אנו מכירים בתרומה של הרנטה סנו בהריון הפרוטוקול הראשוני. Ad&#39;A. מחזיק את התכשיטים לילדים (JFC) ניחן קתדרה לגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענקי NIH GM60905, DK52025 וCA021764, ואת הצדקה האמריקנית הלבנונית הסורית, המזוהית (ALSAC).

<html> הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד והטיהור של MAMs ופנינים ממוח העכבר פתרונות הנדרשים לבידוד, MAMs ופניני מיטוכונדריה חלוקה להשיג הכנת המיטוכונדריה גולמית: פתרון: סוכרוז 0.32 מ &#39;, 1 המ&quot;מ 3 NaHCO, 1 המ&quot;מ MgCl 2, 0.5 מ&quot;מ CaCl 2 + מעכבים פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) פתרון ב &#39;: סוכרוז 0.32 מ&#39;, 1 המ&quot;מ NaHCO 3 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) בידוד MAMs: בידוד בינוני: 250 המ&quot;מ מניטול, pH 5 המ&quot;מ HEPES 7.4, 0.5 המ&quot;מ EGTA, 0.1% BSA מאגר השיפוע: 225 המ&quot;מ מניטול, pH 25 המ&quot;מ HEPES 7.5, 1 המ&quot;מ EGTA, 0.1% BSA (ריכוז סופי) בידוד פנינים: תוכן &quot;&gt; הצפת חילוץ GEM: 25 HEPES mM pH 7.5, 0.15 מ &#39;NaCl, 1% Triton X-100 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) מאגר GEM Solubilising: 50 mM טריס-HCl, 8.8 pH, 5 המ&quot;מ EDTA, 1% SDS + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך). 1. היפוך חלוק ראשון שלב subcellular: הסרה של גרעינים, תאי Unlysed ופסולת ניידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתא 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להסיר מוח, לחצות, להניח ב2 צינורות מ&quot;ל על קרח ולשקול. </li></ol> שים לב: שמור על חצי מוח נפרד לאורך כל ההליך. להלן חל על הטיפול בחצי מוח אחד. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח מניח מחצית במטחנה מראש מצוננת 2 מיליליטר זכוכית Dounce רקמות המכילה א פתרון 1 מ&quot;ל הקר הומוגני עם 15 משייכות כוללות של עלי פינוי גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינור 15 מ&quot;ל בז, על קרח, ולדללhomogenates עד 10 כרכים w / v, למשל 0.225 גרם לרמה של 2.25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 1400 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant והעברה לצינור צנטריפוגה זכוכית עגולה עם תחתית 30 מ&quot;ל, על קרח. הקפד לא להפריע לגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה באותן 10 כרכים של פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ&quot;ל בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינור טרי 15 מ&quot;ל בז וצנטריפוגה XG ב 710 עבור 10 דקות ב 4 ° C. התוצאה היא גלולה של גרעינים ופסולת של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant וברכה עם supernatant שמר בשלב 1.6. </li></ol> 2. שלב שנייה: בידוד המיטוכונדריה גולמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatants ב13800 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 10 כרכי פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ&quot;ל בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כצעד 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגלולה המתקבלת היא שבריר המיטוכונדריה מועשרת. ברכה את supernatants (cytosol ומיון), מכסה בparafilm ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה עם 6 משייכות של עלי סיקול קטן, ב4.8 המ&quot;ל / גרם (ז נקרא משקל המוח המקורי) של הפתרון של B, בhomogeniser טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettes הזכוכית פסטר, להכין Gradient סוכרוז רציף בצינורות צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, והוסיף מאוחר יותר לחלק התחתון של הצינור כדלקמן, בזהירות, להבטיח ללא בועות נוצרות: Resupended הגלולה (0.32 סוכרוז M) 3 המ&quot;ל סוכרוז 850 מ&quot;מ (במ&quot;מ 3 NaHCO 1) 3 סוכרוז מ&quot;ל 1 M (במ&quot;מ 3 NaHCO 1) 3 1.2 המ&quot;ל סוכרוז M (במ&quot;מ NaHCO 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 82500 ל2 שעות ב 4 ° C. הפרדת התוצאה בסוף השיפוע תהיה לייצר שלוש להקות וגלולות: 1) המיאלין ומזהמים אחרים בממברנה (0.32 מ - 0.85 ממשק M), 2) ER, Golgi, קרום פלזמה (0.85 מ &#39;- 1 ז ממשק); 3) synaptosomes (1 מ - 1.2 מ &#39;ממשק): 4) גולמי המיטוכונדריה (גלולה) המשמש לטיהור הצעדים הבאים </li></ol> 3. בידוד של ממברנה ER-המיטוכונדריה משויכת, MAMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גולמי מיטוכונדריה המבודדת טרי מהחצי מוח אחד, בבידוד בינוני מ&quot;ל 2 המכילים מעכבי פרוטאז הוסיפו טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30% שיפוע עם Percoll מיליליטר Gradient המאגר 8 לכל חצי מהמוח, ומקום בTube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear. </li></ol> * הערה: ודא חיץ שיפוע מרוכז יותר (1.43 ימים) כדי להשיג ריכוז סופי נכון אחרי דiluting Percoll עד 30%. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית המיטוכונדריה שכבה על גבי שיפוע מוכן לאט, כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 95000 למשך 30 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבר הכבד (רצועה תחתונה) הראשון עם זכוכית פיפטה פסטר ולהעביר לצינור זכוכית עגולה בתחתית טרי, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בר האור (רצועה העליונה) השני עם זכוכית פיפטה פסטר אחר ולהעביר לשפופרת זכוכית נפרדת טריה ישבן עגול, על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למהול שני השברים שנאספו בשלב 3.5 עם 10 מ&quot;ל בינוני בידוד וצנטריפוגה XG ב 6300 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליכו את supernatant מהבר הכבד הושג בשלב 3.6, resuspend הגלולה עם בידוד בינוני עוד 10 מ&quot;ל וסרכזת שוב, כצעד 3.6. הגלולה שתתקבל תהיה חלק המיטוכונדרי הטהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant מfrac האורtion הושג בשלב 3.6 ל Tube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח. השלך את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני בידוד מספיק כדי supernatant הושג בשלב 3.8 למלא את הצינורית וצנטריפוגה XG ב 100.000 ל1 שעות, 4 ° C. הגלולה שתתקבל תהיה שבריר MAMs. מוציא בזהירות ולהשליך supernatant. </li></ol> הערה: בשלב זה, ייתכן שגם חובצה ב -100,000 XG ל1 שעות, 4 ° C supernatant הציל בשלב 2.6. הגלולה תהיה שבריר ER וsupernatant שבריר cytosolic. 4. הפקת Glycosphingolipid מועשר-Microdomains, אובניים החן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse שברי מיטוכונדריה ו / או MAM טהורים ב500 מ&quot;ל μl-1 של הצפת חילוץ עבור 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב15300 XG עבור 2 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatants (X-100 חומרי טריטון מסיסים) וגלולות מחדש צנטריפוגותעבור 2 דקות שנותר כדי להסיר חומרים מסיסים. (טריטון X-100 חולץ המיטוכונדריה ו / או טריטון X-100 MAMs חולץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize כדורים בSolubilising מאגר. חומרי solubilized זה מייצג את שברי GEM ויכולים לשמש לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

אף אחד מהמחברים יש ניגודי עניינים שיכריזו.

האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חלוקה </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד, Hexahydrate </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד סידן, dihydrate </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-מניטול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M9546-250 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> E4378-250 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, V בר, הלם חום, Lyophilizate </td><td> רוש </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פנינה </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T9284-500 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> רוש </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט Dodecyl נתרן (SDS) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> משותף </td></tr><tr><td> טבליות מעכבי פרוטאז, שלמות EDTA חינם </td><td> רוש </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> 2 מטחנות רקמות מ&quot;ל Douce כל הזכוכית </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות מ&quot;ל פוליפרופילן חרוטי צנטריפוגות, BD פלקון </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 צינורות זכוכית צנטריפוגות ישבן עגול מ&quot;ל </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ישבן עגול הזכוכית Centri מ&quot;לצינורות fuge </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות Ultracentrifuge, Ultra-ברור, Thinwall, מ&quot;מ 14x89 </td><td> Beckman-קולטר </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> קולמן לבן זוג </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> פנוי ורוסיליקט זכוכית פסטר Pipets, 9 &quot; </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום 1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש 2 + ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs 4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca 2 + 4,5,6. ER משמש כחנות העיקרית של Ca 2 + התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca 2 + איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca 2 + הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca 2 + ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca 2 + איזון 4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca 2 + איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות 4,9,10,11,12. כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית 13,14. לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים 4,15.

בהתבסס על הניסיון שלנו בשימוש בפרוטוקול זה אנו יכולים בבטחה ממליצים עליו לבידוד והטיהור של MAMs, אובניים חן ופיצולי המיטוכונדריה ממוח עכבר. ההליך כפי שמתואר הוא שחזור ומתואם היטב. באיור 1 אנו מראים תמונה מייצגת של דרך שכבת המיטוכונדריה וMAMs הטהורה בשיפוע Percoll (?...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain at JoVE.com

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K Views.  St Jude Children's Research Hospital. הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

Video: Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Studying Pre-formed Fibril Induced &amp;#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

לימוד טרום בנוי Fibril ריל המושרה α-Synuclein הצטברות בעכבר עובריים העיקרי מיילדופאמין דופמין המוח

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

מודל שבץ פוטוטרומבוטי מועשר בפיברין ורגיש ל-tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

עכבר מוח Histone שינוי כימות באמצעות ציטומטריה זרימה

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

מחבר זרקור: שיפורים במחקר בקרת ביטוי גנים

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...