Este trabajo fue apoyado por el NIH DC009613, el Programa de Fronteras Humanas Ciencias y Morley Care Fellowship (JR).

1. La configuración de grabación La cámara de registro está montado en un microscopio Nikon Eclipse TE2000U invertida con óptica de contraste de fase que está montado sobre una mesa neumática y eléctricamente blindado usando una jaula de Faraday. La cámara de grabación de Plexiglás consta de dos secciones separadas parcialmente por una barrera y pegado sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Una sección de la cámara se utiliza para liquidar las células, mientras que el otro se utiliza para el estímulo de la exposición durante la grabación para reducir al mínimo la exposición prematura de reiterada pero aún no utilizados a células odorante. La configuración de grabación consta de una pipeta de aspiración (ver más abajo) montado en un soporte de pipetas sedimentaron y un electrodo de tierra. La pipeta de succión se coloca utilizando un micromanipulador. Soluciones de estímulo se aplican usando un tubo de vidrio de triple cañón cuadrado, con cada tubo cuadrado siendo 0,7 mm x 0,7 mm. El cristal de triple cañón estaba conectado a un sistema de perfusión motorizado rápido a paso montado en un manipulador (Sutter SF-77B, Instrumentos Warner) y entró en la cámara de registro a un ángulo de ~ 45 °. El final de la copa barril triple fue biselado a un ángulo de 45 ° de nuevo tal que la cara final (abertura) del cristal de triple barril era vertical para permitir la colocación cerca de la pipeta. El electrodo de pipeta de succión llena con solución de Ringer de mamíferos estándar y el electrodo de tierra están conectados a la headstage GΩ 1 de un amplificador de patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) en el modo de fijación de voltaje. La señal analógica procedente del amplificador (filtrada paso bajo a 5 kHz) se visualiza en un osciloscopio digital para monitorizar la señal en tiempo real y también conectado a un filtro de Bessel 8-polo (Krohn-Hite) donde la señal es filtrada en paso bajo a 50 Hz. Ambas señales (filtrado de paso bajo a 5 kHz Hz 50) se introducen en un convertidor A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401) que está conectado a un PC para la adquisición de datos. Los datos se registran utilizando Signal 3 acquisition software (Cambridge Electronic Design) a una frecuencia de muestreo de 10 kHz. La señal se registra en las dos diferentes anchos de banda para grabar primero el receptor actual junto con los potenciales de acción superpuestas y, a continuación el receptor actual solo (véase la fig. 2). El sistema de perfusión se usa para cambiar rápidamente entre Ringer (control) y solución estímulos odorantes o cualquier solución de composición deseada y es controlado por el PC y la señal 3 software. Las soluciones están contenidos en 60 ml jeringas y la tasa de flujo es controlado por grado médico reguladores de flujo por vía intravenosa. Típicamente, el caudal se fija a 1 ml / min. La succión en la pipeta de grabación se controla de la siguiente manera: El puerto lateral del soporte de pipeta está conectado a una línea de aceite que a su vez está conectado a un depósito de aceite regulable en altura. Elevando o bajando el depósito asegura que la presión de pipeta y por lo tanto el flujo de Ringer a través de la punta de la pipette es mínimo y ligeramente positivo. De succión adicional o se puede aplicar presión a través de un tubo conectado al espacio aéreo del depósito con una boquilla en el otro extremo a chupar el cuerpo celular de una ORN aislado en la punta de la pipeta de grabación. Los experimentos se realizaron a 37 ° C con el fin de simular con frecuencia el estado nativo fisiológico de la célula. La temperatura se controla haciendo pasar las soluciones a través de una unidad de calentamiento a medida que consta de resistores de cerámica a través de tubos de acero inoxidable que contienen las soluciones se pasan 10. La temperatura se controla usando un termómetro de termopar (Fluke). 2. Soluciones La solución de Ringer de mamíferos (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glucosa. El pH se ajustó a 7,5 con NaOH. Un 10% diluida de solución de Ringer se utilizó para medir la unión actual. Odorasoluciones nt: acetofenona y eugenol se prepararon diariamente en solución de Ringer de 20 mM de existencias de DMSO. 3. Haciendo Electrodos <ol><li> Coloque un vidrio borosilicato unfilamented capilar en un Sutter P-97 extractor de micropipeta y tirar de una micropipeta con un cono largo. </li><li> Transferir la pipeta en un soporte micropipeta a medida montada en un microscopio Nikon Eclipse E200, que es a su vez equipado con una retícula en el ocular y una cuchilla móvil diamante montado en el escenario. </li><li> Observe que la punta de la pipeta al objetivo de 20x y utilizando la retícula como guía; suavemente escriba la pipeta en un ángulo de 90 ° con la cuchilla de diamante a medida que la pipeta es de 10 micras de ancho (diámetro externo). </li><li> Mueva la cuchilla de diamante más hacia la punta y gradualmente aplique presión en la punta de la cuchilla de diamante. La punta de la pipeta debe romper limpiamente en el punto en que se describe. </li></ol> Alternativamente los pasos 3.1 a3,4 se pueden combinar y pipetas se puede tirar con dimensiones deseadas directamente sin tener que cortar la punta de la pipeta, aunque puede resultar más difícil tirar de forma fiable pipetas con una punta de diámetro grande y los bordes de corte limpio. <ol start="5"><li> Bajo un objetivo de 40x, disparar pulir la punta de la pipeta a un diámetro interior de 5 micras utilizando un filamento calentado eléctricamente. Una vez terminado, la micropipeta está listo para ser utilizado para corrientes de grabación desde ORNs ratón. La resistencia abierta pipeta debe estar alrededor de 1 MW cuando se llena de colores. </li></ol> 4. El aislamiento de las neuronas olfativas del receptor <ol><li> Sacrificar un ratón siguiendo las directrices institucionales y normativas. Retire la cabeza, retire la piel que recubre el cráneo y la cabeza medial bisecan a lo largo de la línea media. </li><li> Coloque los dos hemi-cabezas bajo un estereomicroscopio de disección, quitar el tabique nasal y eliminar los cornetes olfativos. Colocar todo el tejido en una placa de Petri con c glucosaontaining solución Ringer mamíferos. </li><li> Pelar el epitelio olfativo del cartílago subyacente a partir de dos cornetes y transferir el tejido en un tubo Eppendorf que contiene 250 l de Ringer. Utilizamos tejidos de 2 cornetes para conseguir la densidad adecuada de las células para el tamaño de nuestra cámara de grabación. Almacenar el tejido restante a 4 º C para su uso posterior. </li><li> Vortex el tubo Eppendorf que contiene el epitelio olfativo brevemente dos veces durante 1 seg a velocidad media. Esta etapa conduce a la disociación mecánica de los ORNs del epitelio. </li><li> Colocar la solución de Ringer que contenía los ORNs disociadas en la cámara de registro. Eliminar piezas grandes de tejido también presentes en la suspensión utilizando unas pinzas finas. </li><li> Deje que los ORNs conformarse con 20 minutos antes de comenzar superfusión continuo con Ringer y proceder a las grabaciones. </li></ol> 5. Grabaciones <ol><li> Bajar el electrodo de succión conectado a la línea de aceite en la cámara de registro y regulcomió la altura del depósito de aceite para establecer presión ligeramente positiva en la punta de la pipeta. Esto se puede hacer mediante la observación de los restos celulares por ejemplo, alejándose de (presión positiva) o hacia (presión negativa) de la pipeta. Trate de no contaminar la punta de la pipeta con restos celulares. </li><li> Escanear la cámara de registro para una ORN aislado que puede ser reconocido por su morfología bipolar típica usando una magnificación de 20-40x. Mueva el electrodo de registro en la proximidad del cuerpo celular ORN. Empiezan a chupar suavemente de modo que el cuerpo de la célula entra en la punta de la pipeta. Cuidadosa y lentamente continuar para aplicar succión hasta que el cuerpo de la célula entera se introduce en la punta de la pipeta de aspiración, dejando la dendrita y los cilios expuesto a la solución del baño. Para imágenes de ORNs aspirado y formas de pipeta ver 7,11. Asegúrese de que una vez que no se aplica la succión, la ORN no se mueve dentro o fuera de la pipeta. Si es así, ajustar la altura del depósito de aceite en consecuencia. </li><li> Uso de lamicromanipuladores, mover la pipeta de aspiración de la sección que contiene las ORNs asentadas a la sección de grabación de la cámara. Colocar con cuidado la pipeta de aspiración en la parte delantera de tubo 3-cañón para el intercambio de solución. La pipeta de succión debe estar colocado lo suficientemente cerca de la abertura del tubo 3-cañón de manera que el ORN se expone a un flujo laminar evitando así la turbulencia de mezcla y para lograr el intercambio de solución rápida. La solución de intercambio se consigue mediante la intensificación de la interfaz entre corrientes paralelas de solución que fluye a través de la punta de la pipeta de aspiración. El curso temporal de la bolsa de solución es típicamente alrededor de 20 ms, medida a partir de la corriente evocada por unión intensificando la celda entre las soluciones de composición iónica diferente (véase la fig. 2). Soluciones se suministran por gravedad. </li></ol> &lt;clase span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. Los resultados representativos <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> Figura 1. A) neuronas bipolares del receptor en el bulbo olfatorio. B) transducción de señales en los cilios en última instancia conduce a la excitatorios afluencia actual. La despolarización resultante desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> La Figura 2 muestra la velocidad y la fiabilidad de cambio de solución. Una pipeta se salió de lo normal en 10% Ringer diluida para 100 ms y la corriente resultante de la unión de la concentración de iones de diferente fue registrada. Negro traza es el averabia de 5 intentos, rojo rastrear su SD. El pequeño cambio en SD durante el intercambio solución demuestra la fiabilidad de intercambio solución de ensayo a ensayo y la falta de exceso de ruido en la corriente de solución. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> La Figura 3 muestra una respuesta eugenol inducida de un ORN utilizando la técnica de pipeta de succión. La ORN fue expuesto a 100 mM eugenol durante 1 segundo como se indica por la barra por encima de la grabación. En la fig. 3A (negro rastro) la corriente del receptor se filtró en un ancho de banda 0 - 50 Hz para mostrar sólo el receptor de la figura actual.. 3B muestra la misma grabación, ahora filtra en el ancho de banda amplio de 0 - 5000 Hz (curva roja) para visualizar también los potenciales de acción (AP, indicado por flechas). El recuadro muestra la misma traza en una escala de tiempo ampliado para visualizar los puntos de acceso más claramente en la aparición de la respuesta. <img alt="Figura 4." src = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; Dosis Figura 4. Respuesta de la familia de un ORN-eugenol sensible (A). El eugenol se utilizó a concentraciones que variaban de 0,3 mM a 100 mM, la duración del estímulo fue de 1 s y trazas se filtró a 0 - 50 Hz. Un incremento progresivo en la concentración de odorante condujo a una respuesta más grande y más rápido, que también se termina una vez más lentamente exposición odorante se terminó. ORNs puede mostrar un patrón de respuesta oscilatoria durante estimulaciones largas en concentraciones odorantes intermedios (Fig. 4B). Aquí un acetephenone (3 M) ORN sensible fue estimulado durante 8 segundos. Después de un pico de respuesta rápida y transitoria en el inicio de la estimulación de una serie de pequeñas respuestas recurrentes se observan. El ancho de banda de grabación fue de 0 - 50 Hz.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<p class="jove_content"&gt; La técnica de pipeta de succión es un método electrofisiológico que se utiliza para registrar la corriente inducida por el receptor de olor lento y los potenciales de acción rápida bifásicos de un ORN simultáneamente. Puesto que la membrana plasmática de la célula no se rompe, este método deja el medio intracelular no perturbado asegurar que las respuestas de olor no se alteren debido a los cambios de las concentraciones iónicas citoplasmáticas o dilución de factores intracelulares. Las células se pued...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Air tabla </td><td> equipo </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bomba de aire </td><td> equipo </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear Puller </td><td> equipo </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato </td><td> equipo </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse microscopio invertido </td><td> equipo </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Equipada con lámpara de Hg, filtro de GFP y objetivos de 20X y 5X al menos </td></tr><tr><td> Amplificador de PC-501A </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> Diamond cuchillo </td><td> Equipo </td><td> Por encargo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitalizador Mikro1401 A / D </td><td> equipo </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtrar unidad 3382 </td><td> equipo </td><td> Krohn Hite corporación </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Señal </td><td> software </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldeado de Ag / AgCl Pellet </td><td> equipo </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear titular </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Custom modificado para ajustarse headstage </td></tr><tr><td> Grabación de cámara </td><td> Equipo </td><td> Por encargo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador MP85-1028 </td><td> equipo </td><td> Sutter Instrument </td><td> Micromanipulador MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Solución </td><td> Sigma </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osciloscopio TDS 1001 </td><td> equipo </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tres de cañón tubo de vidrio cuadrado </td><td> Equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm ID, 5 cm de largo </td></tr><tr><td> Válvula </td><td> equipo </td><td> La Compañía Lee </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> equipo </td><td> Automatizar Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B perfusión rápido paso </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

Animales muestras del medio ambiente oloroso alrededor a través de los sistemas quimiosensoriales situados en la cavidad nasal. Señales Quimiosensoriales afectar los comportamientos complejos, como la elección de alimentos, depredador, conespecíficos y reconocimiento mate y otras señales de relevancia social. Neuronas olfativas del receptor (ORNs) se encuentra en la parte dorsal de la cavidad nasal incrustado en el epitelio olfativo. Estas neuronas bipolares enviar un axón hasta el bulbo olfatorio (ver fig. 1, Reisert y Zhao 1, originalmente publicado en la revista Journal of General Physiology) y extender una sola dendrita epitelial de la frontera desde donde irradian los cilios en el moco que recubre el olfato epitelio. Los cilios contienen la maquinaria de transducción de señales que en última instancia conduce a excitatorios afluencia corriente a través de los canales de transducción ciliar, un nucleótido cíclico-gated canal (CNG) y un Ca 2 +-activado Cl - canal (Fig. 1). El siguiente depolarización desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula 2-4. En este video se describe el uso de la &quot;técnica de succión pipeta&quot; para grabar olor inducida por las respuestas de ORNs. Este método fue desarrollado originalmente para grabar desde fotorreceptores de los bastones 5 y una variante de este método se puede encontrar en jove.com modificado para grabar desde fotorreceptores de los conos de ratón 6. La técnica de la pipeta de aspiración fue adaptado más adelante para grabar también de ORNs 7,8. Brevemente, tras la disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de células, el cuerpo de la célula entera de una ORN es aspirado en la punta de una pipeta de grabación. La dendrita y los cilios del permanecer expuesto a la solución del baño y por lo tanto accesibles a la solución cambia para permitir por ejemplo odorante o aplicación bloqueador farmacológico. En esta configuración, no hay acceso al medio intracelular se gana (sin fijación de voltaje de células enteras) y la tensión intracelular es libre de variar. Todo estoDebe A la grabación simultánea de la corriente del receptor lento que se origina en los cilios y los potenciales de acción rápida disparados por el cuerpo celular 9. La diferencia en la cinética entre estas dos señales que les permite ser separados utilizando diferentes configuraciones de filtro. Esta técnica se puede utilizar en cualquier tipo salvaje o el ratón knockout o de grabación selectiva de ORNs que también expresan GFP para etiquetar subconjuntos específicos de ORNs, por ejemplo, que expresa un receptor determinado olor o canal de iones.

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K vistas.  Monell Chemical Senses Center. Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Video: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

En Vivo Microscopía bicolor tridimensional para estudiar las respuestas vasculares realizadas por la eyección ATP local utilizando una micro-pipette de vidrio

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...