עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לחברי מעבדת סייב לדיונים רבים שימושיים וביקורת בונה, ולאוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.

1. הכנה לmicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט עומס microinjection עם צבע זרחני (FITC-dextran). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחט על micromanipulator ומכשירי microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור מחט microinjection זהירות בעזרת מלקחיים לבערך 2 מיקרומטר ברוחב, לעומת זאת, זה משתנה בהתאם להגדרת microinjector. למחטי microinjection, זה מקביל לאזור 1 של המחט מהקצה שלא מתכופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גודל ירידה בנפט, התאמת זמן הזרקה ולחץ, כך שכל זריקה מספקת 1 nl. הגדרות דוגמה לרווארד Apparatus microinjector הם: איזון P = 1.4 psi, P = יצא 1.4 psi, P = 22.9 psi להזריק, P = 67.8 psi הברור עם זמן הזרקה של 0.4-0.7 שניות. הקוטר של המחט שלנו תוך שימוש בהגדרות אלה הוא בערך 2 מיקרומטר. עם זאת, הגדרות תהיינה microinjector ספציפית, ולהשתנותccording למחט הקוטר. </li></ol> 2. הכנת העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל 2 מנות עם 1% agarose במים לכל מצב, חורים להציץ לתוך agarose עם קצה פיפטה 1-200 μl, ולהסיר תקעי agarose. מלא מנות עם תקשורת עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחי שימוש בעוברים, dechorionate ש18 hpf או מבוגר תחת stereomicroscope. עוברים מבוימים פי קימל et al. 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברי dechorionated לצלחת מצופית 1 agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עוברים, להוסיף tricaine (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) למנה עד עוברים מפסיקים לנוע (שנעשה על פי 12 Westerfield). </li></ol> 3. הזרקת החדרים במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי אוריינט אז אתה מסתכלים על צד הגב שלהם על ידי הצבת את הזנב של העובר לתוך החור. אם micromanipulator הוא בצד ימין, ולאחר מכן להעביר את העובר כך שהמוח הקדמי הוא לשמאל ולמוח האחורי בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט בעמדת wiנקודת dest של חלל המוח אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות צלחת גג לנקב של חלל המוח האחורי להיות בטוח שלא לעבור את עומק המוח בחלמון (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 1-2 nl של צבע פלואורסצנטי אל חדרי הלב מוודאים צבע ממלא את כל האורך של חדרי המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לצלחת המצופית agarose השנייה, מלאת תקשורת עובר ולהרדים מחדש כפי שמתואר ב2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להתחיל הדמיה, כאמורה בסעיף 4 על מנת לקבל תמונת זמן אפס. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי אוריינט עם הזנב בחור כמתואר בסעיף 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ לנתח עם אור ניאון וגם משודר לקחת תמונה הגבה brightfield. שמור את ההגדלה מתמדת בין ההדמיה של עוברים שונים. זה מאפשר השוואה ישירה של ניתוחים שבוצעו באמצעות התמונה J (5.2-6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להזיז את העובר, מיקרוסקופ או צלחת, לוקחתמונת ניאון מקבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור כל עובר בנקודתי זמן רצוי. </li></ol> 5. כימות של תנועת דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג brightfield ותמונות ניאון בפוטושופ כפי שתואר בעבר על ידי Gutzman וסייב 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את מרחק המהלכים הקדמיים לצבוע בתוכנת J תמונה זמינה <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובץ ממוזג פתוח בJ תמונה ולהשתמש בכלי קו למתוח קו מנקודת ציר המוח הקדמי לצבוע את החזית בזווית 10-20 מעלות מneuroepithelium (איור 1 א). אזור זה נבחר משום שהוא האתר הראשון והבולט ביותר של צבע דולף neuroepithelium הסוג הפראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כלי מדידה לחישוב אורכו של קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל פעם נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מרחק נטו מול הצבע עבר לאורך זמן על ידי הפחתה במרחק t = 0 מנקודתי זמן אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה עלגרף. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמה לתוצאות המתקבלות בבדיקת חדירות neuroepithelial שימוש בעוברים בסוג בר מוצגת באיור 1 ב-D. מדויק כדי להבדיל חדירות, כדאי לבדוק עם צבעים weightsto המולקולרי שונה לזהות שגודל הוא רק מעט דולף בסוג בר או עוברי ביקורת (איור 2). זה מאפשר זיהוי של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים שגם עלייה או ירידת חדירות (1D איור, ירוק וקווים אדומים בהתאמה). לneuroepithelium 24 hpf דג הזברה, 70 kDa הדלפות FITC dextran לאט במשך 2 שעות, ואילו 2,000 kDa אין ו10 kDa כמעט מייד דולף החוצה. לכן 70 kDa הוא המשקל המולקולרי האידיאלי כדי לזהות מצבים שגם עלייה וירידת חדירות neuroepithelial. אם המחט מתגעגעת לום חדרית, פלואורסצנציה wחולה מופיע מחוץ למוח בזמן t = 0 (לדוגמה ראה Gutzman וסייב, 2009 10). העוברים האלה אמורים להיות מושלכים מאז לצבוע הזריקו לא הכילו בתחילה בתוך המוח ואין מסקנה ברורה לגבי תנועה של הצבע והחדירות של neuropeithelium יכולה להתבצע. לבסוף, אם יש עוברים חללים קטנים או חדרים במוח בלתי מנופחים, לפני הזרקה של חדרי מוח עם תמיסת מלח אפשר לעשות לפני הזריקה של צבע פלואורסצנטי. זה מנפח את החדרים שהופכים לאחר מכן להדמיה של חדרים קלים יותר כאשר הזרקה עם צבע פלואורסצנטי. בקרות נאותות חייבות להתבצע כדי לקבוע אם הזרקה של מי מלח משבשת התפתחות צינור עצבית נורמלית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig1.jpg" /> איור 1. כמובן זמן של צבעי משקל מולקולריים שונים. () תרשים ניסויי. ראשון, צבע פלואורסצנטי מוזרק לתוך חדרי הלב. X = מיקום של מחט להזרקה. תמונות גב באות נלכדות לאורך זמן. לבסוף, המרחק התרגש מול הצבע מהמוח הקדמי ציר נקודה נמדדה (מיוצג ע&quot;י קו אדום). (BC) Merged brightfield ותמונות גב ניאון ב22 hpf (t = 0 דקות, B) ו24 hpf (t = 120 דקות, ג). לבן קו מציין מרחק של חזית הצבע מהמוח הקדמי חדר לב. (ד) נתוני חדירות מדגם היפותטיים. כחול = סוג בר או פקדים, אדום = דגימה עם חדירות ירדו יחסית לשליטה, ו= מדגם ירוק עם חדירות יחסית לשליטה מוגברת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig2.jpg" /> איור 2. מדידה של חדירות לצבע neuroepithelial משקל מולקולרי שונה. (AE) brightfield ממוזג הגבה ותמונות ניאון של 22 עוברי סוג בר hpf בt = 0 דקות לאחר הזרקה עם FITC-dextran של המשקלים המולקולריים הבאים: 10 KDA (A), 40 KDA (ב &#39;), 70 KDA (C), 500 KDA (ד&#39;) וכ -2,000 KDA (E). עובר (A&#39;-E &#39;) בדיוק כמו ב( AE) בt = 120 דקות ב 24 hpf. קדמי לשמאל. F = מוח קדמי, מ = מוח תיכון, H = מוח אחורי. אסטריסק = אוזן.

<ol>
	<li>Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+neurulation:+first+impressions+do+not+count.">Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).</li><li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+vertebrate+neurulation+and+a+re-evaluation+of+teleost+neural+tube+formation.">Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation.</a> Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).</li><li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex:+an+in+vivo+study.">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li><li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li><li>Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li><li>Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li><li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Totally+tubular:+the+mystery+behind+function+and+origin+of+the+brain+ventricular+system.">Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system.</a> Bioessays. 31, 446-458 (2009).</li><li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead/atp1a1a.1+gene+products.">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+neuroepithelial+barrier+by+Claudin5a+is+essential+for+zebrafish+brain+ventricular+lumen+expansion.">Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).</li><li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+brain+ventricle+injection.">Zebrafish brain ventricle injection.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Information+Network+(ZFIN):+a+resource+for+genetic,+genomic+and+developmental+research.">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנחנו מדגימים את היכולת לכמת חדירות של המוח העוברי דג זברת החיים כפי שנקבע לצבע מוזרק של משקל מולקולרי נתון. התצפית שלנו שneuroepithelium דג הזברה העוברית הוא דיפרנציאלי חדיר לצבעים שונים של משקולות מולקולריות מצביעה שהצבע עובר דרך חדירות paracellular. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Dextran, fluorescein, anionic, ליזין ניתן לתקן </td><td> Invitrogen </td><td> D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 </td></tr><tr><td> Tricaine אבקה </td><td> סיגמא </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> צינורות נימים </td><td> Fhc בע&quot;מ </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

an assay for permeability of the zebrafish embryonic neuroepithelium

מערכת חדרית המוח נשמרת בין חוליות והוא מורכב מסדרה של חללים המחוברים ביניהם בשם חדרים במוח, שיוצר בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות מוח ונשמרים לאורך חייו של בעל החיים. מערכת חדרית המוח נמצאת בבעלי חוליות, ואת החדרים להתפתח לאחר היווצרות צינור עצבית, כאשר החלל המרכזי מתמלא בנוזל שדרה (CSF) 1,2. CSF הוא נוזל עשיר בחלבון שהוא חיוני להתפתחות תקינה של מוח ותפקוד 3-6. בדג הזברה, אינפלצית חלל המוח מתחילה בכ 18 הפרית הודעה לשעה (hpf), לאחר שהצינור העצבי סגור. תהליכים מרובים קשורים בהיווצרות חלל מוח, כולל היווצרות neuroepithelium, היווצרות צומת הדוקה המווסתת את החדירות וייצור CSF. אנחנו הראינו כי Na, K-ATPase נדרש לאינפלצית חלל המוח, משפיעים כל התהליך אלהes 7,8, ואילו 5a claudin הוא הכרחי להיווצרות צומת הדוקה 9. בנוסף, הראה כי &quot;רגיעה&quot; של neuroepithelium העוברי, באמצעות עיכוב של שרירן, קשור באינפלצית חלל מוח. כדי לחקור את הרגולציה של חדירות במהלך אינפלצית חלל מוח דג זברה, שפתחנו assay שמירת צבע חדרית. שיטה זו משתמשת בהזרקת חלל מוח בעובר דג זברת חיה, טכניקה שפותחה בעבר במעבדה שלנו 10, fluorescently לתייג את הנוזל השדרתי. עוברים ואז הם צלמו לאורך זמן את מהלכי צבע הניאון דרך החדרים במוח וneuroepithelium. המרחק מול הצבע מתרחק מהצד הבסיסי (שאינו luminal) של neuroepithelium לאורך הזמן הוא לכמת והוא מדידת חדירות neuroepithelial (איור 1). אנו צופים שבצבעים 70 KDA וקטן יעברו דרך neuroepithelium ויכולים להיות detecteד מחוץ למוח העוברי דג הזברה ב 24 hpf (איור 2). assay שמירת צבע זה יכול לשמש כדי לנתח חדירות neuroepithelial במגוון רחב של רקע גנטי שונה, בזמנים שונים במהלך פיתוח, ולאחר הפרעות סביבתיות. זה יכול להיות שימושי גם בבדיקה פתולוגית של הצטברות CSF. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לנתח את התפקיד והרגולציה של חדירות במהלך פיתוח ומחלה.

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium at JoVE.com

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במהלך פיתוח ומחלה.

Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

an-assay-for-permeability-of-the-zebrafish-embryonic-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  Massachusetts Institute of Technology. אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במה...

Video: An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

ניקוז ידני של חדרי המוח העוברי דג הזברה

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.