הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדד זיהוי חדירות פארא-תאית in vivo כדי להעריך את תפקודם של צמתי אנדותל הדוקים בבלוטות תת-מנדיבולריות של עכברים. עם זאת, למיקרוסקופיה של סריקת לייזר שני פוטונים, יש לא רק את היתרון של מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית, אלא ניתן להשתמש בה גם כדי לזהות רקמות עמוקות יותר ותמונה בצורה ברורה יותר. ניסוי זה מספק מדד שיטה טובה להערכת חדירות כלי הדם של רקמות שונות, במיוחד רקמות פני השטח ואיברים של בעלי חיים.
התחל בבחירת עוקבים מתאימים כגון פלואורסצין, איזותיוציאנט, המסומן דקסטרן ורודמין B, המסומנים כדקסטרן עם ספקטרום פליטות עירור מובהק, כדי למזער את ההפרעה בין אותות פלואורסצנטיים לבדיקת החדירות. לדלל את העקבות לתוך מלח זרחתי סטרילי לתוך 100 מיליגרם למיליליטר מניות ולאחסן את aliquots מוגן מפני אור במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר הרדמתו של עכבר בר זכר בן 8 עד 10 שבועות, החזיקו בעדינות את ראשו וצווארו של העכבר כדי לגרום לצד אחד של גלגל העין לבלוט מעט.
הכנס מזרק אינסולין המכיל 100 מיקרוליטרים של תערובת תמיסת מעקב פלואורסצנטית לאורך זווית העין בזווית ישרה לעין. לאחר ההזרקה, הנח במהירות את העכבר על הקרטון במצב שכיבה כאשר איבריו וראשו מודבקים. עבור בלוטה submandibular או בידוד SMG, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לחתוך את האפידרמיס של הצוואר עם מספריים רקמה כללית כדי לחשוף את שני הצדדים של SMGs.
לאחר מכן, השתמש במחט הפרדת רקמות קהה כדי להפריד בעדינות את הקפסולה מפני השטח של הבלוטה מבלי לפגוע ברקמת הבלוטה, בכלי הדם ובמבנה הבלוטות. חבר את המחזיק המותאם אישית למכשיר הלחץ השלילי ובדוק אם אפקט הלחץ השלילי מושג כראוי מראש. הניחו בעדינות את ה-SMG החשוף על המחזיק המותאם אישית ושאבו את הרקמה על ידי שאיבה בלחץ שלילי, רחוק ככל האפשר מגוף העכבר, כדי להפחית את תוצרי התנועה הנגרמים על ידי נשימה ומצבים אחרים.
יש להתחיל בהדמיה זמן קצר לאחר בחירת אתר הבלוטה. קבל תמונות עוקבות לאורך ציר Z צעד שני מיקרון זה מזה מפני השטח של הבלוטה עד 70 עד 140 מיקרון לתוך הרקמה כדי ליצור מבנה תלת מימדי. לאחר מכן, לרכוש הדמיית קיטועי זמן של כלי הדם כדי למדוד חדירות כלי הדם ב- SMG.
בתיבת הדו-שיח Explorer, לחץ על הוסף תיקיה חדשה "ושנה את שם הקובץ. לאחר מכן, חזור לעמודת הרכישה. ב- XY, הפורמט הוא 512 על ידי 512, והמהירות היא 400 הרץ.
הפעל את ה-X הדו-כיווני, הגדר את מקדם הזום ל- 0.75 ו- 1.5 עבור זום. לאחר מכן, בחר XYT תחת מצב רכישה"כדי לרכוש הדמיה בהילוך מהיר. הגדר את משך הזמן ל-20 שניות, 30 דקות או יותר בהתאם לצורך הניסוי.
לאחר הגדרת התנאים, לחץ על Live"כדי לצפות בהדמיה וסקולרית של שני ערוצים וערוצים חופפים במסגרת יצירת התמונה ובחר את תחומי העניין. לחץ על התחל"כדי להתחיל בהדמיה. בדיקת חדירות כלי דם in vivo, ותמונות תלת מימדיות של כלי דם בעכברים.
בלוטות תת-מנדיבולריות מוצגות כאן. בקבוצת הביקורת, שני העוקבים היו קיימים בכלי הדם של SMG. בשל משקלו המולקולרי הקטן, FD4 הצליח לדלוף מתוך כלי הדם לצדדים הבסיסיים של אציני וצינורות, ובכך לתאר בבירור את צורת האציני והצינורות.
ה- RD70 הופץ בכלי דם גדולים ובכלי מיקרו. בקבוצת קשירת הצינורות, גם FD4 וגם RD70 הוקפצו לצדדים הבסיסיים של האצ'יני, מה שהצביע על כך שקשירת הצינור עלולה לשבש את תפקוד מחסום האנדותל ולהגביר את החדירות למולקולות גדולות. יתר על כן, תוצאות עוצמת הפלואורסצנציה החצי-כמותית FD4 ו- RD70 אישרו את התצפיות הללו.
התמונות התלת-ממדיות הראו פלואורסצנטיות הרבה יותר מוסתרת של FD4 ו-RD70 סביב כלי הדם בקבוצת הקשירה בהשוואה לקבוצת הביקורת. בידוד SMG קפדני ומיקום מתאים והמיקרוסקופ הם תנאי הכרחי לגילוי מוצלח. בעקבות ההליכים, ניתן לחשב את קצב זרימת הדם על ידי נישואים של תנועת תאי הדם האדומים וניתן לרדוף אחר חדירת תאי הדם המסומנים פלואורסצנטיים.
