המחקר מומן על ידי אוניברסיטת Linköping המועצה של מחוז Östergötland.

1. Ovariectomy דרך כביש הגבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעל החיים, למשל באמצעות 1.5% isoflurane (4% לזירוז) ב תחמוצת החמצן / החנקן 30% / 70% תערובת. מניחים את חיה במצב נוטה על צלחת חימום מחובר מדחום רקטלי. חשוב יש שכבה דקה של בידוד בין החיה לבין צלחת, וכי במערכת ההזנה גב המדחום שומר על טמפרטורת הגוף בתוך 37 ± 0.5 ° C. החל ג&#39;ל להגנה העין ולנהל 5 מ&quot;ג Rimadyl / ק&quot;ג משקל גוף מדולל מלוחים מתחת לעור על ההיבט לרוחב הצוואר של החיה להקלה על הכאב לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבי 4 * 4 ס&quot;מ (3 * 3 ס&quot;מ עבור עכברים) באזור cephally מפסגת הכסל. לשטוף את האזור ביסודיות עם מגולח עבור Jodopax למשל לפני המכסה את חיה עם 4 * 4 ס&quot;מ צמצם גיליון הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע 2-3 ס&quot;מ בוטה לנתח את העור fascia הבסיסית. אחד ס&quot;מ לרוחב של קו האמצע, לעשות עוד thro החתךאיכס fascia. חד וחלק לנתח רוחבית תחת fascia זאת באופן שטחי ככל האפשר להגיע עד חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה, לתפוס את רקמת השומן המקיף את השחלה בחלל הבטן בעדינות למשוך אותו החוצה. זהה את השחלה ו ולקשור את קרני הרחם וכלי 0.5-1 ס&quot;מ proximally של מבנה זה. לחתוך את השחלה ורקמת השומן ligated והחזרתי את הרקמה שנותרה לתוך חלל הבטן. לעשות עוד חתך ב fascia הנגדי וחזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגור את הפצעים, רצוי באמצעות תפר monofilament, ולתת חיים ער מן ההרדמה. מניחים את בעל החיים בכלוב מחוממת (25-27 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 2 שעות לאחר הניתוח. בעלי החיים צריכים להיות מאוחסנים בנפרד בימים הראשונים לאחר הניתוח. זה מרכזי כי הוא ניקה את הכלוב לעתים קרובות / להחליף בשלב ההתאוששות. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, מזריקים את החיות מתחת לעור עם עוד משקל גוף 5 Rimadyl / ק&quot;ג מ&quot;ג מדוללמי מלח. </li></ol> 2. תת עורית מינהל 17β-אסטרדיול דרך קפסולות Silastic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את הכמות הרצויה של 17β-אסטרדיול בשמן שומשום. עבור ריכוזים פיזיולוגיים אצל חולדות ועכברים, אנו ממליצים על 180 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 18-36 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהתאמה. כמוסות פלסבו מלאים שמן שומשום טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 3 ס&quot;מ (2 ס&quot;מ על עכברים) באורכים של צינורות silastic ו -5 מ&quot;מ (3 מ&quot;מ על עכברים) אורכי מקלות המוליך עץ עבור חיבור. באמצעות מלקחיים, לסחוט 1 תקע עץ לתוך הקפסולה silastic לפני הזרקת הפתרון שמן 17β-estradiol/sesame למלא את אורכו. בעדינות מכסה את הקפסולה silastic בסופו של דבר לפתוח עם חבר אחר עץ (את המצתים אמורים להישאר באופן קבוע קפסולה). דגירה כמוסות בתמיסה 17β-אסטרדיול הנותרים לילה לפני ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלת הקפסולה ניתן לבצע במהלך ההרדמה בשימוש ovariectomy בחולדות. עבור מייללספירה, עם זאת, תקופה של 14 יום לאחר ההתאוששות ovariectomy מומלץ כדי למזער את הסיכון של הקפסולה בולטות דרך העור שביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההכנות כירורגית כמו 1.1, או לאחר סגירת החתך ovariectomy, להתגלח ולשטוף 2 * 2 ס&quot;מ באזור בהיבט הגבי של הצוואר של בעל החיים. לעשות חתך 1 ס&quot;מ בוטה לנתח בכיס תת עורית caudolaterally, עם שטח נרחב של הקפסולה. נגב את הקפסולה silastic (שעד נקודת זמן זו כבר מודגרות בפתרון 17β-אסטרדיול) ובעדינות להתקין אותו דרך חתך, אשר נסגר לאחר מכן על ידי תפר. זה מרכזי על מנת לוודא כי זנים הקפסולה העור מעט ככל האפשר, בעיקר באזור קרוב הפצע. מייצור של כמוסות עד ההשתלה, חשוב כי זיהום הוא התחמק. </li></ol> 3. מינהל Peroral של 17β-אסטרדיול דרך נוטלה אגוזים, קרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר ביסודיות 17β-אסטרדיול בשמן שומשום, ואז לערבב עם שמן שומשום הנוטלה. אנו ממליצים כי כל חלק מכיל 28 מיקרוגרם ביום 17β-אסטרדיול, 5 שמן שומשום μL ו 1 הנוטלה גרם לכל קילוגרם משקל גוף לחולדות ו 1.12 מיקרוגרם 17β-אסטרדיול, 0.312 שמן שומשום μL ו 60 מ&quot;ג הנוטלה על העכבר 30 גר &#39;כל אחד. פלצבו אגוז קרם מוכן זהה רק בלי 17β-אסטרדיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכשיר את בעלי החיים לאכול הורמון ללא קרם אגוזים במשך חמישה ימים לפני הניסוי. הראשונים שלושה ימים של אימונים, החולדות בצורה אופטימלית צריך לאמן בקבוצות (בערך 0.5 גרם ל 2-5 הנוטלה בעלי חיים), בכלובים מוצאם. בימים רביעי וחמישי של אימונים, החיות לשים בכלובים נפרדים לפני שקיבל את החלק היומי לדמות את המצב ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניסוי, החיות לשים בכלובים נפרדים לכל אירוע האכלה, לאחר מכן את החלק הנוטלה מוגשת על אריחי קרמיקה קטנים. אם האימונים שבוצעה לעיל, oניסיון ur היא כי יותר מ 95% של חולדות ועכברים לקבל אגוז, שמנת, ופעם מורגל לחלוטין, רוב בעלי החיים צורכים אותו תוך שניות. </li></ol> 4. נציג תוצאות פיזיולוגיים בסרום 17β-אסטרדיול ריכוזי, אשר השיטות הקיימות שמטרתם לשחזר, הם כ 5-140 pg / mL עבור חולדות 5-35 pg / mL על עכברים 4,6. את הכמוסות תת עורי silastic בהתאם להוראות הנ&quot;ל, כאשר מנוהל ל -300 גר &#39;נשים Sprague-Dawley חולדות, לייצר לאט יורד 17β-אסטרדיול ריכוז בסרום של היום סביב 40 ​​pg / mL יום pg / mL 2-10 35. עם זאת, מיד לאחר מתן, לשיא הריכוז בדם סביב 1000 pg / mL ניתן לצפות, נופל לטווח הפיזיולוגי בתוך 8 שעות (איור 1 א) 4,5. את הכמוסות silastic עבור עכברים שתוארו לעיל עם 17β-estradiol/mL 36 מיקרוגרם, כאשר מנוהל עד 25 גרם נקבה C57BL / 6 עכברים, להפוך קונצרט כלשהו סרוםentrations כי לאט לאט להפחית מן PG כ 90 / יום מ&quot;ל 2-25 pg / mL 35 יום. זה קדמו כנראה לשיא דומה נמצאה אצל חולדות, אם כי זה לא נחקר (איור 1 ב) 6. שיטת הנוטלה peroral עם מינונים שתוארו לעיל, כאשר מנוהל ל -300 גר &#39;נשים Sprague-Dawley חולדות, הופך רמות פיזיולוגיות של 17β-אסטרדיול עם תנודות יומיות בין 10-70 pg / mL (איור 2 א) 4. על עכברים באמצעות המינון לעיל, רמות יומיות משתנות בין כ 20 ו - 120 pg / mL (איור 2 ב) 6. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4013/4013fig1.jpg" /> <st<html> Rong.&gt; איור 1 גרפים המציגים מסוגננים 17β-אסטרדיול ריכוזים של חולדות (, n = 10 בזמן נקודות עד 24 שעות, n = 15 ב מאוחרים יותר זמן נקודות) 4.5 ו עכברים (B, n = 10) 6 לאחר ההשתלה הקפסולה. את הכמוסות silastic לייצר שיא ראשונית קצרה של ריכוזים בסרום עד 1000 pg / mL, אבל ירידה תוך מספר שעות לרמות נמוכות 100 pg / mL. בשבועות הקרובים 4-5, קפסולות התשואה יציבה, למרות יורדת בהתמדה, ריכוז בסרום. באזורים מוצלים מתאימות 17β-אסטרדיול בסרום ריכוזים פיזיולוגיים של חולדות נקבות ועכברים שלמים בהתאמה. גם אם לא הוכיח ראייה הגרפים, יש בין הפרט השונות של 17β-אסטרדיול ריכוזי, עיבוד מקדמי השונות בין 27% ל 183 בחולדות מ 28 ל 115% בעכברים עם שיטת הקפסולה silastic (ממוצע נמוך מאוד לעתים קרובות ליצור ריכוז גבוה של מקדמי השונות). iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2 גרפים המציגים מסוגננים 17β-אסטרדיול ריכוזים של חולדות (, n = 15). 4 ו עכברים (B, n = 10) 6 כתוצאה של הממשל הורמון מדי יום הנוטלה. שיטת הנוטלה peroral הופך פסגות היומי, אך לא בהרבה גבוה ככל המיוצר על ידי תת עורית או בשיטות תוך ורידי. זה מחקה את פרמקוקינטיקה של טיפול הורמונלי חלופי האדם, והטיפול peroral יכול להמשיך כל עוד הצורך, גם אם בדוגמה לעיל רק להציג ראשונית 96 שעות. באזורים מוצלים מתאימות 17β-אסטרדיול בסרום ריכוזים פיזיולוגיים של חולדות נקבות ועכברים שלמים בהתאמה. גם אם לא הוכיח ראייה הגרפים, יש בין הפרט השונות של 17β-אסטרדיול ריכוזי, עיבוד מקדמי וריאציה מ% 40-132 בחולדות מ 13 ל 219% בעכברים עם שיטה את הנוטלה (ריכוזים ממוצעים נמוכים מאוד לעתים קרובות יוצרים גבוההמקדמי השונות).

<ol>
	<li>Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-related+neuroprotective+versus+neurodamaging+effects+of+estrogens+in+rat+cerebral+ischemia:+a+systematic+analysis.">Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).</li><li>Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+methods+for+administering+17beta-estradiol+to+ovariectomized+rats+result+in+opposite+effects+on+ischemic+brain+damage.">Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormesis+and+Female+Sex+Hormones.">Hormesis and Female Sex Hormones.</a> Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).</li><li>Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+17beta-estradiol+administration+to+rats.">Methods for 17beta-estradiol administration to rats.</a> Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).</li><li>Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+of+magnitude+differences+between+methods+for+maintaining+physiological+17beta-oestradiol+concentrations+in+ovariectomized+rats.">Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats.</a> Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).</li><li>Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+long-term+17beta-estradiol+administration+to+mice.">Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice.</a> General and comparative endocrinology. , (2011).</li><li>Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentrations+of+buprenorphine+after+oral+and+parenteral+administration+in+male+mice.">Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice.</a> Vet. J. 187, 251-254 (2011).</li><li>Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogens+may+reduce+mortality+and+ischemic+damage+caused+by+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+female+rat.">Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat.</a> J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).</li><li>Wise, P. M., Dubal, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+protects+against+ischemic+brain+injury+in+middle-aged+rats.">Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats.</a> Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).</li><li>Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+recovery+of+autonomic+function+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+male+rats.">Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).</li><li>Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+17beta-oestradiol+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion.">Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).</li><li>Carswell, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+17beta-estradiol+upon+stroke+damage+in+stroke+prone+and+normotensive+rats.">Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).</li><li>Yong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17beta-estradiol+potentiates+ischemia-reperfusion+injury+in+diabetic+ovariectomized+female+rats.">17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats.</a> Brain Res. 1054, 192-199 (2005).</li><li>Theodorsson, A., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+increases+brain+lesions+in+the+cortex+and+lateral+striatum+after+transient+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats:+no+effect+of+ischemia+on+galanin+in+the+stroke+area+but+decreased+levels+in+the+hippocampus.">Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus.</a> Peptides. 26, 2257-2264 (2005).</li><li>Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+and+effective+method+for+chronic+17beta-estradiol+administration+to+mice.">Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice.</a> Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מצבי ניהול שהוצגו לעיל יש מחקרים קודמים הוכיחו עליונות שחרור איטי כדורי מסחריים זריקות במונחים של הפקת ריכוזים בסרום הפיזיולוגיות של 17β-אסטרדיול. בעוד כדורי שחרור איטי לייצר גבוהות מאוד וממושכת פסגות ריכוז בסרום, הזריקות גורמים קיצוניים, תנודות ההורמונים היומיות ו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Rimadyl, 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> פייזר </td><td> 462986 </td><td> שיכוך כאבים לאחר הניתוח לאחר ovariectomy. </td></tr><tr><td> Lubrithal ג&#39;ל עיניים </td><td> ליאו מעבדות </td><td></td><td> עין ההגנה במהלך הניתוח. </td></tr><tr><td> Jodopax הווטרינר </td><td> Pharmaxim </td><td></td><td> ניתוח חיטוי. </td></tr><tr><td> תפר 4-0 Vicryl </td><td> ג&#39;ונסון אנד ג&#39;ונסון </td><td></td><td> בסופו של תפר ו קשירת השחלה. </td></tr><tr><td> 17β-אסטרדיול,&gt; 98% </td><td> סיגמא </td><td> E8875-1G </td><td> בשמן שומשום על קפסולות silastic ו נוטלה. </td></tr><tr><td> שמן שומשום </td><td> סיגמא </td><td> S3547-1 ליטר </td><td> המסת 17β-אסטרדיול. </td></tr><tr><td> צינורות Silastic, מזהה / OD: 1.575/3.175 מ&quot;מ </td><td> Dow Corning </td><td> 508-008 </td><td> ייצור של כמוסות silastic. </td></tr><tr><td> המוליך מעץ מקל </td><td> Selefatrade </td><td> 12-0783 </td><td> מכסת של כמוסות silastic. </td></tr><tr><td> נוטלה </td><td> פררו </td><td></td><td> בינונית peroral 17β-אסטרדיול. </td></tr></tbody></table>

ovariectomy and 17&beta;-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration

אסטרוגנים הם משפחה של הורמונים המין הנשי עם קשת רחבה של תופעות. כאשר חולדות ועכברים משמשים במחקר אסטרוגן הם ovariectomized בדרך כלל על מנת לקטוע את ייצור הורמון במהירות רכיבה על אופניים, החלפת 17β-אסטרדיול exogenously. יש, עם זאת, חוסר הסכמה לגבי אופן ההורמון צריכה להינתן להשיג ריכוזים בסרום פיזיולוגיים. זה קריטי, מאחר 17β-אסטרדיול ברמה / שיטת הממשל באופן עמוק משפיע על תוצאות הניסוי 1-3. יש לנו בשורה של מחקרים שאפיינו את מצבים שונים של הממשל 17β-אסטרדיול, שמצא כי תת עורי כמוסות silastic ו לכל בעל פה אגוז קרם נוטלה נעלים על שחרור איטי כדורי זמינים מסחרית (המיוצר על ידי החברה מחקר חדשני של אמריקה) זריקות יומיות במונחים של הפקת ריכוזים בסרום הפיזיולוגיות של 17β-אסטרדיול 4-6. בין עו&quot;דantages של שיטת קרם אגוזים, שקודם לכן שימש במשך 7 עצירות הממשל, היא כי כאשר נעשה שימוש לניהול אסטרוגן הוא דומה peroral טיפול הורמונלי חלופי והוא לא פולשנית. את silastic כמוסות תת עורי נוח לייצר הריכוזים בסרום יציבה ביותר. מאמר זה סרט וידאו כולל שלב אחר שלב הפגנות של ovariectomy ו-17β אסטרדיול הורמונלי על ידי קפסולות silastic ו נוטלה peroral אצל חולדות ועכברים, ואחריה לדיון על היבטים חשובים של תהליכי הניהול.

Watch this Scientific Journal Video about Ovariectomy and 17Î²-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration at JoVE.com

Ovariectomy and 17&amp;#946;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

Ovariectomy והחלפת הבאות של 17β-אסטרדיול באמצעות כמוסות silastic ו נוטלה peroral הם הפגינו חולדות ועכברים.

Ovariectomy ו-17β אסטרדיול החלפת בחולדות ועכברים: הפגנה חזותית

Estrogens are a family of female sexual hormones with an exceptionally wide spectrum of effects. When rats and mice are used in estrogen research they are ...

ovariectomy-17-estradiol-replacement-rats-mice-visual

Research

JoVE Journal

Biology

Ovariectomy and 17&beta;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

56.7K Views.  Linköping University. Ovariectomy והחלפת הבאות של 17β-אסטרדיול באמצעות כמוסות silastic ו נוטלה peroral הם הפגינו חולדות ועכברים.

Video: Ovariectomy and 17&#946;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

מערכת מגנטית לקשור לחקור חזותית חוש הריח בקרת טיסה מתווך תסיסנית

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

הפגנה של עורית Allodynia בשיתוף עם כאבי אגן כרוניים

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research. Working confidently and humanely with mice and rats requires a basic competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle animals. One-handed, two-handed, and restraint with specially designed restraint objects will be illustrated. Often, another part of the research or testing use of animals is the effective administration of compounds to mice and rats. Although there are a large number of possible administration routes (limited only by the size and organs of the animal), most are not used regularly in research. This video will illustrate several of the more common routes, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, and oral gavage. The goal of this article is to expose a viewer unfamiliar with these techniques to basic restraint and substance administration routes. This video does not replace required hands-on training at your facility, but is meant to augment and supplement that training.

Working safely and humanely with research rodents requires a core competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle and effectively administer compounds to mice and rats.

איפוק ידני ומסלולי מנהל מתחם נפוצים בעכברים וחולדות

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

Necropsy לאבחון רקמות אוסף נבחר מדגם של חולדות ועכברים

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

הפגנת מעבדה לפיזיולוגיה: גלומרולרי סינון שיעור בחולדה

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...