma NIH DC009613, İnsan Sınır Bilim Programı ve Morley Bakım Bursu (JR) tarafından desteklenmiştir.

1. Kayıt Ayarı Kayıt odasına bir hava masa üzerine takılan ve elektriksel bir Faraday kafesi kullanılarak korumalıdır faz kontrast optik ile Nikon TE2000U Eclipse inverted mikroskop üzerine monte edilir. Pleksiglas kayıt odasına iki bölümden kısmen bir bariyer ile ayrılmış ve bir Silanlanmış cam slayt üzerine yapıştırılmış oluşur. Odasının bir bölümü, diğer odorant için erken yerleşik maruz ancak henüz kullanılmamış hücreleri en aza indirmek için kayıt sırasında uyaran-poz için kullanılan en hücrelere yerleştirmek için kullanılır. Kayıt ayarları bir pelet pipet tutucu ve toprak elektrot monte emme pipet (aşağıya bakınız) oluşmaktadır. Emme pipet mikromanipülatör kullanılarak yerleştirilir. Stimulus çözümler her kare tüp 0,7 mm x 0,7 mm olmak üzere, üçlü-varil cam kare tüp kullanılarak uygulanır. Üçlü varil cam bir manipülatör üzerine monte edilmiş motorlu hızlı adım perfüzyon sistemi (Sut bağlandıter SF-77B, Warner Instruments) ve ~ 45 ° lik bir açı kayıt odasına girdi. Üçlü varil cam uç üçlü-varil cam nihai yüzü (açma) pipetin yakın konumlandırılması izin vermek için dikey olarak bu tür tekrar 45 ° &#39;lik bir açı ile eğimli edildi. Standart memeli Ringer solüsyonu ve toprak elektrotu ile dolu emme pipet elektrot voltaj kelepçesi modda bir yama klemp amplifikatörü 1 GΩ headstage (PC-501A, Warner Instruments) ile bağlanır. Amplifikatör (düşük geçiş 5 kHz&#39;de süzülmüş) gelen analog sinyal gerçek zamanlı olarak sinyalinin izlenmesi için bir dijital osiloskop gösterilen ve aynı zamanda sinyal geçiş filtre edilmiş düşük olan bir 8-kutuplu Bessel filtresi (Krohn-Hite) bağlanır 50 Hz. Her iki sinyal (5 kHz ve 50 Hz alçak geçiren filtre) veri toplama için bir bilgisayara bağlı bir A / D dönüştürücü (Cambridge Elektronik Tasarım Micro 1401 mkII) beslenir. Veri Sinyal 3 ACQ kullanılarak kaydedilir10 kHz örnekleme frekansında uisition yazılımı (Cambridge Elektronik Tasarım). Sinyali ilk olarak üst üste aksiyon potansiyeli ile birlikte akım reseptörü ve daha sonra tek başına akım reseptörü (bakınız Şek. 2) tespit etmek için iki farklı bant genişlikleri de kaydedilir. Perfüzyon sistemi Ringer (kontrol) çözüm ve odorant uyaranlar veya istediğiniz kompozisyonu herhangi bir çözüm arasında hızla geçiş yapmak için kullanılır ve PC ve Sinyal 3 yazılım tarafından kontrol edilir. Çözümler 60 ml şırınga içinde bulunan ve akış hızı tıbbi dereceli intravenöz akış düzenleyiciler ile kontrol edilir. Tipik olarak, akış hızı 1 ml / dakika olarak ayarlanır. Kayıt pipet üzerinde emme aşağıdaki biçimde kontrol edilir: pipet tutucu yan bağlantı noktası da yüksekliği ayarlanabilir bir yağ rezervuar bağlı olan bir yağ hattı bağlanmıştır. Yükseltilmesi ya da düşürülmesi rezervuar sağlar ki p pipet ucu ile basınç ve bu nedenle Ringer akımipette minimal ve hafif olumlu. İlave ya da emme basıncı kayıt pipet ucu içine izole edilmiş bir ORN bir hücre gövdesi emmek için diğer ucunda ağızlık ile rezervuar sahası bağlı bir tüp aracılığıyla uygulanabilir. Deneyler ° C&#39;ye yakın bir hücrenin doğal fizyolojik durumu simüle etmek amacıyla, 37 gerçekleştirilir. Sıcaklık çözümleri içeren paslanmaz çelik tüpler 10, üzerinden geçirilir seramik direnç oluşan bir ısmarlama bir ısıtıcı birim vasıtasıyla çözüm geçen tarafından kontrol edilir. Sıcaklığı termokupl termometre (Fluke) kullanılarak izlenir. 2. Çözümler Memeli Ringer solüsyonu (mM): NaCI 140, KCI 5, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0.01 EDTA, 10 HEPES, 10 glikoz. PH NaOH ile 7.5 &#39;e ayarlandı. % 10 nispi Ringer çözeltisi birleşme akımı ölçmek için kullanılmıştır. Odorant çözümler: Asetofenon ve eugenol 20 mM DMSO stoklarından Ringer çözeltisi günlük olarak hazırlanmıştır. 3. Elektrotlar Yapımı <ol><li> Bir Sutter P-97 mikropipet çektirmesi kılcal bir unfilamented borosilikat cam yerleştirin ve uzun konik bir mikropipet çekin. </li><li> Mercek ve sahne üzerine monte edilmiş hareketli elmas bıçak bir retikül ile donatılmıştır sırayla bir Nikon E200 Eclipse mikroskop üzerine monte ısmarlama bir mikropipet tutucu pipet aktarın. </li><li> 20x hedefi altında pipet ucu gözlemleyin ve retikül bir kılavuz olarak kullanarak; yavaşça kâtip pipet 10 mikron genişliğinde (dış çap) olduğu ısmarlama elmas bıçak kullanarak 90 ° açıyla pipet. </li><li> Ucuna doğru daha da elmas bıçak taşı ve kademeli elmas bıçakla ucunda basınç uygulayın. Pipet ucu tarif edildi noktada temiz ayrılmalıyız. </li></ol> Alternatif olarak 3.1 adımları3.4 kombine edilebilir ve böyle bir büyük uç çapı ve temiz kesim kenarları ile güvenilir pipetler çekmek için daha zor kanıtlayabilirim rağmen pipetler, doğrudan pipet ucu kesmek zorunda kalmadan istediğiniz boyutları ile çekilebilir. <ol start="5"><li> Bir 40x hedefi kapsamında, bir elektrikle ısıtılan filaman kullanan 5 mikron bir iç çapa pipet ucu lehçe ateş. Bittiği zaman, mikropipet fare ORNs gelen kayıt akımları için kullanılmak üzere hazırdır. Ringer ile dolu olduğunda açık bir pipet direnç 1 MQ civarında olmalıdır. </li></ol> 4. Olfaktör Reseptör Nöronlar İzolasyonu <ol><li> Kurumsal düzenlemeler ve yönetmelikleri takip fare Kurban. , Baş kaldır sıyırın cilt kafatasını örten ve medial orta hat boyunca kafasını ikiye bölmek. </li><li> Diseksiyon stereomikroskop altında iki hemi-kafa yerleştirin, nazal septum koparmak ve koku konkalar çıkarın. Glukoz c ile bir Petri kabındaki tüm doku yerleştirinMemeli Ringer solüsyonu ontaining. </li><li> İki konkalar gelen Altta bulunan kıkırdak kapalı olfaktör epitel soyun ve 250 ul Ringer içeren bir Eppendorf tüp içine doku transferi. Biz kayıt odasının boyutları için hücrelerin sağındaki yoğunluğu elde etmek için 2 konka doku kullanın. ° C daha sonra kullanmak için 4 de kalan doku saklayın. </li><li> Orta hızda 1 saniye boyunca iki kez kısaca olfaktör epitel içeren Vorteks Eppendorf tüp. Bu adım, epitel ORNs mekanik ayrışma yol açar. </li><li> Kayıt odasında ayrışmış ORNs içeren Ringer solüsyonu yerleştirin. Ince forseps kullanarak süspansiyonda da mevcut doku büyük parçalarını çıkarın. </li><li> ORNs Ringer sürekli superfusion başlamadan önce 20 dakika boyunca yerleşmek ve kayıtları devam edelim. </li></ol> 5. Kayıtlar <ol><li> Kayıt odasına ve Regul içine yağ hattına bağlı emme elektrotu Altpipet ucu hafifçe pozitif basınç oluşturmak için yağ haznesinin yüksekliği yedik. Bu pipetle (pozitif basınç) veya (negatif basınç) uzağa doğru hareket eden örneğin hücre artıkları gözlemlenerek yapılmaktadır. Hücre artıkları ile pipet ucu kontamine çalışın. </li><li> 20-40x bir büyütme kullanarak tipik bipolar morfolojisi tarafından kabul edilebilir bir izole ORN için kayıt odasına tarayın. ORN hücre vücudun yakın içine kayıt elektrodu taşıyın. Yavaşça hücre gövdesi pipet ucu girer böylece emmeye başlar. Yavaş ve dikkatli bir bütün hücre gövdesi banyo çözeltisine maruz dendrit ve kirpikler bırakarak, emme pipet ucu içine çekilir kadar emme uygulanmaya devam eder. Sucked ORNs Pipet ve biçimlere ait görüntüler için 7,11 bkz. Emme yok, bir kez uygulandığında, ORN pipet hareket ya da dışarı gelmez emin olun. Bu durumda, buna göre yağ rezervuar yüksekliğini ayarlamak. </li><li> Kullanmamikromanipülatörler, odanın kayıt bölümünde yerleşik ORNs içeren bölüm gelen emme pipet hareket eder. Çözelti değişimi için 3-namlulu tüp önünde emme pipet dikkatli bir şekilde yerleştirin. ORN böylece karıştırma sarsıntıları önleyen bir laminer akış maruz kalmışsa ve hızlı çözüm döviz elde etmek, böylece emiş pipet yeterince yakın 3 namlulu tüpünün açılması konulmalıdır. Çözelti değişimi emme pipet ucu boyunca akan çözelti paralel akış arasındaki ara basamak ile elde edilir. Çözümü değişim zamanı ders genellikle farklı iyonik kompozisyon çözümleri arasındaki hücre (bkz. Şek. 2) atlama tarafından uyarılmış kavşağından mevcut ölçülen yaklaşık 20 ms olduğunu. Çözümler yerçekimi tarafından teslim edilir. </li></ol> &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> Şekil 1. Koku ampul A) Bipolar reseptör nöronları. B) kirpikler içinde sinyal transdüksiyonu amaçlı nihai akım akışı eksitatör yol açar. Izleyen depolarizasyon hücre gövdesinde aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> Şekil 2, çözelti değişimi hızı ve güvenilirliği gösterir. Bir pipet 100 ms ve farklı iyon konsantrasyonu kaynaklanan kavşak mevcut kaydedildi% 10 sulandırılmış Ringer içine normalden adım atıldı. Siyah iz ave olduğunu5 çalışmaların öfke, kırmızı onun SD iz. Çözüm değişim sırasında SD küçük bir değişiklik deneme deneme ve çözüm akarsu ya aşırı gürültü olmaması çözüm Döviz güvenilirliğini ispatlıyor. <img alt="Şekil 3,." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> Şekil 3, emme pipet tekniği kullanılarak bir ORN bir öjenol bağlı tepki gösterir. Kayıt üstündeki çubuğu tarafından belirtildiği gibi ORN 1 saniye için 100 mcM eugenol maruz kalmıştır. Şek. Sadece mevcut reseptörüne görüntülemek için 50 Hz Şekil - 3A (siyah iz) reseptör mevcut bant genişliği, 0 süzüldü.. 5000 Hz (kırmızı iz) de aksiyon potansiyelleri (oklarla gösterilen AP), görüntülemek için - 3B şimdi 0 geniş bant aralığında filtre aynı kayıt gösterir. Ilave tepki başlangıcında, daha açık bir şekilde AP görselleştirmek için genişletilmiş bir zaman ölçeği de aynı eser göstermektedir. <img alt="Şekil 4." src = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; Bir öjenol-duyarlı ORN Şekil 4. Doz-tepki aile (A). Eugenol 0.3 uM ila 100 uM arasında değişen konsantrasyonlarda kullanılan, uyaran süresi 1 sn oldu ve izleri 0 süzülmüş edildi - 50 Hz. Odorant konsantrasyonu ilerleyen artışa odorant pozlama sonlandırıldı kez de daha yavaş sona daha büyük ve daha hızlı yanıt yol açtı. ORNs ara odorant konsantrasyonları (Şekil 4B) itibariyle uzun uyarımlar esnasında salınımlı yanıtı desenini görüntüleyebilirsiniz. İşte bir acetephenone (3 uM) duyarlı ORN 8 saniye uyarıldı. Stimülasyon başlangıcında hızlı ve geçici pik cevaptan sonra küçük, yinelenen yanıtları bir dizi izlenir. 50 Hz - Kayıt bant genişliği 0 oldu.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

<p class="jove_content"&gt; Emme pipet teknik aynı zamanda bir ORN gelen koku ile endüklenen yavaş reseptör akım ve bifazik hızlı aksiyon potansiyelleri kaydetmek için kullanılan bir elektrofizyolojik yöntemdir. Hücrenin, plazma membranında bozulmaması için, bu yöntem odorant hücre içi tepkileri faktörlerin sitoplazmik iyon konsantrasyonu ya da seyreltme değişikliklere bağlı olarak değiştirilmiş sağlamak yer bozulmamış hücre içi ortamı terk eder. Hücreleri uzun süreler (fare kurbağa ve 1 saat en fazla 4 saat) i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog / Model numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Hava tablosu </td><td> ekipman </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hava Pompası </td><td> ekipman </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipet Çektirme </td><td> ekipman </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam </td><td> ekipman </td><td> TEFE </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse Ters mikroskop </td><td> ekipman </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Hg lambası, GFP filtresi ve hedefleri 20X ve en az 5X ile donatılmış </td></tr><tr><td> Amplifikatör PC-501A </td><td> ekipman </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> Elmas bıçak </td><td> Ekipman </td><td> Ismarlama </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sayısallaştırıcı Mikro1401 A / D </td><td> ekipman </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtre ünitesi 3382 </td><td> ekipman </td><td> Krohn Hite kurumlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinyal </td><td> yazılım </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ag / AgCl Pelet Molded </td><td> ekipman </td><td> TEFE </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet tutucu </td><td> ekipman </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Özel uyacak şekilde değiştirilmiş headstage </td></tr><tr><td> Kayıt odası </td><td> Ekipman </td><td> Ismarlama </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatör MP85-1028 </td><td> ekipman </td><td> Sutter Instrument </td><td> Mikromanipülatör MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Madeni yağ </td><td> Çözüm </td><td> Sigma </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osiloskop TDS 1001 </td><td> ekipman </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Üç namlulu kare cam tüp </td><td> Ekipman </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 5 cm uzunluğunda 0.6 mm ID, </td></tr><tr><td> Valf </td><td> ekipman </td><td> Lee Şirketi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8.2 </td><td> ekipman </td><td> Bilimsel otomatikleştirin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B Perfüzyon hızlı adım </td><td> ekipman </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

Hayvanlar burun boşluğunda bulunan kimyasal duyusal sistemleri aracılığıyla çevrelerindeki kokulu ortamda tadabilirsiniz. Kimyasal duyusal sinyaller gibi yiyecek seçimi, yırtıcı, conspecific ve eşini tanıma ve diğer sosyal ilgili ipuçları gibi karmaşık davranışları etkiler. Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) olfaktör epitel gömülü nazal kavite dorsal kısmında yer almaktadır. Bunlar bipolar nöronların (bkz. Şek. 1, başlangıçta Genel Fizyoloji Dergisi&#39;nde yayınlanan Reisert &amp; Zhao 1) koku ampul bir akson göndermek ve koku kaplayan mukus içine nereye kirpikler yayar gelen epitelyal sınırına tek bir dendrit uzatmak epitel. Kanal (Şekil 1) - tüyler sonuçta silier transdüksiyonu kanalları, siklik nükleotid-geçiş (CNG) kanal ve bir Ca2 + ile aktive Cl arasından akım akışına neden olmaktadır eksitatör sinyal transdüksiyonu amaçlı içerir. Ensuing depolazasyon hücre gövdesi 2-4 aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler. Bu videoda ORNs gelen odorant bağlı yanıtları kaydetmek için &quot;emme pipet tekniği&quot; kullanımını açıklar. Bu yöntem ilk çubuk fotoreseptör 5 kayıt yapmak geliştirilmiş ve bu yöntem bir varyantı fare koni fotoreseptör 6 kaydetmek için modifiye jove.com bulunabilir. Emme pipet tekniği daha sonra da ORNs 7,8 kayedetmek uyarlanmıştır. Kısaca, koku ve epitel hücre izolasyon ayrışma takiben, ORN, tüm hücre gövdesi bir kayıt pipet ucu içine çekilmektedir. Dendrit ve kirpikler banyo solüsyonu maruz ve örneğin odorant veya farmakolojik engelleyici uygulamayı etkinleştirmek için çözüm değişiklikleri böylece erişilebilir kalır. Bu yapılandırmada, intraselüler çevreye hiçbir erişim elde edilir (hayır tam hücreli gerilim kelepçe) ve hücre içi voltajı değişir serbest kalır. Bu, tümkirpikler ve hücre gövdesi 9 tarafından ateş hızlı aksiyon potansiyelleri de kaynaklanır yavaş reseptör akımı eş zamanlı kayıt OWS. Bu iki sinyal arasında kinetikleri farkı da farklı filtre ayarları kullanılarak ayrılması için olanak sağlar. Bu teknik, her vahşi tip ya da knockout farelerde kullanılabilir veya aynı zamanda ORNs belirli alt etiket GFP ifade ORNs dan seçici olarak kaydetmek için, örneğin, belirli bir odorant reseptör veya iyon kanalı eksprese eden.

Watch this Scientific Journal Video about Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique at JoVE.com

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Görüntüleme.  Monell Chemical Senses Center. Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Video: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Nörobilim

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Güve Koku Sistemi Elektrofizyolojik Ölçümler

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...