Unterstützt durch die Fazit-Stiftung Graduate Stipendium für SS, das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF 01 EO 0803) zu KB und der Europäischen Kommission RP7 Finanzhilfevereinbarung PIRG08-GA-2010 bis 276.989, NEUREX, und der Deutschen Forschungsgemeinschaft Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 bis CS Die Autoren haben keine widerstreitenden finanziellen Interessen.

Ein. Isolierung und Beschichtung von Mixed kortikalen Zellen Mixed kortikalen Zellen Isolierung für Astrozytenkulturen kann mit P1 bis P4 Maus Welpen werden. Um eine ordnungsgemäße Astrozyten Dichte zu erreichen ist es notwendig, 4 Maus pup Kortex pro T75 Zellkulturflasche verwenden. Daher werden in der folgenden Volumina Protokoll für ein Zellpräparat unter Verwendung von 4 Maus Jungtieren berechnet. <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens Dissektion, vorwärmen 30 ml Astrozyten Kulturmedien (DMEM, hohe Glucose + 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum + 1% Penicillin / Streptomycin; siehe Tabelle) bis 37 ° C Mantel ein T75-Flasche mit 20 ml Poly-D-Lysin (PDL) in einer Konzentration von 50 pg / ml in der Zellkultur-Wasser für 1 Stunde bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. </li><li> Für die Dissektion Verfahren, bereiten alle notwendigen Reagenzien und Materialien. Sie benötigen: chirurgische Schere, glatte feinen Pinzette, flache Spitze Pinzette, Papierhandtücher, Abfallbeutel, 70% Ethanol eind 2 Sezieren Gerichten (3,5 cm Durchmesser) auf Eis mit 2 ml HBSS jeweils gefüllt. </li><li> Sanft halten und sprühen Sie den Kopf und Hals der Maus Welpen mit 70% Ethanol. Das Tier wird durch Enthauptung mit der Schere geopfert. </li><li> Führen Sie einen Medianschnitt, von hinten nach vorne, entlang der Kopfhaut, um den Schädel zu offenbaren. </li><li> Schneiden Sie den Schädel vorsichtig aus dem Hals bis zur Nase. Zwei weitere Schnitte werden durchgeführt, um einen weiteren Zugriff auf das Gehirn zu ermöglichen: Der erste Schnitt erfolgt anterioren der Riechkolben, der andere inferior des Kleinhirns, um den Schädel von der Schädelbasis trennen. </li><li> Verwendung der flachen Spitze Pinzette sind die kraniale Klappen leicht zur Seite gekippt und das Gehirn erfolgt und in die erste Schale mit HBSS Sezieren gefüllt genommen platziert. Die Schale wieder auf Eis und weiter ernten Alle 4 Gehirne. </li><li> Der Rest des Verfahrens ist Dissektion unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Zunächst werden die Riechkolben und das Kleinhirn entfernt mit den feinenPinzette (Abbildung 1B). </li><li> Um die cortices abzurufen, greifen die hinteren Ende des Gehirns mit den feinen Pinzette, führen Sie eine Inzision zwischen den Hemisphären, legen Sie einen zweiten Satz von Zangen zum erstellten Hain und abziehen das plattenförmige Struktur der Rinde von der Gehirn. </li><li> Sorgfältig sezieren die Hirnhäute aus den Cortex Hemisphären durch Ziehen mit der feinen Pinzette (Abbildung 1D). Dieser Schritt vermeidet Kontaminationen des endgültigen Astrozyten Kultur durch meningealen Zellen und Fibroblasten. Übertragen Sie die vorbereiteten Cortex Hemisphären in die zweite Schüssel mit HBSS gefüllt und schicken Sie es auf Eis. Weiter dementsprechend mit allen 4 Rinden. </li><li> Schließlich schneiden jedes Cortex Hemisphäre in kleine Stücke mit scharfen Klingen (etwa 4 bis 8 Mal). </li><li> Unter sterilen Bedingungen Transfer Cortex Stück in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen und fügen HBSS auf ein Gesamtvolumen von 22,5 ml. </li><li> 2,5 ml 2,5% Trypsin, Mischung und inkubierendas Gewebe im Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. Mix von gelegentlichem Schütteln alle 10 min. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 300 xg zu pelletieren Cortex Gewebestücke. </li><li> Sorgfältig Überstand zu entfernen durch Dekantieren. Um zu vermeiden, verlieren das Gewebe Pellet Sie können mechanisch bewahren Sie sie mit einer Pipette. Dissoziation des Gewebes in einer einzigen Zelle Suspension durch Zugabe von 10 ml Astrozyten Plattierungsmedium und kräftig Pipettieren mit einem 10 ml Kunststoff-Pipette bis Gewebestücke dissoziiert in einzelne Zellen (20 bis 30 mal) sind. Lautstärke auf 20 ml mit Astrozyten Plattierungsmedium. Sie können Nachweis der Dissoziation des Kortex Gewebe in einzelnen Zellen durch Zählen mit einer Zählkammer. Eine Herstellung von 4-Maus pup Kortex sollte zu 10-15 x10 6 dissoziierten Einzelzellen. </li><li> Absaugen PDL aus dem T75 Kulturflasche, Platte die dissoziierte einzigen Zellsuspension und bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. </li></ol> 2. Der Erhalt eines Enriched Astrocyte Kultur <ol><li> Ändern Sie die Medium 2 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen und alle 3 Tage danach. </li><li> Nach 7 bis 8 Tagen, wenn Astrozyten konfluent und Überlagerung Mikroglia sind sitzen exponiert auf der Astrozyten Schicht oder sind bereits aus der Astrozyten Schicht (Abbildung 2) lösen, schütteln Sie die T75 Kolben bei 180 rpm für 30 min auf einem Schüttler um Mikroglia zu entfernen. Überstand verwerfen, die Mikroglia oder wenn Sie zu Kultur und möchten prüfen, Mikroglia, drehen Sie es nach unten und Platte für Kultur 28,29. </li><li> 20 ml frisches Astrozyten Kulturmedium und weiter durch Schütteln der Kolben bei 240 rpm für 6 h auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) zu entfernen. Da einige OPCs wird nicht vollständig von der Astrozyten Schicht lösen, weiterhin unter kräftigem Schütteln für 1 min, um OPC Kontamination zu verhindern. Überstand verwerfen oder drehen Sie es nach unten und Platte, wenn Sie die Kultur OPCs 29 wollen. </li><li> Spülen Sie die verbleibenden confluent Astrozyten Schicht zweimal mit PBS absaugen PBS, 5 ml Trypsin-EDTA und Inkubation im CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Überprüfen Ablösung der Astrozyten alle 5 min und durchzusetzen Ablösung von Astrozyten durch Anschlagen des Kolbens gegen die Handfläche (2-3 mal). </li><li> Nach Astrozyten aus der Kulturflasche abgelöst werden, 5 ml Astrozyten Kulturmedium, Spin-Zellen bei 180 xg für 5 min, Überstand entfernen und 40 ml frisches Astrozyten Plattierungsmedium. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1x10 6 Zellen nach der ersten Zelle Split ergeben. Platte Zellen in zwei T75 Kulturflaschen und bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. Anderer das Medium alle 2 bis 3 Tage. </li><li> 12-14 Tage nach der ersten Spaltung Astrozyten sind in der entsprechenden Zelle Konzentration 24-48 h vor Durchführung des Experiments überzogen. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1,5-2 x10 6 Zellen nach der zweiten Zelle Split ergeben. </li></ol>

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	<li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+for+astrocytes:+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain.">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li><li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energy+metabolism:+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation.">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457, 675-677 (2009).</li><li>Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+influence+of+MeCP2-deficient+glia+on+neuronal+dendritic+morphology.">Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology.</a> Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).</li><li>Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+astrocytes+induce+developmental+delays+in+dendrite+maturation+and+synaptic+protein+expression.">Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression.</a> BMC Neurosci. 11, 132 (2010).</li><li>Kaneko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain.">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li><li>Min, R., Nevian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+signaling+controls+spike+timing-dependent+depression+at+neocortical+synapses.">Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses.</a> Nat. Neurosci. , (2012).</li><li>Eroglu, C., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+connectivity+by+glia.">Regulation of synaptic connectivity by glia.</a> Nature. 468, 223-231 (2010).</li><li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action-potential+modulation+during+axonal+conduction.">Action-potential modulation during axonal conduction.</a> Science. 331, 599-601 (2011).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+VEGF+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 .</li><li>Alvarez, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hedgehog+pathway+promotes+blood-brain+barrier+integrity+and+CNS+immune+quiescence.">The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence.</a> Science. 334, 1727-1731 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+of+brain+endothelium+in+vitro+are+enhanced+by+astroglia.">Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia.</a> J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).</li><li>Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metabolism+dictates+the+polarity+of+astrocyte+control+over+arterioles.">Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.</a> Nature. 456, 745-749 (2008).</li><li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+beyond+the+glial+scar.">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li><li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li><li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage.">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113, 221-233 (2002).</li><li>Dabir, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glutamate+transport+in+a+mouse+model+of+tau+pathology+in+astrocytes.">Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes.</a> J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).</li><li>Wisniewski, H. M., Wegiel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+relationships+between+astrocytes+and+classical+plaque+components.">Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components.</a> Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).</li><li>Shin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mutant+huntingtin+in+glial+cells+contributes+to+neuronal+excitotoxicity.">Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity.</a> J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).</li><li>Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP/alpha-synuclein-positive+filamentous+inclusions+in+astrocytes+and+oligodendrocytes+of+Parkinson's+disease+brains.">NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains.</a> Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).</li><li>Lioy, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glia+in+the+progression+of+Rett's+syndrome.">A role for glia in the progression of Rett's syndrome.</a> Nature. 475, 497-500 (2011).</li><li>Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+and+its+role+in+Alexander+disease.">GFAP and its role in Alexander disease.</a> Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li><li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+damage+in+the+central+nervous+system:+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta.">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II.">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li><li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS,+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects.">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li><li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain:+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages.">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+disease:+a+neurodevelopmental+perspective.">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li><li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1.">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die beschriebene Methode ist hier auf der Astrozyten Kultur Zubereitung von Nagetieren neonatalen Gehirn, die ursprünglich von McCarthy und de Vellis in 1980 27 beschrieben ist. Die modifizierte Methode der Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten aus postnatalen P1 bis P4 Maushirn hier vorgestellten ist schnell, liefert reines primären Astrozyten und ist hoch reproduzierbar. Diese Technik kann leicht übertragen Astrozyten aus anderen Spezies, wie zB von Ratte oder Schwein und von anderen Hirnregionen, wie dem Rückenmark isolieren. Erwägung Astrozyten Vorläuferzelle Isolierung aus neonatalen Gehirns durch McCarthy und deVellis Verfahren erzeugt hoch proliferativen Zellen wird die Zellproliferation und Vermehrung von isolierten Astrozyten des postnatalen P1-P4 Maus Jungtieren begrenzt. Nach der Spaltung Astrozyten einmal 7 Tage in vitro (DIV), sie wird wachsen Konfluenz und reifen. In vivo, ist am Astrozytenproliferation weitgehend abgeschlossen P14 32. Ererneut, schlagen wir vor, Astrozyten für Experimente nutzen am Tag 21 bis 28 DIV (2F), um das reife Phänotyp der isolierten Astrozyten zu gewährleisten. Aufgrund der inhärenten Rückhalteeinrichtung zu proliferieren Astrozytenkulturen sollte nicht mehr als 3 Mal gespaltet werden. Kritische Schritte in der beschriebenen Verfahren zur Isolierung sind die Verdauung von Kortex und die folgende Verreiben des verdaute Gewebe für den Erhalt der einzigen Zellsuspension. Daher ist es notwendig, die Konzentration und Trypsin Verdauung Zeit zu optimieren, um eine Einzelzellen-Suspension nach Verreiben der Hirnrinde Gewebe für 20-30 mal erhalten. Zur Minimierung Variation Trypsin sollte aliquotiert und Frost-Tau-Zyklen sollte vermieden werden. Das beschriebene Verfahren beruht auf Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen auf PDL-beschichteten Kulturflaschen, die die Bindung von Astrozyten sichert und fördert eine konfluente Schicht Astrozyten mehrere Tage nach dem Ausplattieren. Während PDL-Beschichtung ist nicht für Astrozyten m notwendigartungund nach ihrer Trennung von Mikroglia und Oligodendrozyten, kann es für bestimmte Anwendungen wie stromabwärtigen immunofluorescene Färbung durchgeführt werden. Gutes Timing der ersten Zelle Spaltung ist für Zell-Integrität und Ausbeute wichtig. Wenn Astrozyten kultiviert werden über sie Konfluenz erreichten, verlieren Sie möglicherweise die Mehrheit der Zellen aufgrund unzureichender Ablösen während der ersten Zelle geteilt. Dies kann nicht durch eine Erhöhung der Zeit für die Ablösung, da umfangreiche Inkubationszeit mit Trypsin negativ beeinflusst die Integrität der Zelle überwunden werden. Im Gegensatz dazu wird das Plattieren der kortikalen Zellsuspension zu knapp einer unzureichenden Bildung einer konfluenten Zellrasen Astrocyten führt. Der beste Zeitpunkt für die erste Zelle Spaltung ist bei 7 bis 8 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen, wenn Astrozyten und Mikroglia sind konfluenten Zellen sitzen auf der obersten Position des Astrozyten Schicht. In der beschriebenen kortikalen Zellkultur zeigen Astrozyten zellulären Heterogenität (&lt;strong&gt; Abbildung 3), wie es für Astrozyten wurde in vivo 33,34 beschrieben. Allerdings hat die Definition vielfältigen Astrozyten Morphologie und Funktionalität durch die begrenzte Anzahl von Markern behindert zu identifizieren und zu unterscheiden potentiell heterogenen Astrozyten Subtypen. Ein gut charakterisierten Marker von reifen faserig und reaktiven Astrozyten ist GFAP. Allerdings ist kaum GFAP durch reife protoplasmatischen Astrozyten exprimiert, was die Verwendung als Marker für alle Astrozyten und es wird auch von RG-Zellen während der Entwicklung und von B-Zellen in der Erwachsenen exprimiert, die seine Verwendung als Bühne-spezifischer Marker. Andere Marker von Astrozyten, einschließlich GLAST, ALDH1L1 oder BLBP, werden auch von unreifen Astrozyten exprimiert und daher nicht ausschließlich Mark Älteres Astrozyten. Schließlich sind reife Astrozyten Marker wie GFAP, Aquaporin-4 und S100B (Abbildung 3) immer up-reguliert während der postnatalen Reifung. In unseren Händen, astrocyte Kulturen in einem Alter von 4 Wochen haben Eigenschaften von reifen Astrozyten in vivo. Mit primären Astrozytenkulturen wir identifizieren konnten den molekularen Mechanismus, wie das Blut geboren Fibrinogen Astrozyten-Aktivierung 17 induziert. Unsere Untersuchungen zeigten, dass ein Träger Fibrinogen von latentem TGF-β ist. Behandlung von primären Astrozyten mit Fibrinogen führte zu aktivem TGF-β-Bildung und Aktivierung des TGF-β/Smad Signalweges in Astrozyten 17,26. Diese Ergebnisse wurden bestätigt mit Fibrinogen Injektionen in vivo. Weiterhin steuern Astrozyten anderen Zelltypen durch die Sekretion von Substanzen, die sich durch Ernten Astrozyten-konditioniertem Medium und Anlegen dieses konditionierten Mediums auf andere Zelltypen analysiert werden kann. Wir zuvor verwendeten Astrozyten-konditionierte Medium in einem funktionalen Assay wie konditioniertem Medium von Fibrinogen-behandelten Astrozyten auswirkt Neuritenwachstum zu analysieren. Reaktiven Astrozyten exprimieren und sekretierenProteine ​​des CSPG Familie, die Neuritenwachstum 16 hemmen. Tatsächlich konditionierte Medium aus Fibrinogen-behandelten Astrozyten signifikant verringert sowohl Neuritenlänge und den Prozentsatz an Zellen, welche Neuritenauswuchs 17. Die Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten in diesem Protokoll beschriebenen stellt ein leistungsfähiges Tool für die Untersuchung von Astrozyten Biologie, da ihre Handhabbarkeit in vielfältigen Anwendungen stark abschließen kann ihre Untersuchung in vivo. Es sollte jedoch bedacht werden, dass die erhaltenen Astrocyten in vitro kultiviert wurden und während sie viele Astrozyten Merkmale beziehen, sie unterscheiden sich auch von in vivo Astrozyten. Daher stellen andere Methoden der direkten Selektion und Isolierung von Astrozyten durch Immunopanning 35 oder Antikörper-basierte FACS isoliert 36 neue Wege zur weiteren Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Astrozyten.

Astrozyten sind eine sehr reichliche Zelltyp im zentralen Nervensystem (ZNS). Das Verhältnis von Astrozyten mit Neuronen ist 1:3 im Cortex von Mäusen und Ratten, während es 1,4 Astrozyten pro Neuron im menschlichen Hirnrinde 1 sind. Das Interesse an Astrozytenfunktion hat sich in den letzten Jahren zugenommen. Eine wichtige Funktion der Astrozyten ist ihre Rolle bei der Bereitstellung von strukturellen und metabolischen Unterstützung Neuronen 2,3. Neu entdeckte Rollen für Astrozyten decken ein breites Spektrum von Funktionen. Dazu gehören Führen des Migration von Axonen und die Entwicklung bestimmter Neuroblasten während der Entwicklung 4-6, Bildung Funktionen im synaptischen Übertragung, Synapse Festigkeit und Informationsverarbeitung durch neuronalen Schaltkreise 7-9, Rollen in Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​10 und Integrität 11-13 und Regulierung des zerebrovaskulären Ton 14. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Astrozyten ist ihre Reaktion auf eine Verletzung. Unter pathologischen Bedingungen astrocytes reaktiv werden und ferner hochregulieren die Expression des Intermediärfilament gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) und inhibitorische extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine ​​15,16. Reaktiven Astrozyten Abgrenzung der verletzten Stelle aus gesundem Gewebe durch Bildung einer glialen Narbe, die hauptsächlich aus Astrozyten sezernierten ECM Proteine ​​des Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG) Familie, hemmen die wichtigsten Faktoren, die axonale Regeneration nach ZNS-Verletzung 15-17. Astrozyten stammen aus radialen Gliazellen (RG)-Zellen während der späten Embryogenese und der frühen postnatalen Leben. Nach Spezifikation Astrozyten aufgetreten ist, Astrozyten Vorstufen ihren Endpositionen zu migrieren, wo sie den Prozess der terminalen Differenzierung beginnen. In vivo erscheinen Astrozyten als drei bis vier Wochen nach der Geburt, wie durch ihre reife typische Morphologie 18,19 angedeutet. Eine Subpopulation von RG Zellen wandeln in Subventrikulärzone Astrozyten (Typ B-Zellen). Both, RG und Typ B-Zellen funktionieren wie Astrozyten-wie neurale Stammzellen (NSCs) während der Entwicklung und in der erwachsenen sind. Wie Astrozyten, RG und Typ B-Zellen exprimieren auch den Astrozyten-spezifischen Glutamat-Transporter (GLAST), Hirn Lipid-bindendes Protein (BLBP) und GFAP, was anzeigt, dass diese Marker nicht ausschließlich verwendet werden, um spezifisch zu markieren erwachsenen Astrozyten. Im Gegensatz zu erwachsenen parenchymatösen Astrozyten, die nicht im gesunden Gehirn, RG und Typ B-Zellen zeigen Stammzellpotenzial wie die Fähigkeit sich selbst zu erneuern müssen teilen. Fehlregulation von Astrozyten wurden in zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit 20,21, Chorea Huntington 22, Parkinson-Krankheit 23, 24 Rett-Syndrom und Alexander-Krankheit 25. Zudem reagieren Astrozyten für alle Beleidigungen des ZNS, die zu Astrozyten-Aktivierung und Astrozyten Gliazellen Narbenbildung 16,26. Die Astrozyten Glianarbe die folgenden Gehirn tr bildetauma oder Rückenmarksverletzung wird angenommen, dass die wichtigste Barriere gegen neuronale Regeneration 15 sein. Die Entwicklung von zuverlässigen Methoden zu isolieren und zu erhalten gereinigten Populationen von Zellen war wesentlich für das Verständnis des Nervensystems. Bahnbrechende Arbeiten von McCarthy und de Vellis können Ermittler bislang fast reine Kulturen von Astrozyten aus neugeborenen Ratten Gewebes 27 vorzubereiten. Viel ist über Astrozyten Biologie mit dieser Methode, die hier in einer leicht modifizierten Form zur Isolierung Maus kortikalen Astrozyten präsentiert gelernt. Ergänzend in vivo Studien, Astrozyten als auch konditioniertem Medium unter Verwendung der in vitro-Kultur beschrieben werden, sind wertvolle Werkzeuge, um weitere Einblicke in Astrozyten Funktionen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Arbeitslösung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Astrocyte Kulturmedien </td></tr><tr><td> DMEM, high glucose </td><td> Life Technologies </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> FBS, hitzeinaktiviertes </td><td> Life Technologies </td><td> 10082-147 </td><td> Endkonzentration: 10% </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td><td> Endkonzentration: 1% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösung für Hirngewebe digestion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Life Technologies </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5% Trypsin </td><td> Life Technologies </td><td> 15090-046 </td><td> Endkonzentration: 0,25% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Andere </td></tr><tr><td> 70% (Vol / Vol) Ethanol </td><td> Roth </td><td> 9065,2 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td><td> Zellkultur </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Zellkultur </td></tr><tr><td> 0,05% Versuchenpsin-EDTA </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 um Sterilfilter </td><td> Sartorius </td><td> 16555 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm Petrischale </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml-Falcon-Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml-Falcon-Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 Zellkulturflasche </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette, feine </td><td> Dumont </td><td> 2-1032; 2-1033 </td><td> # 3c; # 5 </td></tr><tr><td> Pinzette, flache Spitze </td><td> KLS Martin </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13 cm chirurgische Scheren </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> Stereomikroskop + Kamera </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ16F; DFC320 </td></tr><tr><td> Microscope + Kamera </td><td> Zeiss, Canon </td><td></td><td> Primo Vert; PowerShot A650 IS </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKE 4450-1CE </td><td> MaxQ 4450 </td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Julabo </td><td></td><td> SW20, 37 ° C </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of mouse cortical astrocytes

Astrozyten sind eine reiche Zelltyp im Gehirn von Säugetieren, aber es bleibt noch viel über ihre molekularen und funktionellen Eigenschaften erlernt werden. In vitro Astrozyten Zellkultur-Systeme können verwendet werden, um die biologischen Funktionen dieser Gliazellen im Detail zu studieren. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie reine Astrozyten durch Isolierung und Kultivierung von gemischten kortikalen Zellen der Maus Welpen zu erhalten. Die Methode basiert auf der Abwesenheit von lebensfähigen Neuronen und der Trennung von Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die drei wichtigsten glialen Zellpopulationen des zentralen Nervensystems, in Kultur. Repräsentative Bilder in den ersten Tagen der Kultur zeigen die Gegenwart einer gemischten Zellpopulation, und zeigen den Zeitpunkt, wann Astrozyten konfluent werden und sollte von Mikroglia und Oligodendrozyten getrennt werden. Darüber hinaus zeigen wir, Reinheit und astrozytären Morphologie der Astrozyten mit immunzytochemische Färbungen für gut etabliert undneu beschriebenen Astrozyten Marker. Diese Kultur kann leicht verwendet werden, um reine Maus Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Medium zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Astrozyten Biologie erhalten.

Nach Isolierung des gesamten Gehirn der Maus (Abbildung 1A), das Kleinhirn und die Riechkolben müssen entfernt (Abbildung 1B) werden. Die Rinden werden mit der Maus Hirnstamm (1C) und der Hirnhäute der einzelnen Kortex (1D) geschält werden sorgfältig entfernt (1E). Hirnhäute sind offensichtlich durch die meningea und unvollständige Entfernung führt zur Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur meningealen Zellen und Fibroblasten. Nach dem Plattieren des gemischten kortikalen Zellsuspension einige Astrozyten bereits der Kulturflasche Befestigen innerhalb von 24 h (Abb. 2A). Allerdings wird der Zellkulturüberstand Zelltrümmer und sterbende Nervenzellen in den ersten 3 bis 5 Tagen (Abbildung 2A-C) enthalten als das Kulturmedium begünstigt Überleben und Wachstum von Gliazellen. Sobald Astrozyten sind konfluent und Mikroglia sitzen auf dem astrocyt ausgesetzte-Schicht, in der Regel am Tag 7 nach Isolation von gemischten kortikalen Zellen, sollte aus Astrozyten und Mikroglia OPCs durch Schütteln (2D) getrennt werden. 2 Tage nach den ersten Split-Zellen zeigen Astrozyten Morphologie. An diesem Punkt Astrozyten Dichte niedrig ist, und Astrozyten sind voluminös (2E, schwarzen Pfeile markieren eine Zelle). Die zu erwartende Ausbeute an diesem Punkt ist günstig mit ungefähr 4-6 x 10 5 Zellen pro T75 Zellkulturflasche. Allerdings sind die Zellen noch vermehren und reifen in der Kultur an diesem Zeitpunkt. Astrozyten sind in der Regel für Experimente an Tag 21 bis 28 (2F) verwendet, um eine reife Phänotyp isoliert Astrozyten gewährleisten. An dieser Stelle der erwarteten Ausbeute beträgt ca. 1,5-2 x10 6 Zellen pro T75 Zellkulturflasche. Die Astrozyten Reinheit der Kultur wurde durch Elektronenmikroskopie morphologische Studien, Zell-Marker-Expression und pharmakologischen Ansprechverhalten 27 gekennzeichnet. Eine Kontamination desstrocyte Kultur kann durch Marker für Mikroglia (IBA-1) und OPCs (O4) untersucht werden. Die erhaltene Kultur Astrozyten Reinheit und Reife sollte durch immuncytochemische Untersuchung unter Verwendung eines Antikörpers gegen das GFAP-Protein untersucht. Es wird erwartet, dass die Mehrheit der Zellen eine intensive, filamentösen Signals (Bild 3) zeigen. Unsere Isolierung und Kultivierung Verfahren kortikalen Astrozyten führten zu einer Reinheit von Astrozyten größer als 98%, zeigte unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein GFAP (Abbildung 3). Wenn das Verfahren erfolgreich war, gibt kontaminierenden Zellen selten (&lt;2%) und enthalten Mikroglia und OPCs, die unter Verwendung IBA-1 und O4, jeweils angefärbt werden kann. Gegebenenfalls weitere Analyse anderer Astrozyten Marker wie Aquaporin-4, BLBP, S100B und GLAST verwendet werden. Neben GFAP wurden diese Marker alle von den 28 Tage alten Astrozytenkulturen ausgedrückt. Aktuelle Genexpressionsanalysen von gereinigten Astrozyten Populationen zeigten neue Potenziale astrocyte Marker wie der Folat Stoffwechselenzyms ALDH1L1 30,31, die ebenfalls von der Mehrzahl der isolierten corticalen Astrozyten (Figur 3) ausgedrückt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection der postnatalen (P3) Maus Kortex. A) Whole-Brain. B) Brain nach Entfernung der Riechkolben und Kleinhirn. C) Isolierung des Kortex durch Abziehen der plattenähnlichen Struktur des Kortex des Gehirns. D, D &#39;) Cortex vom ventralen und dorsalen Seite mit Hirnhäute (schwarzen Pfeile zeigen meningealen Arterien). E) Cortex ohne Hirnhäute. Maßstab, 1,5 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig2.jpg" /> Abbildung 2. Morphologische Überblick über isolierte gemischten kortikalen Zellen und reinen Astrozyten Kultur zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Isolierung.A) 1 Tag nach der Beschichtung von gemischten kortikalen Zellen. Ersten Astrozyten sind an der Unterseite des Kolbens (schwarze Pfeile) befestigt und sterbende Nervenzellen sind im Überstand. B) 3 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen. Astrocyte Schicht bildende (schwarze Pfeile). Neuronen sind fast abwesend. C) 5 Tage nach Plattieren von gemischten kortikalen Zellen. Erste Mikroglia und OPCs auf einem Astrozyten Schicht (schwarze Pfeile). D) 7 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen. Astrocyte Schicht ist komplett konfluent. E) Nach Entfernen Mikroglia und OPCs durch kräftiges Schütteln und 2 Tage nach dem Spalten zeigen anhaftenden Zellen Astrozyten Morphologie mit niedriger Dichte (Pfeile zeigen eine Zelle). F) Astrocyte Schicht zeigt hoher Dichte 2 Wochen nach der ersten geteilten. Maßstab, 10 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig3.jpg" /> Abbildung 3. Reinheit des primären Astrozyten Kultur. Immunmarkierung der primären Maus Astrozyten culturen mit den Markern GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 und BLBP (alle grün) ergab reine primäre Astrozyten Kultur. Kerne werden mit 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blau) gefärbt. Maßstab: 10 um.

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

isolation-and-culture-of-mouse-cortical-astrocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

91.1K Aufrufe.  University of Freiburg. Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Serie: Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

Isolierung und Kultivierung humaner Zellen pilzförmige Papillen Geschmack

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellierung Astrozytom Pathogenese<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt; Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...