אנו מודים לקסנדרה בראיינט לביצוע ניסוי IIF וקרול בוכנר לבדיקת המומחה הטכנית שלה.

1. לדוגמא הכנה ותשתית לבחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסירו ריאגנטים מהאריזה ולאפשר לכל פריט כדי להגיע לטמפרטורת חדר. הכן את חומרים כימיים ולדלל סרה מטופל בהתאם להוספת הכיוון. הערה: שקופיות NOVA לייט המינימרקטים וניתן לשלב בקלות לתוך מערכות אוטומטיות בשיתוף עם LIS מערכת מידע המעבדה. הליך זה מדגים עיבוד שקופיות ידני; מעבדות תפוקה גבוהות, לעומת זאת, יכולות לבחור ציוד לעיבוד שקופיות אוטומטי. </li></ol> 2. תוספת של בקרות ודוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 1 טיפה של בקרה חיובית ו1 טיפה של ביקורת שלילית לבארות שקופיות המתאימות. פיפטה 20-25 μl של סרום מטופל מדולל לבארות הנותרות. לעבד שקופית אחת בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף (ים) במכל מכתים עם מגבת נייר לחה בתחתית. כסה את המכל ודגירת השקופיות (ות) עבור 30 דקות. הערה: תנאי הלחות יהיולמנוע את המצע מהתייבשות. ייבוש של הבארות עלול לגרום להכתמת artifactual. במהלך תקופת דגירה זה, הנוגדנים נגד הגרעין בסרום של המטופל יהיו לאגד אנטיגנים של התאים המתוקנות על גבי היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את הסרום באמצעות זרם עדין של חיץ לשטוף. על מנת להימנע מפגיעה במצע ולמנוע מעל צולב של דגימות בין בארות, זווית השקופית מעט כדי להימנע מלכוון את הזרם ישירות על הבארות. הקש את חיץ לשטוף עודף ובמקום להחליק לתוך צנצנת המכילה Coplin לשטוף חיץ למשך כ 5 דקות. </li></ol> 3. תוספת של פלורסנט המצומד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד אחד, להסיר את השקופיות מלשטוף חיץ ולטפוח בעדינות כדי להסיר את החיץ לשטוף העודף. החל 1 טיפה של המצומד פלורסנט (שכותרתו FITC IgG אנטי אנושי) על גבי כל טוב. דגירה השקופיות במשך 30 דקות במכל humidified, ולהיות בטוח שיחליף את הצביעהכיסוי מיכל. הערה: לבדיקת ANA, השימוש בהמצומד ספציפי IgG Fc מומלץ. המצומד הוא רגיש לאור, והכיסוי יגן על השקופיות מחשיפה לאור, בנוסף לשמירה על סביבת humidified. במהלך תקופה זו דגירה, המצומד יהיה לאגד נוגדנים אנטי הגרעיניים של החולה שחייבים אנטיגנים התא. המצומד זה מחייב תוצאות בנוכחות הקרינה בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ולשטוף את השקופיות כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על מגבת נייר ולהחיל הרכבה בינונית בקו רציף לקצה התחתון של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שקופית מלשטוף חיץ ולנצל את השקופית בעדינות כדי להסיר את החיץ לשטוף העודף. נוגע בקצה התחתון של השקופית לקצה coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוריד את השקופיות על coverslip בצורה כזאת, כי המדיום גובר על coverslip זורם לקצה העליון של השקופית ללא היווצרות בועות אוויר. הערה: Coverslipping, כולל שימוש בכמות האופטימלית של הרכבה בינונית, הוא טכניקה שדורשת תרגול כדי מושלמות. </li></ol> 4. זיהוי של תוצאות חיוביות ושליליות פרשנות ידנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בשקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הממוקם בחדר חשוך. לבצע סריקה של כל היטב עם מטרת 20X או 25X להעריך חלוקת תא ואחידות של הקרינה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לאובייקטיבי 40X כדי להפוך את הפרשנות הסופית לגבי חיוביות ודפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל על הבקרות החיוביות ושליליות. חיוביות כיתה באמצעות סולם דירוג תגובתיות מ1 + עד 4 +. הערה: הבקרה השלילית עשויה שלא להופיע חשוכה לגמרי, אבל לעתים קרובות להציג הקרינה ספציפיות ברמה הנמוכה. הביקורת החיובית תציג פלואורסצנטי ירוק תפוח בהיר בגרעין (איור 1). </li></ol> פרשנות אוטומטית הערה: בadditiעל פרשנות ידנית, עומס ושקופיות סריקה על ידי NOVA צפה האוטומטי הקרינה מיקרוסקופ או מכשיר הדמיה אחר אוטומטי דיגיטלי; אין חדר חושך הוא הכרחי. לאחר יצירת פרויקט על ידי בחירת סוג השקופיות המתאימה, המכשיר רוכש וחנויות תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של תאים בכל טוב. בנוסף, NOVA צפה מודד את עוצמת אור ניאון, ומסווג את תוצאות כחיוביות או שלילי, ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. תמונות שנצפו על ידי המפעיל על צג מחשב ברזולוציה גבוהה, המאפשרות פרשנות סופית, תיקון ואישור של NOVA צפה בתוצאה. דוחות ניתן להפיק בתוצאות אישרו. מיקרוסקופ דיגיטלי יש להשתמש בשילוב עם טכנאי מעבדה מנוסה כפי שהוא נועד לסייע בפרשנות של תוצאות.

<ol>
	<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Tan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+nuclear+antigens+(ANA):+Their+immunobiology+and+medicine.">Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.</a> Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).</li><li>Sack, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+detection+using+indirect+immunofluorescence+on+HEp-2+cells.">Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells.</a> Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells+and+anti-DFS70+antibodies+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+significance+of+the+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern+on+HEp-2+cells+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+phenotypes+of+patients+with+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+a+routine+ANA+referral+cohort.">Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort.</a> Clin Dev Immunol. , (2013).</li><li>Mariz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody+positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Muro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+as+an+autoantigen.">The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen.</a> J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).</li><li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block.">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li><li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies.">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li><li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis/scleroderma+overlap+syndrome.">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li><li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

המחברים גבריאלה Lakos, קסנדרה ראיינט, קרול בוכנר, ואנה אסלאמי הם עובדים של אבחון INOVA.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

נוגדן antinuclear הטווח (ANA) מתאר מגוון רחב של נוגדנים עצמיים המגיבים עם מרכיבים של גרעין תא כולל DNA, חלבונים וribonucleoproteins 1, 2. תא הפ-2, מערך חלבוני יליד עם מאות אנטיגנים, מספק מצע אידיאלי לצורך זיהוי של 1 ANA. זיהוי של ANA בסרום אנושי הוא כלי חשוב להקרנת מחלות רקמת חיבור, וIIF הוא שיטת ההתייחסות לANA בדיקת 1. לאחרונה, IIF על הפ-2 תאים הוחלף בכמה מעבדות בimmunoassays אנטיגן ספציפי ושיטות זמנית. בשל חשש מתוצאות שליליות כוזבות וחוסר השקיפות לרופאים, הקולג&#39; האמריקאי לראומטולוגיה הקים כוח המשימה שהגיע למסקנה כי IIF באמצעות הפ-2 תאים צריך להיות &quot;תקן זהב&quot; לANA הקרנת 1. בשל האופי הסובייקטיבי של הקרנת ANA, איכות הפ-2 תאים היא בtegral לדיווח מדויק ובטוח בתוצאות. הנוכחות של מספר גבוה של תאי mitotic, מורפולוגיה אופטימלית תא, confluency מספיק, וביטוי של אנטיגנים רלוונטיים הם חשובים במיוחד. זיהוי תבניות IIF משמש ככלי חשוב כדי לסייע באבחון חולה. הבנת המשמעות של דפוסים שונים מאפשרת לרופאים ואנשי מעבדה לביצוע בדיקות המעקב המתאימות כדי לאשר את האבחנה. לדוגמא, דפוס ANA הומוגנית יכול להתרחש בנוכחות אנטי dsDNA או נוגדני הכרומטין, ועשוי להיות קשור עם זאבת אדמנתית מערכתית (לופוס) 3. מהצד השני, יש לו לאחרונה תואר כי הדפוס שנקרא צפוף הקנס המנומר (DFS), כי הוא נראה לרוב בעד 12% מהדגימות שגרתיות, יש בעיקר מזוהה עם נוגדנים נגד DFS70. נוגדנים עצמיים אלה, כאשר נמצאו בבידוד (ללא ANA ספציפי למחלה אחרת) אינם משויכים מחלות פרקים אוטואימוניות מערכתיות &lt;sup&gt; 4-9. בדיקות ובכך מאשרות לנוגדנים נגד DFS70 יכולות לעזור להפחית את בדיקות רפלקס מיותרות, מציעות חיסכון בעלויות ניכרות, ולהקל על חרדת מטופל. בהתחשב בכך שIIF הוא המתודולוגיה הקרנת השורה הראשונה כדי לזהות נוגדנים עצמיים, זה הוא בעל חשיבות עליונה שהמשתמש מבין איך הבחירה של חומרים כימיים ומצעי רקמה יכולה להשפיע על תוצאות. מאז טכניקת IIF היא מטבעו סובייקטיבי, חשוב שהחומרים כימיים המשמשים לספק התוצאות באיכות הגבוהות ביותר. מטרה זו של פרוטוקול וידאו זה היא קראתי למשתמש את הצעדים הנכונים הדרושים כדי לבצע את שיטת IIF, דפוסים הנפוצים הקשורות ANA, ולהציג את הפיתוחים חדשים אשר יכול לייעל את זרימת העבודה במעבדה ולתקנן תוצאות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

המכללה להצהרת עמדת ראומטולוגיה על בדיקות ANA האמריקנית קובעת את השימוש בIIF כשיטת תקן זהב עבור ANA הקרנת 1. למרות IIF הוא מבחן מיון מצוין בידיים של מומחה, הקשיים הטכניים של עיבוד וקריאת IIF מחליק - כגון עיבוד העבודה אינטנסיבי שקופיות, קריאה ידנית, את הצורך במנוסה, אנשי טכנולוגיה מיומנים ושימוש בחדר חשוך - להפוך את שיטת IIF קשה להתאים את זרימת העבודה של מעבדות מודרניות ואוטומטיות. הצעד הראשון ומכריע לקראת הקרנת ANA באיכות גבוהה הוא עיבוד שקופיות זהיר. הליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, ודורש הבנה מלאה של התהליך, כמו גם תשומת לב לפרטים וניסיון. קריאת שקופיות מתבצעת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחדרים חשוכים, והוא נעשה על ידי אנשי טכנולוגיה מיומנים שמכירים את הדפוסים השונים, בהקשר של מחזור התאוהמורפולוגיה של שלבי ביניים וחלוקת תאים. ובלבד שIIF הוא כלי מיון הקו הראשונים לסארטי, הבנת הצעדים לביצוע בטכניקה זו בצורה נכונה הוא קריטי. לאחרונה, מערכות הדמיה דיגיטליות פותחו לקריאה האוטומטית של שקופיות IIF. מערכות אלו, כמו NOVA צפה האוטומטי פלורסנט מיקרוסקופ, נועדו לייעל את זרימת העבודה IIF השגרתית. NOVA צפה רוכש וחנויות תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של הבארות, ובכך מפריד את רכישת תמונה מפרשנות; הם צפו תמונות מתפרשים על צגי מחשב ברזולוציה גבוהה. זה מאחסן את תמונות לשימוש עתידי ותומך בפרשנותו של המפעיל על ידי מתן נתונים עוצמת אור ניאון על התמונות. כמו כן מקדם מסווג תוצאות כחיוביות או שלילי, ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. לסיכום, זה מבטל את הצורך בחדר חושך, ולאוטומטי ומייעל את readi IIFng / פרשנות זרימת עבודה. והכי חשוב, הוא מגביר את עקביות בין קוראים וקריאה. יתר על כן, עם השימוש בשקופיות המינימרקטים, שגיאות תעתיק בוטלו על ידי מתן עקיבות מדגם וזיהוי מטופל חיובי. התוצאה היא שלמות מוגברת מטופל נתונים ובטיחות. המטרה הכללית של הסרטון הזה היא מדגים את הליך IIF, לרבות עיבוד שקופיות, זיהוי של דפוסי IIF משותפים, וכניסתה של התקדמות החדשה כדי לפשט ולהתאים את הטכניקה הזאת.

בעת הערכת תוצאות מכתים התא להפ-2, חמישה דפוסים גרעיניים עיקריים הם נפוץ ביותר שדווחו: הומוגנית, מנומר, centromere, nucleolar, ונקודות גרעיניות. דפוסים אלה הם התוצאה של הנוגדן מחייב למרכיבים ספציפיים של הגרעין. למרות בדיקות ANA היא ספציפיות למבנים גרעיניים, דפוסי cytoplasmic קשורים עם נוגדנים עצמיים כנגד מבני cytoplasmic יכולים גם להיות שנצפו. במקרים מסוימים, כמה נוגדנים עצמיים עשויים להיות נוכחים במדגם, והתמונה עשויה להופיע כדפוס מעורב. יש אחרים, פחות נצפה לעתים קרובות, ולעתים קרובות דפוסים ספציפיים מחזור התא שיכול להיות מזוהה על ידי שיטת IIF; לאחרונה, דפוס שנקרא צפוף קנס מנומר עם משמעות קלינית מיוחדת שתואר בחלק סרה חיובית ANA. תבנית אחידה לזהות דפוס הומוגנית, לסרוק היטב ולזהות mitotic או מפרידתאים. הכרומטין המרוכז של תאי mitotic (איור 2, חץ כתום) מפגין הקרינה מוצקה, אחידה אשר לעתים קרובות בולטת יותר מאשר בתא מנוחת nuclei.In הדפוס הומוגנית, אחיד תערוכת תאי מנוחה, הקרינה מפוזרת של כל הגרעין (איור 2, חץ לבן). דפוס אופייני זה הוא לעתים קרובות התוצאה של נוגדנים נגד dsDNA 10. תבנית מנומרת בדפוס המנומר הגס, תאי mitotic להראות שום צביעה של אזורי כרומוזומים תמצית (איור 3, חץ כתום). תאי המנוחה תערוכת הקרינה גרעינית בכל רחבי הגרעין. שנקר הגרעיני יכול להיות מוגדר כגס או עדין. הדפוס שנקר גס הוא לעתים קרובות התוצאה של אנטי-SM ו11 אנטי RNP. בדפוס המנומר בסדר, תאי המנוחה להראות שנקרו קנס או מפוזר לאורך כל הגרעינים, בדרך כלל בד האחידistribution (איור 4, חץ לבן). הדפוס המנומר הקנס הוא לעתים קרובות התוצאה של אנטי SSAand אנטי SSB 12. תבנית פיין המנומרת צפופה עכשיו זה הכיר בכך שהדפוס המנומר בסדר הצפוף (DFS) הוא נפוץ בבדיקה שגרתית, וככל 12% מהדגימות חיוביים לנוגדנים עצמיים נגד DFS70. עם זאת, נוגדנים עצמיים אלה, כאשר נמצאו בבידוד, אינם קשורים עם מחלות פרקים אוטואימוניות מערכתיות 4 -6. נוגדנים אלה הם נפוצים אצל אנשים וחולי נושאי מחלות שאינן קשורות לסארטי 6 בריאים. בדיקות מאשרות לנוגדנים נגד DFS70 יכולות לעזור להפחית את בדיקות רפלקס מיותרות, מציעות חיסכון בעלויות ניכרות, ולהקל על חרדת מטופל. מאז דפוס DFS קשה לזהות וחיוביות ANA יכולה לגרום לחרדה לחולים ורופאים כאחד, מומלץ מאוד לבצע בדיקה מאשרות לאחר על זהות<html> fying דפוס רמיזות של נוגדנים נגד DFS70 להבהיר את המשמעות הקלינית של ANA positivty 5,6. בדפוס זה, תאי mitotic (איור 5, חץ כתום) מראים כתמים מנומרים חיוביים של הכרומטין metaphase, בזמן המנוחה גרעין תא (איור 5, חץ לבן) תערוכת כתמים עדינים מפוזרים באופן אחיד בכל הגרעין. תבנית centromere כדי לזהות את דפוס centromere, לסרוק את הבארות ולזהות mitotic או תאים מתחלקים. בתאי mitotic (איור 6, חץ כתום), הכתמים בדידים אלה הופכים קשורים באופן הדוק במה שלעתים קרובות מתואר כ&quot; בר metaphase &quot;. בדפוס centromere, תאים נחים (איור 6, חץ לבן) מראים כ 40-60 כתמים בדידים מופצים ברחבי הגרעינים. דפוס centromere הוא התוצאה של אנטי CENP A, B, C נוגדנים 13. &quot;&gt; תבנית nucleolar צעד כמה דפוסי nucleolar קשורים לצביעה מפוזרת cytoplasmic בתאי mitotic (איור 7, חץ כתום) ואזור כרומוזומליות שלילי, ואילו דפוסי nucleolear אחרים מציגים מכתים חיובי של האזור בכרומוזומים. דפוס nucleolar קשור לצביעה אחידה או מנומרת של nucleoli (איור 7, חץ לבן), יחד עם מנומר חלש או צביעה הומוגנית של nucleoplasm. דפוסים אלו קשורים עם אנטי RNA פולימראז III, אנטי fibrillarin, anti-Th/To וanti-PM/Scl נוגדני 14,15. תבנית הגרעינית דוט דפוס הנקודה הגרעינית קשור לתאי mitotic metaphase שליליים (איור 8, חץ כתום) ועם כמה כתמים בדידים בגרעין תא מנוחה (איור 8, חץ לבן). דפוס אופייני זה הוא לעתים קרובות התוצאה של SP-100, PML, או נוגדנים עצמיים קולין P80. נוגדנים אלה הם כמו<html> sociated עם שחמת מרה ראשית והפטיטיס אוטואימונית 16. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . איור 1 בקרה שלילית (משמאל): תאים להציג נמוכה ברמת הקרינה שאינה ספציפית, אבל לא מכתים גרעיני ספציפי שליטה חיובית (מימין):. תאים להציג הקרינה גרעינית ירוקה תפוח. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. דפוס הומוגנית. תאי mitotic (orangearrow) מראה הקרינה מוצקה. תאי מנוחה להראות אפילו, מכתים מפוזר (whitearrow). <html> &quot;= רוחב&quot; 500 &quot;/&gt; איור 3. מנומר גס תבנית. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים שלילי. תאי מנוחה מראים כתם ברור מנומר (חץ לבן). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. דפוס פיין מנומר. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים שלילי. תאי מנוחה להראות מכתים מובחן בסדר מנומר (חץ לבן). <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. דפוס צפוף קנס מנומר. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים מוצק גרגירים עדין. תאי מנוחה מראים כתם יפה מאוד, מפוזר מנומר (whitearrow). ogether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig6highres.jpg" width="500" /> אחיד איור 6. דפוס centromere. תאי mitotic (orangearrow) מופע, כתמים בדידים. נח תאים (whitearrow) מראה 40-60 כתמים לגרעין תא נפרדים. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. דפוס nucleolar. תאי mitotic (orangearrow) מופיע צבירים גדולים כמו של מכתים פרטני. הקרינה נחה תא nucleishows בnucleoli (whitearrow). <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. דפוס נקודות גרעיניות. תאי mitotic (orangearrow) יופיע שלילי. תאי מנוחה להראות כמה discrכתמי ete בגרעין (whitearrow). בנוסף, בדפוס נקודות nucelar יכולים לדור בכפיפה אחת עם מכתים cytoplasmic קשור עם נוגדנים עצמיים לאנטיגנים של המיטוכונדריה (חץ אדום).

Watch this Scientific Journal Video about Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells at JoVE.com

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

מבחני immunofluorescent העקיף (IIF) באופן מסורתי המשמשים לזיהוי של נוגדני antinuclear (ANA) בסרום אדם. הנוכחות של נוגדנים אלה יכול לסייע באבחון של מחלות מערכתיות אוטואימוניות שגרוניות (סארטי). פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ביעילות את טכניקת IIF לזהות במדויק נוגדנים עצמיים אלה.

אנטי גרעיני נוגדן הקרנה באמצעות הפ-2 תאים

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

133.8K Views.  INOVA Diagnostics, Inc..  מבחני immunofluorescent העקיף (IIF) באופן מסורתי המשמשים לזיהוי של נוגדני antinuclear (ANA) בסרום אדם. הנוכחות של נוגדנים אלה יכול לסייע באבחון של מחלות מערכתיות אוטואימוניות שגרוניות (סארטי). פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ביעילות את טכניקת IIF לזהות במדויק נוג...

Video: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...