وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DC009613، علم الإنسان حدود برنامج والعناية مورلي زمالة (لJR).

1. التسجيلات الإعداد هي التي شنت على الدائرة تسجيل المجهر نيكون الكسوف TE2000U مقلوب مع عدسات النقيض المرحلة التي يتم تركيبها على جدول الهواء ومحمية كهربائيا باستخدام قفص فاراداي. الدائرة تسجيل زجاج شبكي يتكون من قسمين يفصل جزئيا بحاجز ولصقها على شريحة زجاجية silanized. يتم استخدام مقطع واحد للغرفة لتسوية الخلايا بينما يستخدم الآخر لتعرض التحفيز أثناء التسجيل المبكر للتقليل من التعرض للتسوية ولكن كما الخلايا غير المستخدمة حتى الآن لالرائحة. الإعداد تسجيل يتكون من ماصة شفط (أنظر أدناه) التي شنت في حامل ماصة مكعبات وقطب الأرض. يتم وضع ماصة الشفط باستخدام مياداة مجهرية. يتم تطبيق حلول التحفيز باستخدام مربع من الزجاج الثلاثي برميل أنبوب، أنبوب مربع مع بعضها كونها 0.7 مم × 0.7 مم. كان على علاقة الزجاج الثلاثي برميل إلى نظام الآلية نضح سريع الخطوة التي شنت على مناور (سوتدخلت SF-77B ثالثا، الآلات وارنر) وغرفة تسجيل بزاوية 45 ° ~. ومشطوف نهاية الزجاج برميل الثلاثي بزاوية 45 درجة مرة أخرى بحيث الوجه النهائي (فتح) من الزجاج الثلاثي برميل كان العمودي للسماح لتحديد المواقع ختام ماصة. يتم توصيل القطب ماصة شفط مليئة القياسية حل قارع الأجراس في الثدييات والقطب الأرض إلى headstage GΩ 1 من رقعة مكبر للصوت المشبك (PC-501A، وارنر الصكوك) في وضع المشبك الجهد. يتم عرض الإشارات التناظرية من مكبر للصوت (ممر منخفض تمت تصفيتها في 5 كيلو هرتز) على الذبذبات الرقمية لرصد إشارة في الوقت الحقيقي وتوصيلها أيضا إلى عامل تصفية بسل 8-القطب (كروهن، هايت) حيث تكون الإشارة منخفضة تمرير تصفية في 50 هرتز. ويتم تغذية كل من اشارات (ممر منخفض تمت تصفيتها في 5 كيلو هرتز هرتز و50) إلى تحويل A / D (كامبردج الإلكترونية تصميم MKII 1401 مايكرو) التي يتم توصيلها إلى جهاز كمبيوتر للحصول على البيانات. يتم تسجيل البيانات باستخدام البث 3 ACQuisition البرمجيات (كامبردج الإلكترونية التصميم) على تردد أخذ العينات من 10 كيلو هرتز. يتم تسجيل إشارة في عرض الموجات مختلفين لتسجيل أول مستقبلات الحالي جنبا إلى جنب مع إمكانات العمل فرضه ثم مستقبلات الحالية وحدها (انظر الشكل 2). يتم استخدام نظام نضح للتبديل بسرعة بين الحل (التحكم) قارع الأجراس والمحفزات الرائحة أو أي حل للتكوين المطلوب ويتم التحكم بواسطة برنامج 3 PC والإشارات. وترد الحلول في المحاقن 60 مل، ويتم التحكم معدل التدفق من قبل المنظمين الطبية الصف تدفق الوريد. عادة، يتم ضبط معدل تدفق إلى 1 مل / دقيقة. يتم التحكم في السحب على ماصة تسجيل على النحو التالي: يتم توصيل منفذ جانب حامل ماصة إلى خط النفط الذي بدوره يرتبط إلى خزان النفط ارتفاع قابل للتعديل. رفع أو خفض الخزان يضمن أن الضغط ماصة، وبالتالي تدفق قارع الأجراس من خلال غيض من عipette هو الحد الأدنى وإيجابية قليلا. ويمكن تطبيق شفط إضافية أو الضغط من خلال أنبوب متصل المجال الجوي للخزان مع لسان حال في الطرف الآخر لامتصاص خلايا الجسم من ORN معزولة في غيض من ماصة التسجيل. يتم تنفيذ التجارب في 37 ° C من أجل محاكاة عن كثب حالة الأم الفسيولوجية للخلية. يتم التحكم في درجة الحرارة عن طريق تمرير الحلول من خلال وحدة التدفئة حسب الطلب الذي يتكون من السيراميك المقاومات التي من خلالها يتم تمرير أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ تحتوي على حلول 10. ويتم رصد درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة الحرارية (فلوك). 2. حلول قارع الأجراس في الثدييات حل (مم): 140 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 2 CaCl 2، 0،01 EDTA، 10 HEPES، 10 الجلوكوز. تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم. تم استخدام 10٪ المخفف رينغر الحل لقياس تقاطع الحالي. Odoraوأعدت الأسيتوفينون والأوجينول يوميا في حل رينغر من 20 ملي الأسهم DMSO: NT الحلول. 3. صنع أقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضع الزجاج البورسليكات unfilamented الشعرية في مجتذب P-97 سوتر micropipette وسحب micropipette مع تفتق الطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ماصة لحامل micropipette حسب الطلب التي شنت على الكسوف نيكون المجهر E200 الذي هو بدوره مزودة شبكاني في العدسة وسكين الماس المنقولة التي شنت على خشبة المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة غيض من ماصة في إطار الهدف 20X واستخدام شبكاني كدليل؛ الكاتب بلطف ماصة بزاوية 90 درجة باستخدام سكين الماس حسب الطلب حيث ماصة هو 10 ميكرومتر واسعة (القطر الخارجي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل سكين الماس أخرى نحو الحافة وتطبيق الضغط تدريجيا على الطرف السكين مع الماس. يجب غيض ماصة نظيفة كسر عند النقطة التي كان مكتوب عليها. </li></ol> وبدلا من الخطوات من 3.1 إلىويمكن الجمع بين 3.4 و يمكن سحب ماصات ذات أبعاد المطلوب مباشرة دون الحاجة إلى قطع غيض ماصة، على الرغم من أنها يمكن أن تكون أكثر صعوبة لسحب ماصات موثوق مع مثل هذا القطر تلميح كبير وحواف قطع نظيفة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الهدف 40X، النار تلميع غيض من ماصة إلى القطر الداخلي من 5 ميكرون باستخدام خيوط ساخنة كهربائيا. الانتهاء مرة واحدة، micropipette على استعداد لاستخدامها في التيارات التسجيل من ORNs الماوس. ينبغي أن تكون مفتوحة المقاومة ماصة حوالي 1 MΩ عندما مليئة قارع الأجراس. </li></ol> 4. عزل الخلايا مستقبلات الشم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية ماوس اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية والأنظمة. إزالة الرأس، بعيدا قشر الجلد المغطي الجمجمة والرأس بشكل إعلامي شطر على طول خط الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين من رؤساء نصفي تحت stereomicroscope تشريح، وسحب قبالة الحاجز الأنفي وإزالة القرائن حاسة الشم. إخضاع جميع الأنسجة في طبق بتري مع الجلوكوز جontaining الثدييات حل قارع الأجراس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر ظهارة شمية قبالة الغضروف الأساسية من اثنين القرائن ونقل الأنسجة في أنبوب إيبندورف تحتوي على 250 ميكرولتر قارع الأجراس. نستخدم الأنسجة من 2 القرائن للحصول على كثافة خلايا حق لحجم غرفة تسجيل لدينا. تخزين الأنسجة المتبقية في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب إيبندورف يحتوي على ظهارة شمية لفترة وجيزة مرتين ل1 ثانية على سرعة متوسطة. هذه الخطوة تؤدي إلى التفكك الميكانيكية للORNs من ظهارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حل قارع الأجراس التي تحتوي على ORNs فصل في قاعة التسجيل. إزالة قطعة كبيرة من الأنسجة موجودة أيضا في التعليق باستخدام ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للORNs تسوية لمدة 20 دقيقة قبل البدء superfusion المستمر مع قارع الأجراس، والشروع في التسجيلات. </li></ol> 5. التسجيلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض القطب الشفط المتصلة بخط النفط إلى غرفة تسجيل وREGULيأكل من ذروة النفط لإنشاء خزان الضغط الإيجابي قليلا في الطرف ماصة. ويمكن أن يتم هذا من خلال مراقبة مثل الحطام الخلية الابتعاد عن (الضغط الإيجابي) أو نحو (الضغط السلبي) ماصة. ليس محاولة لتلويث غيض من ماصة مع الحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح غرفة تسجيل لORN المعزولة التي يمكن التعرف عليه بواسطة التشكل في القطبين نموذجية باستخدام التكبير 40X من-20. الانتقال إلى القطب تسجيل مقربة من جسم الخلية ORN. بدء مص بلطف بحيث يدخل في جسم الخلية غيض من ماصة. بعناية وببطء مواصلة تطبيق شفط حتى يتم رسم جسم الخلية بأكملها إلى غيض من ماصة شفط، وترك التغصنات وأهداب تتعرض لحمام الحل. عن صور وأشكال ORNs امتص ماصة انظر 7،11. ضمان أنه بمجرد أن يتم تطبيق أي شفط، وORN لا يتحرك داخل أو خارج ماصة. إذا كان الأمر كذلك، ضبط ارتفاع الخزان النفط وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدامmicromanipulators، نقل ماصة شفط من قسم يحتوي على ORNs استقر إلى قسم التسجيل للغرفة. ضع ماصة بعناية شفط أمام الأنبوب 3-الماسورة لتبادل الحل. يجب وضع ماصة قريبة بما فيه الكفاية لشفط افتتاح أنبوب 3-الماسورة بحيث يتعرض ORN إلى تدفق الصفحي وبالتالي تجنب الاضطرابات خلط وتبادل سريع لتحقيق الحل. ويتحقق الحل عن طريق تبادل يخطو التفاعل بين تيارات موازية من حل تتدفق عبر غيض من ماصة الشفط. أثناء وقت تبادل الحل هو عادة حوالي 20 مللي، وتقاس من تقاطع الحالية التي حركها خطوة الخلية بين الحلول المختلفة لتكوين الأيونية (انظر الشكل 2). يتم تسليم الحلول عن طريق الجاذبية. </li></ol> &lt;فترة الطبقة = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. ممثل النتائج <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> الشكل 1. A مستقبلات القطبين) الخلايا العصبية في البصلة الشمية. B) إشارة آلات تنبيغ في أهداب يؤدي في النهاية إلى إثاري تدفق الحالية. وإزالة الاستقطاب التي تلت ذلك يؤدي جيل عمل محتمل في خلايا الجسم. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> ويبين الشكل 2 السرعة والموثوقية الصرف حل. وصعدت ماصة من العادي إلى قارع الأجراس المخفف 10٪ لمدة 100 مللي ثانية وسجلت الحالية تقاطع الناجمة عن تركيز أيون متباينة. الأسود هو تتبع افيالغضب من 5 تجارب، الأحمر تتبع لها SD. التغيير قليلا في SD خلال تبادل حل يوضح موثوقية الصرف حل من المحاكمة للمحاكمة وعدم وجود ضوضاء الزائدة في مجرى الحل أيضا. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> ويبين الشكل 3 استجابة الأوجينول التي يسببها من ORN باستخدام تقنية شفط ماصة. تعرضت لالأوجينول ميكرومتر ORN 100 ل1 ثانية كما هو مبين أعلاه بواسطة شريط التسجيل. في الشكل. 3A (أسود التتبع) وتصفية الحالية مستقبلات في عرض النطاق الترددي 0 حتي 50 هرتز لعرض فقط مستقبلات الحالي الشكل. 3B يظهر تسجيل نفسه وتصفيتها الآن في عرض النطاق الترددي واسعة من 0 حتي 5000 هرتز (الأحمر التتبع) لعرض إمكانات العمل أيضا (الجزائرية، المشار إليها بواسطة الأسهم). وأقحم يظهر التتبع الزمني لنفسه في توسيع نقاط وصول لتصور أكثر وضوحا في بداية الاستجابة. <img alt="الشكل 4." srج = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; الشكل 4. الأسرة الاستجابة للجرعة من ORN الأوجينول التي تستجيب لل(A). وكان مدة التحفيز كان يستخدم بتركيزات تتراوح الأوجينول من 0.3 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر، و1 ق تم تصفيتها آثار في 0 - 50 هرتز. أدت الزيادة التدريجية في تركيز الرائحة إلى استجابة أكبر وأسرع، والتي انتهت أيضا أكثر ببطء مرة تم إنهاء التعرض الرائحة. يمكن ORNs عرض نمط الاستجابة متذبذبة خلال التحفيز طويلة بتركيزات متوسطة الرائحة (الشكل 4B). هنا كان لحفز acetephenone (3 ميكرومتر) ORN تستجيب لمدة 8 ثوان. بعد استجابة سريعة وذروة عابرة في بداية التحفيز ويلاحظ سلسلة من ردود أصغر، المتكررة. وكان عرض النطاق الترددي تسجيل 0 حتي 50 هرتز.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

<p class="jove_content"&gt; تقنية شفط ماصة هو وسيلة الكهربية التي تستخدم لتسجيل رائحة الحالية الناجمة عن مستقبلات بطيئة وسريعة إمكانات العمل ثنائي الطور من ORN في وقت واحد. لأنه لا غشاء البلازما من اختراق الخلية، وهذه الطريقة يترك الوسط بين الخلايا دون عائق ضمان عدم تغيير الردود الرائحة نتيجة للتغيرات في تركيزات أ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> كتالوج / موديل </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الجدول الهواء </td><td> معدات </td><td> نيوبورت </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مضخة الهواء </td><td> معدات </td><td> نيوبورت </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> ماصة بولير </td><td> معدات </td><td> سوتر </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج </td><td> معدات </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> نيكون الكسوف مجهر مقلوب </td><td> معدات </td><td> نيكون </td><td> TE2000U </td><td> مصباح الزئبق مجهزة، فلتر GFP والأهداف 20X 5X وعلى الأقل </td></tr><tr><td> مكبر للصوت PC-501A </td><td> معدات </td><td> وارنر </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> الماس سكين </td><td> معدات </td><td> تفصيل </td><td></td><td></td></tr><tr><td> التحويل الرقمي Mikro1401 A / D </td><td> معدات </td><td> كامبريدج الالكترونية التصميم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تصفية وحدة 3382 </td><td> معدات </td><td> كروهن هايت شركة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> إشارة </td><td> البرمجيات </td><td> كامبريدج الالكترونية التصميم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مصبوب جي / أجكل بيليه </td><td> معدات </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> ماصة حامل </td><td> معدات </td><td> وارنر </td><td> 64-0997 </td><td> العرف تعديل لتناسب headstage </td></tr><tr><td> تسجيل غرفة </td><td> معدات </td><td> تفصيل </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مياداة مجهرية MP85-1028 </td><td> معدات </td><td> سوتر الصك </td><td> مياداة مجهرية MP85-1028 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> الزيوت المعدنية </td><td> حل </td><td> سيجما </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> TDS الذبذبات 1001 </td><td> معدات </td><td> تكترونكس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ثلاثة الماسورة أنبوب زجاجي مربع </td><td> معدات </td><td> وارنر </td><td> 64-0119 </td><td> 0،6 ID مم، بطول 5 سم </td></tr><tr><td> صمام </td><td> معدات </td><td> ولي شركة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8،2 </td><td> معدات </td><td> أتمتة العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B خطوة سريعة الإرواء </td><td> معدات </td><td> وارنر </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

الحيوانات أخذ عينات من البيئة المحيطة بهم معطر من خلال أنظمة حسي كيميائي يقع في تجويف الأنف. إشارات حسي كيميائي يؤثر على السلوكيات المعقدة مثل اختيار الطعام، المفترس، والاعتراف مناوع زميله وغيرها من الاشارات ذات الصلة اجتماعيا. تقع الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) في الجزء الظهري للتجويف الأنف جزءا لا يتجزأ من ظهارة شمية. هذه الخلايا العصبية ترسل القطبين محور عصبي إلى البصلة الشمية (انظر الشكل 1، وReisert تشاو 1، نشرت في الأصل في مجلة علم وظائف الأعضاء العام) وتوسيع التغصنات واحد من الحدود الظهارية من حيث تشع أهداب في المخاط الذي يغطي حاسة الشم ظهارة. أهداب تحتوي على آلات نقل الإشارة أن يؤدي في النهاية إلى تدفق إثاري الحالي من خلال القنوات الهدبية تنبيغ، ودوري النوكليوتيدات بوابات قناة (CNG) والكالسيوم (أ) 2 + تنشيط الكلور - قناة (الشكل 1). وتلت ذلك depolarization مشغلات الجيل عمل محتمل في جسم الخلية 2-4. في هذا الفيديو وصفنا استخدام &quot;تقنية شفط ماصة&quot; لتسجيل الرائحة الناجمة عن ردود ORNs. وضعت أصلا هذه الطريقة لتسجيل من المستقبلات الضوئية قضيب 5 و يمكن العثور على البديل من هذا الأسلوب في jove.com تعديل لتسجيل من مبصرات مخروط الماوس 6. وقد تم تكييف هذه التقنية في وقت لاحق لتسجيل ماصة شفط أيضا من ORNs 7،8. لفترة وجيزة، وبعد تفكك الظهارة الشمية والعزلة الخلية، وامتص الجسم الخلية بأكملها من ORN في غيض من ماصة التسجيل. والتغصنات وأهداب وتظل عرضة لحل حمام وبالتالي يمكن الوصول إليها للتغيرات حل لتمكين الرائحة على سبيل المثال أو تطبيق مانع الدوائية. في هذا التكوين، لا المكتسبة الوصول إلى البيئة داخل الخلايا (أي المشبك الجهد خلية كاملة) والجهد داخل الخلايا لا تزال خالية إلى تختلف. كل هذاOWS في وقت واحد تسجيل من مستقبلات الحالي بطيء الذي ينشأ في أهداب وإمكانات العمل بسرعة أطلقها جسم الخلية 9. الفرق بين حركية في هذه إشارات اثنين يسمح لهم باستخدام فصل إعدادات التصفية مختلفة. ويمكن استخدام هذه التقنية على أي نوع البرية أو الماوس أو لتسجيل خروج المغلوب من انتقائي ORNs التي تعبر عن GFP أيضا لتسمية مجموعات فرعية محددة من ORNs، على سبيل المثال التعبير عن مستقبلات الرائحة معين أو قناة أيون.

Watch this Scientific Journal Video about Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique at JoVE.com

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) تحويل الإشارات الأولى إلى رائحة مستقبلات الحالية التي بدورها يطلق إمكانات العمل التي يتم نقلها إلى الخلايا العصبية من الدرجة الثانية في البصلة الشمية. نحن هنا وصف الأسلوب ماصة شفط لتسجيل وقت واحد مستقبلات الرائحة التي يسببها الحالية وإمكانات العمل من ORNs الماوس.

الرائحة التي يسببها الردود المسجلة من الخلايا العصبية مستقبلات الشم باستخدام تقنية شفط الماصة

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Monell Chemical Senses Center. الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) تحويل الإشارات الأولى إلى رائحة مستقبلات الحالية التي بدورها يطلق إمكانات العمل التي يتم نقلها إلى الخلايا العصبية من الدرجة الثانية في البصلة الشمية. نحن هنا وصف الأسلوب ماصة شفط لتسجيل وقت واحد مستقبلات الرائحة التي يسببها ?...

Video: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

تطبيق المواصلة NMDA مستقبلات الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الجرذ الدوبامينية باستخدام تقنية المشبك الحيوي

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

باستخدام Sensillum واحدة تسجيل لكشف الردود الشم العصبية من بق الفراش لSemiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...