Die Autoren danken für die Unterstützung durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 und BIOSS von der Medizinischen Fakultät der Universität Freiburg (CS).

Ein. Vorbereitung von pathogenen Antikörper Anmerkung: Die Reinigung und die Konzentration der Antikörper sollten am selben Tag durchgeführt werden, wie Antikörper nicht in 0,1 M Glycin pH 2,5-3 (Elutionspuffer) über Nacht (ON) gespeichert werden. Affinitätsreinigung von IgG: Verwenden Sie 25 ml des Immunsystems Kaninchenserum: <ol><li> Auftauen Kaninchenserum ON bei 4 ° C, mischen Sie es 1:1 mit 1xPBS (Laufpuffer) und zentrifugieren es bei 1260 xg für 10 min bei 20 ° C. Optional kann eine Filterung Schritt mit Filterpapier nach Zentrifugation im Falle das Serum Fettsäuren von Bedeutung sind. </li><li> Inzwischen, waschen das Protein G-Matrix gefüllte Säule mit 10 Bettvolumina (Bettvolumen = Matrix Volumen) 1XPBS (Laufpuffer). </li><li> Übernehmen Sie die verdünnt und filtriert Serum auf die Säule pipettieren und 1 Std. auf dem Schüttler bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Sammeln Sie die Flow-Through (FT) in einem 50 ml Flacon Röhre. Nicht wegwerfen es bis die Konzentrationund Titer des gereinigten IgG ist bekannt. </li><li> Waschen Sie die Matrix mit 5 Bettvolumina 1XPBS und in der Zwischenzeit bereiten 50 ml Falcon-Röhrchen zum Auffangen des eluierte IgG-Fraktion. Pipette 1 ml pH neutralisierenden Puffer: 1 M Tris pH 10 in jedem Röhrchen (sonst der Anteil von 1:20 Trispuffer bezogen auf die Menge der zu sammelnden Eluat). </li><li> Anwenden 100-150 ml Elutionspuffer: 0,1 M Glycin, pH 2,5 bis 3 auf die Säule und Sammeln 50 ml Fraktion (en). Klappen Sie den Schlauch 2-3x, messen Sie den pH-Wert und fügen neutralisierende Puffer, bis Sie den pH 7,2-7,4 erreicht haben. </li><li> Sammeln einiger Tropfen IgG Eluat und mit dem Elutionspuffer als Etalon messen die OD bei 280 nm auf. Wenn die OD &lt;0,1 Stopp sammeln. </li><li> Generieren Sie das Protein G-Matrix und speichern Sie es nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Konzentration durch Ultrafiltration mit Amicon Röhren: <ol><li> Waschen Amicon Ultra (15 ml / 30 kDa) Ultrafiltration Rohre mit 1XPBS durch Zentrifugieren 15-20 minbei 3220 × g bei 4 ° C. Entsorgen Sie die FT von der Amicon. </li><li> Füllen Sie die Amicons mit 15 ml eluierte IgG-Fraktion und Zentrifuge für 25-30 min bei 3.220 xg und 4 ° C; Zentrifugationszeit hängt immer von der Proteingehalt des Eluats. </li><li> Entsorgen FT und wiederholen Ultrafiltration bis Sie keine eluierte Fraktion verlassen haben. </li><li> Waschen Sie die konzentrierte IgG ausgiebig, zweimal mit 1XPBS 25-30 min durch Zentrifugation. </li><li> Sammeln das &quot;klebrige&quot;, gelbliche Antikörperlösung aus dem Amicon-Filter in einem Endvolumen von 1.500-2.000 ul 1XPBS. </li><li> Measure Konzentration von IgG-Präparation mit einem Spektralphotometer oder NanoDrop: Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x Verdünnungsfaktor / 1,4 </li><li> Waschen und speichern Sie die Amicons nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Injektion von Collagen VII-spezifischen IgG in Mäuse Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung, stellen Sie sicher, dass die experimentelle proProtokoll geschrieben wird und alle Materialien werden für das Experiment vorbereitet. <ol><li> Bereiten Sie die Datenblätter für die Krankheit Scoring, ELISAs, Immunfluoreszenz (IF)-Analyse und Myeloperoxidase (MPO)-Assay 4. </li><li> Beschriften Sie die Röhrchen für Blut und Organen, cryomolds sowie Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten. </li><li> Die Antikörper-Lösungen sollten frisch hergestellt werden oder aufgetaut aus Aktien und charakterisiert hinsichtlich ihrer Reaktivität (Titer von IF-Mikroskopie und / oder ELISA). Die sterilfiltrierte Lösung sollte Antikörpers in PBS in einer Weise, dass die erforderliche Dosis für die Injektion variiert zwischen 250-1000 ul verdünnt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend IgG, das gesamte Experiment durchführen zu können. </li><li> Bereiten Sie frischen Antikoagulans: Heparin 20 U / ml und 8,7 mg / ml Ketamin / 1,3 mg / ml Xylazin Mischung für die Anästhesie. Wenn opfern die Mäuse Röhrchen mit 3,7% Formaldehyd hergestellt beschriftet. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente (Skalpell, Schere, feine Spitze und curved forcipes), und bereiten Spritzen (Insulinspritzen, 1, und 2 ml Spritzen), Nadeln, Digitalkamera und zusätzliche Speicherkarte. </li></ol> Hinweis: Führen Sie alle auf Ketamin / Xylazin oder Isofluran narkotisierten Mäusen Isofluran ist die bevorzugte Anästhesie Option für den täglichen Haut-Check, wie Mäuse schnell erholen.. Jedoch wird, wenn Bilder, 87 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin üblicherweise subkutan injiziert. Für Euthanasie die Ketamin / Xylazin Dosis auf 130 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin erhöht. <ol><li> Überprüfen Sie die bereits markierten Tiere für ihre allgemeinen Gesundheitszustand, Haut und Fell Aussehen, wiegen sie und messen ihr Ohr Dicke (immer mit dem gleichen Ohr haften). </li><li> Registrieren beobachteten Werte und Veränderungen in der klinischen Bewertung Blatt. </li><li> Sammle 20-30 ul (2-3 Tropfen) Blut aus der Schwanzvene in einer Spritze mit dem gleichen Volumen der Antikoagulans. </li><li> Desinfizieren Sie das Fell undHaut mit 80% Ethanol. </li><li> Injizieren die Antikörper-Lösung subkutan in den Rücken mit einem Insulinspritze. (Für bestimmte Anlage (z. B. die Ohren) nur kleine Volumina (10-50 ul) durchführbar sind, die injiziert werden.) </li></ol> Die Injektionen sollten wiederholt sich jeden zweiten Tag, 4 mal. Balb / c und C57BL6 Mäuse einem Körpergewicht von etwa 20 g zu starten, um die Krankheit 3-4 Tage nach der ersten Verabreichung von 400-500 bis zu 750 pg / g Körpergewicht / Einspritzung Autoantikörper entwickeln. Bei Beendigung des Experiments: <ol><li> Legen Sie die Mäuse unter tiefe Narkose durch Injektion 130 mg / kg und 20 mg / kg Ketamin / Xylazin subkutan, exsanguinate sie aus dem hinteren Hohlvene und schneiden Sie das Herz aus. </li><li> Sammle Organe / Gewebeproben wie Haut: tail, Ohr, Blut-und Speiseröhre und steckte sie in zuvor beschriftet und PBS oder 3,7% Formaldehyd gefüllten Röhrchen. </li></ol> Bei der Rückkehr in dieLabor: <ol><li> Zentrifuge das Blut bei 1.200 xg, 10 min bei RT Abtrennung des Plasmas, übertragen das Plasma in korrekt beschriftete Röhrchen und bewahren Sie sie entsprechend. </li><li> Einbetten die Haut in optimaler Cut Temperatur Medium Biopsie durch cryomolds, richtig Etikett, und lagern Sie sie bei -80 ° C. </li><li> Legen Sie die Gewebeproben für die Histologie in den markierten Einbettformen gedacht und halten sie in 3,7% Formaldehyd bis Paraffineinbettung. </li></ol> 3. Clinical Evaluation of Disease Severity Mäuse sollten täglich für Läsionen von Haut und Schleimhaut zu untersuchen und die Ergebnisse zu dokumentieren mit geeigneten Formen werden. Die Kriterien für die frühe Euthanasie ist Hautläsionen, die mehr als 20% der Körperoberfläche und einen Gewichtsverlust von 5-10% des gesamten Körpergewichts in drei aufeinander folgenden Tagen, gerechnet für eine Krankheit Punktzahl von 5 (Tabelle 1). <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf seinem Bauch. Beginnen mit dem Kopf-Bereich, nämlich mit dem rechtenOhr und erfragen Blasen, Erosionen, Kruste auf der inneren als auch auf der äußeren Seite. Weiter auf die gleiche Weise mit dem linken Ohr. </li><li> Rechte und linke Auge werden nach Anzeichen von Hautrötung gesteuert, Alopezie, Erosionen und / oder Kruste. </li><li> Stirn und Schnauze Bereich werden durch nächsten gebürstet, weiterhin mit dem ventralen Teil der Schnauze, Lippen und der Schleimhaut des Mundes. </li><li> Untersuchen Sie das rechte Vorderbein ab der Pfote, nach oben bewegen; wechseln Sie in das linke Vorderbein. Gleiche Prozedur mit der rechten und linken Hinterbeine. </li><li> Bürste durch das Fell am Hals-und Rückenbereich mit einem gekrümmten feinen Spitze Pinzette. </li><li> Drehen der Maus auf seiner Rückseite und überprüfen ventralen Teil sowie die ventralen Seiten der Glieder auf die gleiche Weise wie zuvor. </li><li> Überprüfen Sie den Schwanz. </li><li> Machen Sie Fotos von relevanten Körperteile, wo die Mäuse entwickeln Krankheit. Augenmerk muss auf die Qualität und Quantität der Bilder bezahlt werden. </li><li> Berechnen Sie die klinische Erkrankung Partituren. </li></ol> 4. Die Analyse der Haut-und Plasmaproben <ol><li> Vorzubereiten, zu speichern und / oder verarbeiten alle gesammelten Gewebe nach dem Plan. </li><li> Cut Gefrierschnitten für IF Nachweis von Kaninchen Antikörper und Maus Komplement-System-Komponenten. </li><li> Analyse der verschiedenen Protein-und Enzymgehalt (MPO-Assay) von gefrorenem Gewebe und / oder Organ-Extrakten. </li><li> Abschnitt das Paraffin Gewebe eingebettet und Flecken mit H &amp; E, um das Ausmaß der Gewebeschädigung zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Plasma durch ELISA, Immunoblot. </li></ol>

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	<li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen.">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li><li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li><li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K&#946;+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes.">PI3K&#946; plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li><li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage.">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li><li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita.">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li><li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita.">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li><li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis.">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li><li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme.">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li><li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., W&#246;lfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc&#947;-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes,+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice.">The flavonoid luteolin inhibits Fc&#947;-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066 (2012).</li><li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease,+bullous+pemphigoid,+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen,+BP180.">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li><li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease.">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li><li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+passive+transfer+from+man+to+mouse.">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li><li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+(Witebsky's+postulates+revisited.">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die passive Übertragung von Antikörpern in Versuchstieren ist ein wichtiger Ansatz für den Nachweis ihrer Pathogenität 7, -12. Tiermodelle durch dieses Verfahren erhalten wird, abgesehen davon, dass der indirekte Nachweis für Autoimmunität 13, ermöglichen die Untersuchung des efferenten Phase des pathogenen Mechanismus. Der passive Transfer-Modell von Antikörper-induzierte Granulozyten-abhängige Haut Blasenbildung Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) wurde verwendet, um die Mechanismen de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> rekombinantes Antigen </td><td></td><td></td><td> Die Plasmide Codierung für die rekombinante Formen von murinem Kollagen VII sind aus der entsprechenden Autor zugeordnet. </td></tr><tr><td> Immunsystem Kaninchenserum </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Wir hatten weißen Neuseeland-Kaninchen mit 200 ug Antigen, 3 mal in 2 Wochen-Intervallen immunisiert. Zu diesem Zweck haben wir die Dienste von Eurogentec SA, Belgien verwendet. </td></tr><tr><td> Protein G Agarose </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c-Mäusen </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> OCT-Verbindung, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> Oktober, optimale Schnittleistung Temperatur </td></tr><tr><td> Cryomold Standard </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 mm × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold Zwischen </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> Tätowieren Paste </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> Tätowieren Gerät </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7692,1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaminhydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xylazinhydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> sterile PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze getrieben Filtereinheit 0,45 um </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (Verteiler) </td></tr><tr><td> Krankheit Scoring-Blatt </td><td></td><td></td><td> B. Kapselungsed </td></tr></tbody></table>

granulocyte-dependent autoantibody-induced skin blistering

Autoimmune Phänomene treten bei gesunden Personen, aber wenn Selbst-Toleranz fehl, kann der Autoimmun-Reaktion kann in bestimmten Pathologie führen. Gemäß Witebsky Postulate, eines der Kriterien bei der Diagnose einer Krankheit wie Autoimmun ist die Reproduktion der Krankheit bei Versuchstieren durch die passive Übertragung von Autoantikörpern. Für Epidermolysis bullosa acquisita (EBA), eine prototypische organspezifische Autoimmunerkrankung der Haut und Schleimhäute, wurden mehrere experimentelle Modelle kurzem gegründet. Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt EBA 1. Ausgewachsenen verbreitete Krankheit wird meist gesehen 5-6 Tage nach der ersten Injektion und das Ausmaß der Erkrankung korreliert mit der Dosis des verabreichten collagen VII-spezifischen IgG. Die Gewebeschäden (Blasenbildung) in der experimentellen EBA wird auf die Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten je nach Gewebe-gebundenen Autoantikörper 2, -4. Daher ermöglicht dieses Modell für die Präparation der Granulocyten-abhängige entzündlichen Wegs in der Autoimmun Gewebeschädigung beteiligt, da das Modell reproduziert nur das T-Zell-unabhängige Phase des efferenten Autoimmunantwort. Ferner wird dessen Wert von einer Reihe von Studien, die die Blister-induzierendes Potential von Autoantikörpern in vivo und Untersuchung des Mechanismus der Blasenbildung in EBA 1,3, -6 unterstrichen. Schließlich wird dieses Modell erheblich erleichtern die Entwicklung neuer anti-inflammatorische Therapien Autoantikörper-bedingten Krankheiten. Insgesamt ist die passive Übertragung Tiermodell der EBA eine zugängliche und lehrreich Krankheit Modell und hilft Forschern dabei nicht nur EBA Pathogenese analysieren, sondern zu beantworten grundlegende biologisch und klinischwesentliche Autoimmunität Fragen.

Die passive Übertragung von Antigen-spezifischen Antikörpern führt zu einer ausgewachsenen Krankheit in Mäusen ähnelt in klinischen, histologischen und immunpathologische Ebenen der menschlichen EBA. Blasen, Krusten, Erosionen und Alopezie auf den Ohren, Schnauze, Pfoten, Beine, Rücken und um die Augen der Mäuse entwickeln. Die ersten klinischen Anzeichen der Krankheit wird höchstwahrscheinlich auf den Ohren und / oder Kopfbereich erscheinen. Ablagerung von spezifischen Kaninchen IgG und Maus Komplement C3 wird ...

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Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt Epidermolysis bullosa acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulozyten-abhängige Autoantikörper-induzierten Blasenbildung

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to ...

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Aufrufe.  University of Freiburg. Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) 1.

Serie: Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Kutane Leishmaniose in der Rückenhaut von Hamstern: ein nützliches Modell für das Screening von Drogen leishmanientötende

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

Murine Vollhauttransplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...