החוקרים מכירים בתמיכה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה SI-1281/4-1 וBIOSS מהפקולטה לרפואה באוניברסיטת פרייבורג (לCS).

1. הכנת הנוגדנים פתוגניים הערה: טיהור וריכוז של הנוגדנים צריכות להתבצע באותו היום, כפי שנוגדנים אינם להיות מאוחסנים ב0.1 מ &#39;גליצין pH 2.5-3 (חיץ elution) במשך הלילה (ON). טיהור זיקה של IgG: 25 מ&quot;ל של שימוש בסרום ארנבת חיסוני: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר סרום הארנב על ב 4 ° C, לערבב אותו עם 01:01 1xPBS (ריצת חיץ) וחובצה את זה ב1260 XG למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לחלופין, צעד סינון עם מסנן נייר יכול להיכלל לאחר צנטריפוגה במקרה הסרום הוא שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לשטוף את חלבון G מטריצה ​​מלאת עמודה עם 10 כרכי מיטה (נפח המיטה = נפח מטריצה) של 1XPBS (ריצת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מדוללים ומסונן סרום לעמודה ודגירה 1 שעה על הפלטפורמה מתנדנדת בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הזרימה באמצעות (FT) בצינור 50 מיליליטר Flacon. אל תמחק אותו עד הריכוזוכייל של המטוהרים IgG ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מטריצה ​​עם 5 כרכי מיטה של ​​1XPBS ובינתיים להכין 50 צינורות מ&quot;ל פלקון לאיסוף שבריר IgG eluted. חיץ פיפטה 1 מיליליטר חומציות נטרול: 1 ז TRIS pH 10 בכל צינור (שיעור של חיץ 1:20 TRIS יחסית לכמות eluate שתיגבה בדרך אחרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חיץ 100-150 מ&quot;ל elution: 0.1 מ &#39;גליצין pH 2.5-3 לעמודה ולאסוף חלק 50 מ&quot;ל (הים). הפוך את צינור 2-3x, למדוד את רמת החומציות ולהוסיף חיץ נטרול עד שהגעת לרמת החומציות 7.2-7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כמה טיפין של eluate IgG ובאמצעות חיץ elution כetalon למדוד OD ב 280 ננומטר. אם OD הוא &lt;איסוף עצירה 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחדש מטריצת G חלבון ולאחסן אותו בהתאם להוראות היצרן. </li></ol> ריכוזיות לפי ultrafiltration עם צינורות Amicon: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף Amicon Ultra (15 מ&quot;ל / 30KDa) צינורות ultrafiltration עם 1XPBS ידי צנטריפוגה דקות 15-20ב3220 XG ב 4 ° C. השלך את FT מAmicon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את Amicons עם 15 מ&quot;ל של שבריר IgG eluted וצנטריפוגות ל25-30 דקות ב 3220 XG ו 4 מעלות צלזיוס; זמן צנטריפוגה תמיד תלוי בתכולת החלבון של eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך FT ולחזור ultrafiltration עד שאין לך חלק eluted עזב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף IgG המרוכז בהרחבה, פעמים, עם 25-30 דקות 1XPBS ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הפתרון &quot;הדביק&quot;, הצהבהב נוגדנים מAmicon המסנן בנפח סופי של 1,500-2,000 μl של 1XPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז אמצעי להתכונן IgG באמצעות ספקטרופוטומטר או NanoDrop: קונצרט כלשהו. (מ&quot;ג / מ&quot;ל) = A (280 ננומטר) X פקטור דילול / 1,4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולאחסן את Amicons בעקבות הוראות היצרן. </li></ol> 2. הזרקת קולגן VII הספציפי IgG לעכברים לפני שתתחיל בהליך הניסוי בפועל, לוודא שהפר הניסיוניtocol כתוב ואת כל החומרים מוכנים לניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את גיליונות נתונים עבור ניקוד המחלה, ELISAs, immunofluorescence (IF) הניתוח וmyeloperoxidase (MPO) assay 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תייג את צינורות דם ואיברים, cryomolds כמו גם היסטולוגיה העיבוד והטבעת קלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני הנוגדנים צריכים להיות מוכנים טריים או מופשר ממניות ומאופיינות ביחס לתגובתיות שלהם (אם כייל ידי מיקרוסקופי ו / או ELISA). פתרון הנוגדן המסונן סטרילי צריך להיות מדולל ב PBS באופן שהמינון הנדרש להזרקה נע בין 250-1000 μl. ודא שיש לך מספיק נוגדנים כדי לבצע את הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי קרישה: הפרין 20 U / מ&quot;ל ​​ו -8.7 מ&quot;ג / המ&quot;ל קטמין / תערובת 1.3 מ&quot;ג / מיליליטר xylazine להרדמה. כאשר להקריב את העכברים שכותרת צינורות עם פורמלדהיד 3.7% מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח (אזמל, מספריים, צבע עדין והכמתמ&quot;כforcipes ED) ולהכין את מזרקים (מזרקי אינסולין, 1 ו 2 מזרקי מ&quot;ל), מחטים, מצלמה דיגיטלית וכרטיס זיכרון נוסף. </li></ol> הערה: בצע את כל ההליכים על עכברים מסוממים קטמין / או xylazine isoflurane isoflurane הוא האופציה המועדפת להרדמת בדיקות העור היומיות, כמו עכברים להתאושש במהירות.. עם זאת, בעת צילום תמונות, קטמין 87 מ&quot;ג / ק&quot;ג וxylazine 13 מ&quot;ג / ק&quot;ג בדרך כלל מוזרקת מתחת לעור. להמתת חסד מינון קטמין / xylazine גדל ל קטמין 130 מ&quot;ג / ק&quot;ג וxylazine 20 מ&quot;ג / ק&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את החיות כבר סומנו למצבו הבריאותי, העור והמראה הכללי שלהם פרווה, לשקול אותם ולמדוד את עובי האוזן שלהם (תמיד מקל על אותה האוזן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשמת ערכים ושינויים בגיליון ההערכה הקלינית שנצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20-30 μl (2-3 טיפין) דם מוריד הזנב במזרק המכיל את אותו הנפח של קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפרווה ועור באמצעות אתנול 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון הנוגדן תת עורי לחלק האחורי באמצעות מזרק אינסולין. (עבור אתרים מסוימים (לדוגמה, האוזניים) רק בנפחים קטנים (10-50 μl) הם ריאליים כדי להיות מוזרק.) </li></ol> זריקות יש לחזור כל יום שני, 4 פעמים. BALB / ג וC57BL6 עכברים של משקל גוף של כ 20 גרם להתחיל לפתח את מחל 3-4 ימים לאחר שהממשל הראשון של 400-500 עד 750 מיקרוגרם נוגדנים עצמיים / g משקל גוף / הזרקה. כשסיים את הניסוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים את העכברים תחת הרדמה עמוקה על ידי הזרקת 130 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 20 מ&quot;ג / ק&quot;ג תת עורי קטמין / xylazine, לגרום לדימום המחודש מהווריד הנבוב האחורית ולחתוך את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף איברים / דגימות רקמות כגון עור: זנבות, אוזן, דם וושט ולשים אותם בצינורות שכותרתו בעבר ופורמלדהיד% PBS או 3.7 מלאים. </li></ol> כאשר חוזריםמעבדה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדם ב1200 XG, 10 דקות ב RT לפלזמה נפרדת, להעביר את הפלזמה לצינורות שכותרתו כראוי ולאחסן אותם בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ עור הביופסיה בטמפרטורה בינונית Cut אופטימלי באמצעות cryomolds, כראוי למותג, ולאחסן אותם ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את דגימות הרקמה שנועדו ליסטולוגיה בתבניות הטבעת התוויות ולשמור אותם בפורמלין 3.7% עד הטבעת פרפין. </li></ol> 3. הערכה קלינית של חומרת מחלה עכברים יש לבחון מדי יום לנגעים בעור ובריריות והממצאים צריכים להיות מוקלטים באמצעות טפסים מתאימים. הקריטריונים להמתת החסד מוקדמת הם נגעי עור המשפיעים יותר, כי 20% משטח הגוף וירידה במשקל של 5-10% ממשקל הגוף בשלושה ימים רצופים, ספירה לציון מחלה של 5 (טבלה 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על בטנו. התחל עם אזור הראש, כלומר עם הזכותאוזן ולבדוק לשלפוחיות, שחיקות, קרום בפנימי, כמו גם בצד החיצוני. תמשיך באותה הדרך עם אוזן השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיני ימין ושמאל נשלטות סימנים של אודם, התקרחות, שחיקה ו / או קרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור חוטם מצח והם עברו דרך הבאה, ממשיכים בחלק הגחוני של החוטם, בשפות ובקרום הרירי של הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הרגל הימנית הקדמית החל מהכפה, נע כלפי מעלה; לעבור לרגל הקדמית השמאלית. הליך אותו דבר עם רגליו האחוריות הימניות ושמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צחצח דרך הפרווה בצוואר ובגב האזור עם מלקחי נקודה עדינים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפך את העכבר על גבה ולבדוק את חלק הגחון, כמו גם את צדדי הגחון של גפיים באותו אופן כמו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של חלקי גוף הרלוונטיים שבו העכברים לפתח מחלה. יש לשים לב לכמות והאיכות של תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ציוני מחלה הקליניות. </li></ol> 4. בדיקת דגימות עור ופלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכון, חנות, ו / או לעבד את כל הרקמות שנאספו על פי התכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקי רקמה קפוא לאם זיהוי של נוגדני ארנבת ורכיבי מערכה משלימה עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תכולת החלבון ואנזים השונה (בדיקת MPO) של תמציות איברי רקמות ו / או קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף פרפין מוטבע רקמות וכתם עם H &amp; E כדי להמחיש את מידת ניזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הפלזמה על ידי ELISA, immunoblot. </li></ol>

<ol>
	<li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen.">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li><li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li><li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K&#946;+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes.">PI3K&#946; plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li><li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage.">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li><li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita.">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li><li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li><li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis.">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li><li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme.">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li><li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., W&#246;lfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc&#947;-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes,+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice.">The flavonoid luteolin inhibits Fc&#947;-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066 (2012).</li><li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease,+bullous+pemphigoid,+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen,+BP180.">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li><li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease.">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li><li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+passive+transfer+from+man+to+mouse.">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li><li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+(Witebsky's+postulates+revisited.">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li><li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li><li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Br&#246;cker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin.">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li><li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice.">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li><li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים לחיות ניסוי היא גישה עיקרית להוכחת פתוגניות 7, -12. מודלים של בעלי חיים שהושגו באמצעות שיטה זו, בנוסף להיות עדות העקיפה לאוטואימוניות 13, לאפשר את חקירתו של שלב efferent של המנגנון הפתוגני. מודל ההעברה הפסיבית של נוגדני עור המושר?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אנטיגן רקומביננטי </td><td></td><td></td><td> קידוד פלסמידים לצורות רקומביננטי של קולגן VII העכברי זמין המחבר המקביל. </td></tr><tr><td> סרום ארנבת חיסוני </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> היו לנו ארנבים לבנים בניו זילנד חוסנו 200 מיקרוגרם של אנטיגן, 3 פעמים במרווחים של שבועות 2. לשם כך יש לנו להשתמש בשירותיו של Eurogentec SA, בלגיה. </td></tr><tr><td> החלבון G agarose </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> עכברי BALB / ג </td><td> צ&#39;ארלס ריבר מעבדות </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> מתחם אוקטובר, רקמות-Tek </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4583 </td><td> אוקטובר, טמפרטורה אופטימלית חיתוך </td></tr><tr><td> Cryomold הסטנדרטי </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 מ&quot;מ × 20 מ&quot;מ × 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Cryomold ביניים </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 מ&quot;מ × 15 מ&quot;מ × 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> ר &#39;Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> עיבוד היסטולוגיה וקלטות הטבעה </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe שוורץ </td><td> ח Hauptnerund &amp; ריצ&#39;רד Herberholz GmbH &amp; Co KG </td><td> 71492000 </td><td> קעקוע דבק </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO א Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> קעקוע מכשיר </td></tr><tr><td> הפארין </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co </td><td> 7692.1 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד 37% </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין hydrochloride </td><td> סיגמה אולדריץ Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> hydrochloride Xylazine </td><td> סיגמה אולדריץ Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> ניקון </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק מונע יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (מפיץ) </td></tr><tr><td> גיליון ניקוד מחלה </td><td></td><td></td><td> הדוגמא enclosed </td></tr></tbody></table>

granulocyte-dependent autoantibody-induced skin blistering

תופעות אוטואימוניות להתרחש אצל אנשים בריאים, אבל כאשר סובלנות עצמית נכשלה, התגובה אוטואימונית עלולה לגרום לפתולוגיה ספציפית. לדברי Witebsky של נחות היסוד, אחד מהקריטריונים באבחון מחלה אוטואימונית כהיא השעתוק של המחלה בחיות מעבדה על ידי ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים. לepidermolysis ולוזה acquisita (EBA), מחל אוטואימונית איבר ספציפי לאבטיפוס של קרום עור ורירי, מספר מודלים ניסיוניים שהוקמו לאחרונה. במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם 1 EBA. מחלה נפוצה במלוא מובן מילה נתפסת בדרך כלל 5-6 ימים לאחר הזריקה הראשונה והיקף המחלה בקורלציה עם המינון של c מנוהלollagen השביעי ספציפי IgG. הניזק לרקמות (היווצרות שלפוחית) בEBA הניסיוני בהתאם לגיוס וההפעלה של גרנולוציטים ידי נוגדנים עצמיים רקמות בכריכת 2, -4. לכן, מודל זה מאפשר לנתיחה של המסלול הדלקתי granulocyte התלוי המעורבים בניזק לרקמה אוטואימונית, כמודל מתרבה רק שלב T תא העצמאי של התגובה אוטואימונית efferent. יתר על כן, הערך שלו מודגש על ידי מספר המחקרים הממחישים את פוטנציאל שלפוחית ​​וישכנע של נוגדנים עצמיים בגוף חי וחוקרים את מנגנון היווצרות הכיב בEBA 1,3, -6. לבסוף, מודל זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של טיפולים חדשים נגד הדלקת במחל autoantibody מושרות. בסך הכל, מודל חית ההעברה הפסיבית של EBA הוא מודל מחלה נגישה ומאלף ויסייע לחוקרים לנתח לא רק פתוגנזה EBA אבל לענות בסיסי ביולוגי וקלינישאלות אוטואימוניות חיוניות.

ההעברה הפסיבית של אנטיגן ספציפיות נוגדני תוצאות במחלה מלאת מפוצץ בעכברים, המזכירים ברמות קליניות, היסטולוגית וimmunopathological EBA האנושי. שלפוחיות, קרומיים, השחיקות וההתקרחות יתפתחו באוזניים, הזרבובית, הרגליים, כפות הרגליים, גב ומסביב לעיניים של העכברים. הסימנים הקליניים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering at JoVE.com

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם epidermolysis ולוזה acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to ...

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Views.  University of Freiburg. במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם epidermolysis ולוזה acquisita (EBA) 1.

Video: Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

השתלת עור בעובי מלא Murine

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...