In dieser Handschrift beschriebenen Arbeiten wurden mit Mitteln des Patrick F. Taylor Stiftung ermöglicht.

1. Chromosom Ernten von adhärenten Zellen <ol><li> Standard-Protokoll <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. Wenn die Zellen logarithmischen Phase (80% Konfluenz) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. Ein Minimum von 2 x 10 6 Zellen empfohlen. </li><li> Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 45 min. Verwendung einer sterilen Pipette Medien von Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Beiseite stellen. </li><li> Behutsam die Zellen durch Zugabe von 2 ml HBSS-Puffer in den Kolben. Swirl Puffer und entfernen Sie dann mit einer Pipette. Entsorgen. </li><li> 1 ml Trypsin, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche der Flasche bedeckt. Nur lassen die Zellen in Trypsin für ca. 2 min. Nachdem die Mehrheit der Zellen freistehend, pipettieren, die Medien in der konischen Rohr wieder auf den Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen.Zentrifuge bei 200 × g für 10 min. Überstand entfernen und das Pellet. </li><li> 10 ml 0,075 M KCl, die auf 37 ° C zu der verbleibende Pellet im konischen Rohr vorgewärmt wurde. Wirbelrohr bei mittlerer Geschwindigkeit zu KCl und Zellen mischen. </li><li> Zellen bei 37 ° C für 10 min. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Überstand entfernen (bis etwa 0,5 ml Überreste) und Pellet erneut. </li><li> Zu den Zellen unter Vortexen: 5 ml frischem Carnoy-Fixativ (Eisessig 3:1-Verhältnis von Methanol) Vorsichtig. Daraufhin 5 ml mehr ohne Fixiermittel Vortexen für insgesamt 10 ml. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. Die Zellen können nun in 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom harvesting Lymphoblastoidzelllinien <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. (Verwenden Sie geeignete Kanne für die Menge an Zellen in Kultur). Wenn die Zellen logarithmischen Phase (etwa 2 Tage nach Zellen aufgeteilt sind) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus Vollblut Phytohämagglutinin (PHA), ein Lektin aus der roten Bohne abgeleitet ist, ist ein leistungsfähiges Mitogen für humane T-Zellen 16. 72 Stunden nach der Zugabe von PHA in die Kultur, etwa 45% der Zellen in der S-Phase. Dies stellt den Peak mitotische Aktivität und der optimale Punkt, an dem für Chromosomenstudien ernten. Andere Mitogene, wie Pokeweed (1-10 ug / ml) kann, wenn B-Zellen analysiert 17,18 verwendet werden. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Vollblut in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Verwenden Sie innerhalb von 3 Tagen nach der Sammlung. Shop Blut bei RT until bereit. </li><li> Aliquots von 0,25 ml Vollblut in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon und 1% PHA). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus dem Knochenmark Zytogenetische Analyse auf das Knochenmark ist hilfreich bei vielen malignen hämatologischen Erkrankungen, wie die Beobachtung eines chromosomal abnormen Klon kann diagnostisch für eine bestimmte Art der Leukämie. Chromosomenstudien werden auch verwendet, um den Krankheitsverlauf wie der Beginn der Blastenkrise und Ansprechen auf die Therapie zu beurteilen. Da Knochenmarkzellen werden aktiv teil ist keine Mitogenstimulation notwendig 9,19. Bei akuten Leukämien 24 und 48 h Kulturen werden ebenfalls eingerichtet. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Knochenmark in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Aliquots von 0,25 ml Knochenmark in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Slide Vorbereitung und Solid-Färbung Eine schnelle Auswertung von einem Vertreter Folie wird Informationen über die Qualität der Ernte, bevor wieder weitere Verfahren wie die G-Bänderung, FISH, CGH, SKY oder bereitzustellen. Manche Labors lieber festen Fleck die Zellen für die schnelle Ernte und Chromosom Beurteilung. Alternativ kann ein Phasenkontrastmikroskop für diese Analyse verwendet werden. Objektträger werden am besten vorbereitet, wenn die Luftfeuchtigkeit etwa 50% und die Temperatur der Umgebungs (20-25 ° C). <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Entfernen Sie den Überstand bis nur 0,3-0,5 ml verbleibt. </li><li> Nach vorsichtigem Resuspendieren des Pellets, Pipette drei Tropfen der Zellsuspension aus einer Entfernung von etwa 2 auf eine Folie, die in einem Winkel von etwa 45 ° geneigt und ermöglichen der Suspensionum über die Rutsche rollen. In einem großen Tropfen Frisch Carnoy-Fixativ auf der Folie. </li><li> Trocknen Sie die Rückseite der Folie auf ein Papiertuch und dann sitzen die Folie zum Trocknen für mindestens 10 min. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> Bereiten Sie frischen Giemsa-Färbelösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. Spülen Sie mit destilliertem Wasser gleitet, abtropfen und an der Luft trocknen. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Wenn die Metaphase Zellen reichlich und gut verteilt sind, können die restlichen Folien für andere experimentelle Verfahren verwendet werden. </li></ol> 3. G-Banding Mit Trypsin und Giemsa (GTG) &lt;p&gt; Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das euchromatic Histone in DNA-Bereichen mit höheren Transkriptionsaktivität resultierende denaturiert. Nach Giemsa-Färbung, werden diese Regionen als Streifen treten. Hoch verdichtete Chromatin mit wenig oder ohne Transkriptionsaktivität (Heterochromatin) einen großen Teil seiner Histone vom Trypsin geschützt haben und daher dunkel färben folgenden Giemsa. Es ist wichtig, zunächst G-Band eine Folie, um die Bedingungen zu überwachen und einstellen Trypsin Timing bei Bedarf für die folgenden Folien. <ol><li> Fügen Sie die folgenden Lösungen bis 4 Coplin Gläser. Glas # 1 = 30 ml 1X HBSS und 4 ml 10x Trypsin (0,5%) Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS Glas # 3 = 45 ml 1X HBSS und 5 ml fötales Rinderserum Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS </li><li> Tauchen Sie jede Folie im Glas Nr. 1 für 5 Sekunden, schnelle Spülung in Jar # 2, lassen jede Folie im Glas Nr. 3 für mindestens 30 sec, schnelles Spülen im Glas Nr. 4 dann lassen Folien zu trocknen. </li><li> Bereiten fresh Giemsa-Lösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser in der gleichen Reihenfolge, dass sie gefärbt wurden. Die Objektträger für 10 min trocknen. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Einstellen Trypsin Zeitpunkt der Rest der Schlitten auf der Basis der Ergebnisse der ersten Folie. </li></ol>

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Wir haben die vorliegenden Verfahren für Chromosom Isolierung aus Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich von verschiedenen humanen Zelltypen zu erhalten, Rhesus-Makaken, Ratten und Mäuse verwendet 11,20-22. Das Standardprotokoll vorgesehen ist, aber bestimmte Schlüsselschritte und Variablen benötigen, um für diese verschiedenen Arten von Zellen eingestellt werden. Mehrere spezifische Schritte in dem sowohl die chromosomale Herstellung und G-banding, um die bestmögliche Qualität der Ergebn...

Chromosomenanalyse ist eine herkömmliche Technik genutzt, um den Chromosom Instabilität und Umlagerungen, die zu genetischen Störungen und Bösartigkeit 1,2,8,9 diagnostizieren. Darüber hinaus kann eine höhere Auflösung für die Diagnose und Erforschung von Krebs-und Verfassungs erworbene genetische Anomalien mit der Kombination der klassischen zytogenetischen Verfahren und molekulare zytogenetischen Methoden wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH) erreicht werden und spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15. In jüngerer Zeit haben diese Techniken für die Beurteilung von Chromosom Instabilität mit Stammzellen assoziiert genutzt. Karyotypischen Anomalien wie Aneuploidie von Langzeit kultivierten embryonalen Stammzellen (ES) und adulten Stammzellen aus verschiedenen Organismen wurden von mehreren Laboratorien gemeldet. Neuere Erkenntnisse unterstützt, dass einige Zelllinien sind von Natur aus eher auf Chromosom instabiNG unabhängig von den Kulturbedingungen. Aus diesem Grund wird bei der Festlegung und / oder Aufrechterhaltung von Mensch, Maus oder Rhesus Stammzelllinien, die Chromosomenanalyse wird als Teil der Qualitätskontrolle empfohlen. Viele Berichte beschreiben die zunehmendes Interesse an der Verwendung von Routine-und molekularen Zytogenetik, um die chromosomale Stabilität von Stammzellen und malignen Zellen oder verschiedenen Organismen in der Kultur 10-13 überwachen. Diese Protokolle werden zunehmend von nicht-genetischen Labors für die schnelle Chromosomen Bewertung ihrer kultivierten Zellen 13 verwendet. Wir stellen unsere grundlegende Verfahren zur Herstellung von Chromosom verschiedenen Zelltypen, die sowohl für klinische und Forschungszwecke und Zellen von verschiedenen Organismen stammen angewendet werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

Chromosom (zytogenetische Analyse) wird weithin für den Nachweis von Chromosomen-Instabilität verwendet. Wenn durch G-Banding und molekularen Techniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt, hat dieser Test die leistungsfähige Möglichkeit, einzelne Zellen zu Aberrationen, die Gewinne oder Verluste von Abschnitten des Genoms und Umlagerungen, die ein oder mehrere Chromosomen betreffen analysieren. Bei Menschen, in etwa 1 pro 160 Lebendgeburten 1,2, 60-80% aller Fehlgeburten treten Chromosomenanomalien 3,4, 10% der Totgeburten 2,5, 13% der Personen mit angeborenen Herzfehlern 6, 3-6% der Unfruchtbarkeit Fällen 2 und bei vielen Patienten mit Entwicklungsverzögerung und der Geburtsdefekte 7. Zytogenetische Analyse der Bösartigkeit wird routinemäßig von Forschern und Klinikern verwendet, wie Beobachtungen von klonalen Chromosomenanomalien haben gezeigt, dass sowohl diagnostische als auch prognostische Bedeutung haben 8,9.60; Chromosomentrennung ist von unschätzbarem Wert für die Gentherapie und Stammzellforschung von Organismen einschließlich nicht-menschlichen Primaten und Nagetiere 10-13. Chromosomen von Zellen von lebenden Geweben, einschließlich Blut-Lymphozyten, Haut-Fibroblasten, Amniozyten, Plazenta, Knochenmark und Tumorproben isoliert werden. Chromosomen werden in der Metaphase-Stadiums der Zellteilung analysiert, wenn sie am meisten verdichtet werden und damit deutlich sichtbar. Der erste Schritt des Chromosoms Isolationstechnik beinhaltet die Unterbrechung der Spindelfasern durch Inkubation mit Colcemid, um die Zellen ausgehend von der nachfolgenden Stufe Anaphase verhindern. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Lösung behandelt und in ihrem gequollenen Zustand mit Carnoy-Fixiermittel erhalten. Die Zellen werden dann auf Objektträger fallengelassen, und können dann für eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. G-Banding beinhaltet Trypsin-Behandlung gefolgt von einer Färbung mit Giemsa zu charakteristischen hellen und dunklen Streifen zu schaffen. Das gleiche procedure Chromosomen isolieren können zur Herstellung von Zellen für die Verfahren, wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), und die spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15 verwendet werden.

Hochwertige Metaphasespreitungen sind für die Chromosomenanalyse. Ein erfolgreicher Test ergibt Chromosomen, die gut verteilt sind und von geeigneten Chromosomenmorphologie. Richtig G-gebänderten Chromosomen enthalten den charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine erfolgre...

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Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

80.5K Aufrufe.  Louisiana State University Health Science Center.  Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden. 

Serie: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...