Diese Arbeit wurde vom NIH DC009613, dem Human Frontier Science Program und Morley Pflege Fellowship (JR) unterstützt.

Ein. Die Recording Setup Aufzeichnungsverfahren Kammer auf einem Nikon Eclipse-TE2000U Inversmikroskop mit Phasenkontrast Optik, die auf einer Luft Tisch ausgestattet ist und elektrisch abgeschirmten Verwendung einer Faraday-Käfig angebracht. Die Plexiglas Aufnahme Kammer besteht aus zwei Abschnitten teilweise durch eine Barriere getrennt und klebte auf einem silanisierten Glasobjektträger. Ein Abschnitt der Kammer verwendet wird, um die Zellen absetzen, während der andere für Stimulus-Exposition während der Aufzeichnung verwendet werden, um ein vorzeitiges ständiger Belichtung, aber noch nicht verwendeten Zellen Odorans zu minimieren. Die Aufnahme-Setup besteht aus einer Saugpipette (siehe unten) in einem pelletierten Pipettenhalter und einer Masseelektrode montiert. Die Saugpipette positioniert ist mit einem Mikromanipulator. Stimulus-Lösungen werden unter Verwendung einer Triple-Barrel Glas Vierkantrohr, mit jedem Vierkantrohr von 0,7 mm x 0,7 mm. Die Triple-Barrel Glas wurde mit einer motorisierten schnell Schritt Perfusionssystem auf einem Manipulator montiert (Sut verbundenter SF-77B, Warner Instruments) und in die Aufnahmekammer unter einem Winkel von ca. 45 °. Das Ende des Zylinders Dreifach Glas wurde in einem Winkel von 45 ° wieder derart, dass die endgültige Fläche (Öffnung) des dreifach Barrel Glas vertikal zu enge Positionierung der Pipette war ermöglichen abgeschrägt. Die Saugpipette Elektrode mit Standard Säuger Ringerlösung und der Masseelektrode gefüllt werden dem 1 G Headstage eines Patch-Clamp Verstärkers (PC-501A, Warner Instruments) in Spannungsklammer Modus verbunden ist. Das analoge Signal von dem Verstärker (Tiefpass bei 5 kHz gefiltert) auf einem digitalen Oszilloskop dargestellt, um das Signal in Echtzeit zu überwachen und auch auf einen 8-Pol-Bessel-Filter (Krohn-Hite), wo das Signal tiefpassgefiltert verbunden bei 50 Hz liegt. Beide Signale (Tiefpass bei 5 kHz und 50 Hz gefiltert) werden in einem A / D-Wandler (Cambridge 1401 Electronic Design Micro mkII), die an einen PC zur Datenerfassung verbunden eingespeist. Die Daten werden aufgezeichnet mit Signal 3 acquisition Software (Cambridge Electronic Design) bei einer Abtastfrequenz von 10 kHz. Das Signal wird an den beiden unterschiedlichen Bandbreiten aufzuzeichnenden ersten Aufzeichnung der Rezeptor zusammen mit den aktuellen überlagert Aktionspotentialen und dann den Rezeptor aktuellen allein (s. Abb.. 2). Die Perfusion wird verwendet, um schnell zwischen Ringer (Steuer)-Lösung und Riechstoff Reize oder einer Lösung der gewünschten Zusammensetzung und wird von der PC-und Signal 3 Software gesteuert. Die Lösungen werden in 60 ml Spritzen enthielten und der Durchfluss wird durch medizinischem intravenöse Fließreguliermitteln gesteuert. Typischerweise wird die Flussrate 1 ml / min eingestellt. Der Sog auf dem Aufzeichnungsmaterial Pipette wird in der folgenden Weise gesteuert wird: Die Seitenöffnung der Pipettenhalter an eine Ölleitung, die wiederum mit einer höhenverstellbaren Ölreservoir verbunden ist. Anheben oder Absenken des Behälters stellt sicher, dass die Pipette Druck und damit Ringer Strömung durch die Spitze des pipette ist minimal und leicht positiv. Zusätzliche Saug-oder Druck kann durch ein Rohr verbunden ist, um den Luftraum des Behälters mit einem Mundstück an dem anderen Ende an den Zellkörper eines isolierten ORN in die Spitze der Pipette zu saugen Aufzeichnung angewandt werden. Die Versuche werden bei 37 ° C, um genau simuliert die native physiologischen Zustand der Zelle. Die Temperatur wird durch Leiten der Lösung durch eine maßgeschneiderte Heizeinheit, die aus Keramik, durch den Widerständen Edelstahlrohre mit den Lösungen 10 geführt sind, besteht gesteuert. Die Temperatur wird mit Hilfe eines Thermoelement-Thermometer (Fluke). 2. Lösungen Säuger-Ringer-Lösung (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 Glucose. Der pH wurde mit NaOH auf 7,5 eingestellt. Eine 10% ige verdünnte Ringerlösung wurde zur Messung der Verbindungspunkt Strom. Odorant-Lösungen: Acetophenon und Eugenol wurden täglich in Ringer-Lösung von 20 mM DMSO Aktien vorbereitet. 3. Herstellung Elektroden <ol><li> Legen Sie eine unfilamented Borosilikatglas Kapillare in einer Sutter P-97 Feinpipettenziehvorrichtung und ziehen eine Mikropipette mit einer langen Kegel. </li><li> Übertragen der Pipette ein maßgeschneidertes Mikropipette Halter auf einem Nikon Eclipse-E200 Mikroskop, das wiederum mit einem Retikel im Okular und einem beweglichen Diamantmesser auf der Bühne montiert ist eingepasst befestigt. </li><li> Beachten Sie die Spitze der Pipette unter dem 20x-Objektiv und mit dem Fadenkreuz als Orientierungshilfe; sanft Schreiber die Pipette in einem 90 Grad-Winkel mit den maßgeschneiderten Diamantmesser, wo die Pipette ist 10 um breit (Außendurchmesser). </li><li> Bewegen Sie die Diamantmesser weiter in Richtung der Spitze und allmählich Druck auf die Spitze mit dem Diamant-Messer. Die Pipettenspitze sollte sauber brechen an der Stelle, wo es beschrieben. </li></ol> Alternativ Schritte 3,1 bis3,4 kombiniert werden können und Pipetten können mit den gewünschten Abmessungen direkt, ohne die Pipettenspitze geschnitten gezogen werden, obwohl es nachweisen kann, härteren zuverlässig Pipetten mit einer so großen Durchmesser der Spitze und saubere Schnittkanten zu ziehen. <ol start="5"><li> Unter einem 40x-Objektiv, feuern polieren die Spitze der Pipette zu einer inneren Durchmesser von 5 um unter Verwendung eines elektrisch beheizten Filament. Sobald Sie fertig sind, ist die Mikropipette bereit für die Aufnahme Ströme von Maus ORN verwendet werden. Die offene Pipette Widerstand sollte etwa 1 MOhm sein, wenn mit Ringerlösung gefüllt. </li></ol> 4. Isolation der olfaktorischen Rezeptor-Neuronen <ol><li> Opfere eine Maus nach institutionellen Richtlinien und Vorschriften. Entfernen Sie den Kopf, Schale weg die Haut über den Schädel und medial halbieren den Kopf entlang der Mittellinie. </li><li> Legen Sie die zwei hemi-Köpfe unter einem Seziertisch Stereomikroskop, ziehen Sie die Nasenscheidewand und entfernen Sie die olfaktorischen Nasenmuscheln. Zeigen alle Gewebe in einer Petrischale mit Glukose containing Säugetieren Ringer-Lösung. </li><li> Peel olfaktorischen Epithel dem darunterliegenden Knorpel aus zwei Nasenmuscheln und übertragen das Gewebe in ein Eppendorf-Röhrchen mit 250 ul Ringer. Wir verwenden Gewebes von 2 Nasenmuschel um die gewünschte Dichte der Zellen für die Größe der Aufnahme Kammer zu erhalten. Speicherung des verbleibenden Gewebes bei 4 ° C für die spätere Verwendung. </li><li> Vortex der Eppendorf-Röhrchen mit dem olfaktorischen Epithel zweimal kurz für 1 Sek. bei mittlerer Geschwindigkeit. Dieser Schritt führt zu mechanischen Dissoziation der ORN vom Epithel. </li><li> Legen Sie die Ringer Lösung, welche die dissoziierten ORN in der Aufnahme Kammer. Entfernen große Gewebestücke auch in der Suspension mit feinen Pinzetten. </li><li> Lassen Sie die ORN für 20 Minuten absetzen, bevor kontinuierliche Superfusion mit Ringer und fahren Sie mit den Aufnahmen. </li></ol> 5. Recordings <ol><li> Absenken des Saug-Elektrode mit der Ölleitung in die Aufnahmekammer und regulaß die Höhe des Ölreservoirs bis leicht positiven Druck an der Pipettenspitze zu etablieren. Dies kann zB durch Beobachten Zelltrümmer weg von (Überdruck) oder in Richtung (Unterdruck) der Pipette erfolgen. Versuchen Sie nicht, um die Spitze der Pipette mit Zelltrümmern verunreinigen. </li><li> Scannen des Ableitkammer für ein isoliertes ORN die durch ihre typische Morphologie unter Verwendung eines bipolaren Vergrößerung von 20-40x erkannt werden kann. Bewegen der Aufnahme-Elektrode in der Nähe des ORN Zellkörper. Sanft gestartet saugen, so daß die Zellkörper in die Spitze der Pipette eintritt. Vorsichtig und langsam weiter Saug gelten, bis die gesamte Zellkörper in die Spitze der Saugpipette gezogen wird, so dass die Dendrit und Zilien ausgesetzten der Badlösung. Für Bilder der angesaugten ORN und Pipette Formen 7,11. Stellen Sie sicher, dass, sobald kein Sog angewendet wird, die ORN bewegt sich nicht in die oder aus der Pipette. Wenn ja, Einstellen der Höhe des Ölreservoirs entsprechend. </li><li> Mit denMikromanipulatoren, bewegen die Saugpipette aus dem Abschnitt enthaltend die abgewickelt ORN zu dem Aufzeichnungsabschnitt der Kammer. Legen Sie das Saugpipette vor der 3-barreled Röhre Lösung Austausch. Die Saugpipette sollte so nah an der Öffnung des Rohres 3-tonneliert werden, so dass die ORN zu einer laminaren Strömung wodurch Mischen Turbulenz ausgesetzt ist und eine schnelle Lösung Austausch zu erreichen. Die Lösung Austausch wird durch Abstufung der Grenzfläche zwischen parallelen Strömen von strömenden Lösung über die Spitze der Saugpipette erreicht. Der zeitliche Verlauf der Lösung Austausch ist typischerweise etwa 20 ms, von der Kreuzung durch Abstufung der aktuellen Zelle zwischen Lösungen unterschiedlicher Ionenzusammensetzung (siehe Abb. 2). Evozierten gemessen. Lösungen werden durch die Schwerkraft geliefert. </li></ol> &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> Abbildung 1. A) Bipolar-Rezeptor Neuronen im Riechkolben. B) Signaltransduktion Maschinen in der Zilien führt letztendlich zu aktuellen Zustrom exzitatorischen. Die daraus resultierende Depolarisation auslöst Aktionspotential Generation an der Zellkörper. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> Abbildung 2 zeigt die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit der Lösung Austausch. Eine Pipette wurde von der normalen in 10% verwässert Ringer für 100 ms und die Verbindungsstelle resultierende Strom aus der unterschiedlichen Ionen-Konzentration aufgezeichnet wurde intensiviert. Schwarze Kurve ist die aveWut von 5 Studien verfolgen rote ihre SD. Der kleine Änderung in SD während der Lösung Austausch zeigt die Zuverlässigkeit der Lösung Austausch von Versuch zu Versuch und das Fehlen von übermäßigem Rauschen entweder in Lösung Stream. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> Abbildung 3 zeigt eine Eugenol-induzierten Antwort von einem ORN Verwendung der Saugpipette Technik. Die ORN wurde auf 100 uM Eugenol für 1 Sekunde ausgesetzt, wie durch den Balken oberhalb der Aufnahme angezeigt. In Abb. 3A (schwarze Kurve) der Rezeptor Strom wurde bei einer Bandbreite gefiltert 0 - 50 Hz, um nur die Rezeptorstrom Abb.. 3B zeigt die gleiche Aufnahme, jetzt bei der großen Bandbreite von 0 gefiltert - 5000 Hz (rote Kurve) auch angezeigt Aktionspotentiale (APs, durch Pfeile angedeutet). Der Einschub zeigt das gleiche Spur auf einer Zeitskala erweitert zu APs deutlicher sichtbar zu Beginn der Reaktion. <img alt="Abbildung 4." src = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4. Dosis-Wirkungs-Familie eines Eugenol ansprechenden ORN (A). Eugenol in Konzentrationen im Bereich von 0,3 um bis 100 um verwendet wurde, war die Reizdauer 1 s und Spuren wurden bei 0 filtriert - 50 Hz liegt. Eine schrittweise Erhöhung Odormittelkonzentration führte zu einer größeren und schnelleren Reaktion, die auch beendet langsamer einmal Odorans Belichtung beendet wurde. ORN kann das Schwingungsverhalten Muster während langer Stimulationen an Zwischenpositionen Geruchsstoffkonzentrationen (4B) anzuzeigen. Hier ein acetephenone (3 uM), die ORN wurde für 8 Sekunden stimuliert. Nach einer schnellen und transienten Spitzenempfindlichkeit zu Beginn der Stimulation einer Reihe kleinerer, sich wiederholenden Reaktionen beobachtet. Die Aufnahme Bandbreite betrug 0 - 50 Hz.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<p class="jove_content"&gt; Die Saugpipette Technik ist eine elektrophysiologische Methode, die verwendet werden, um den Geruch-induzierten langsamen Rezeptorstrom und die schnelle biphasische Aktionspotentiale aus einem ORN gleichzeitig aufzuzeichnen. Da der Plasmamembran der Zelle nicht verletzt wird, verlässt dieses Verfahren den intrazellulären Milieu ungestörten sicherzustellen, dass die Antworten nicht Odorans verändert aufgrund von Änderungen der cytoplasmatischen Ionenkonzentrationen oder Verdünnung von intrazellulären Faktoren. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Stoffes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Lufttisch </td><td> Ausrüstung </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Luftpumpe </td><td> Ausrüstung </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Puller </td><td> Ausrüstung </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas </td><td> Ausrüstung </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse Inverses Mikroskop </td><td> Ausrüstung </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Ausgestattet mit Hg-Lampe, GFP-Filter und Ziele 20X und 5X mindestens </td></tr><tr><td> Amplifier PC-501A </td><td> Ausrüstung </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 G </td></tr><tr><td> Diamantmesser </td><td> Ausrüstung </td><td> Maßgeschneidert </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitizer Mikro1401 A / D </td><td> Ausrüstung </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filter-Einheit 3382 </td><td> Ausrüstung </td><td> Krohn Hite Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Signal </td><td> Software </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Geformt Ag / AgCl Pellet </td><td> Ausrüstung </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettenhalter </td><td> Ausrüstung </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Benutzerdefinierte modifiziert, um fit Headstage </td></tr><tr><td> Aufnahme Kammer </td><td> Ausrüstung </td><td> Maßgeschneidert </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator MP85-1028 </td><td> Ausrüstung </td><td> Sutter Instrument </td><td> Micromanipulator MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Lösung </td><td> Sigma </td><td> 330.779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Oszilloskop TDS 1001 </td><td> Ausrüstung </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Drei Läufen Platz Glasrohr </td><td> Ausrüstung </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm Innendurchmesser, 5 cm lange </td></tr><tr><td> Ventil </td><td> Ausrüstung </td><td> Die Lee Company </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> Ausrüstung </td><td> Automatisieren Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B Perfusion schnellen Schritt </td><td> Ausrüstung </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

Tiere probieren Sie die Geruchsstoffe Umwelt um sie herum durch die chemosensorischen Systemen in der Nasenhöhle befindet. Chemosensorische Signale beeinflussen komplexe Verhaltensweisen wie die Wahl der Lebensmittel, Raubtier, Artgenossen und Mate Anerkennung und anderen gesellschaftlich relevanten Hinweisen. Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) im dorsalen Teil der Nasenhöhle im olfaktorischen Epithel eingebettet. Diese bipolare Nervenzellen senden Sie eine Axon zum Riechkolben (siehe Abb. 1, Reisert &amp; Zhao 1, ursprünglich im Journal of General Physiology veröffentlicht) und Erweiterung eines einzigen Dendriten der epithelialen Grenze, von wo aus Zilien strahlt in den Schleim, der die olfaktorische deckt Epithel. Die Flimmerhärchen enthalten die Signaltransduktion Maschinen, die letztlich zu aktuellen Einstrom durch den ciliary Transduktion Kanälen, zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanal und einem Ca 2 +-aktivierten Cl exzitatorischen - Kanal (Abb. 1). Die anschließende depolarization löst Aktionspotential Generation am Zellkörper 2-4. In diesem Video beschreiben wir die Verwendung des &quot;Saugpipette Technik&quot;, um Duftstoff-induzierten Reaktionen von ORN aufnehmen. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um aus Stäbchen-Photorezeptoren 5 aufnehmen und eine Variante dieser Methode können jove.com modifiziert, um von der Maus Zapfen-Photorezeptoren 6 aufzeichnen gefunden werden. Die Saugpipette Technik wurde später auch angepasst ist, um aus 7,8 ORN aufzuzeichnen. Kurz nach der Dissoziation des olfaktorischen Epithel und Zellisolation wird die gesamte Zelle Körper eines ORN in die Spitze einer Pipette angesaugt Aufzeichnung. Die Dendriten und die Zilien frei bleiben der Badlösung und somit zugänglich Lösung Änderungen an zB Geruchsstoff oder pharmakologische Blocker-Anwendung zu ermöglichen. In dieser Konfiguration wird kein Zugriff auf die intrazelluläre Umgebung gewonnen (kein Ganzzell-Spannungsklammer) und die intrazelluläre Spannung bleibt frei zu variieren. Dies allesverdankt die gleichzeitige Aufnahme der langsamen Rezeptor-Strom, der an der Zilien und schnelles Handeln Potenziale durch den Zellkörper 9 abgefeuert stammt. Der Unterschied in der Kinetik zwischen diesen beiden Signalen ermöglicht ihnen getrennt mit verschiedenen Filtereinstellungen werden. Diese Technik kann auf jedem Wildtyp oder Knockout-Maus verwendet werden oder selektiv aufzuzeichnen aus ORN, die GFP exprimieren auch an spezifische Teilmengen von ORN kennzeichnen, z. B. die Expression eines bestimmten Rezeptors oder Geruchsstoff Ionenkanal.

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Aufrufe.  Monell Chemical Senses Center. Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.

Serie: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

In Vivo dreidimensionale zwei-photonische Mikroskopie zur Untersuchung von durchgeführten Gefäßreaktionen durch lokale ATP-Auswurf mit einer Glas-Mikropipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...