Riconosciamo il contributo di Renata Sano nel concepire il protocollo iniziale. Ad&#39;A. detiene le Jewelers per i bambini (JFC) Dotato Cattedra di Genetica e terapia genica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e gli americani libanesi Charities siriane associati (ALSAC).

<html> Il seguente protocollo è stato progettato per l&#39;isolamento e la purificazione di MAMs e gemme da cervello di topo Soluzioni richiesto per l&#39;isolamento di mitocondri, MAMs e gemme Frazionamento per ottenere greggio preparazione mitocondriale: Soluzione A: 0,32 M saccarosio, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario) Soluzione B: 0.32 M saccarosio, 1 mM NaHCO3 + inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario) MAMs Isolamento: Isolation Medio: 250 mM Mannitolo, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA Gradiente Buffer: 225 mM mannitolo, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (concentrazione finale) GEM di isolamento: contenuto &quot;&gt; GEM tampone di estrazione: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario) GEM Buffer solubilizzante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario). 1. Passo Frazionamento subcellulare Primo: Celle rimozione dei Nuclei, non lisate e detriti cellulari <ol><li> Eutanasia mouse nella camera di CO 2. </li><li> Rimuovere immediatamente il cervello, dimezzare, mettere in 2 ml provette in ghiaccio e pesare. </li></ol> Nota: Tenere le metà del cervello separato durante tutta la procedura. Quanto segue si applica al trattamento di un mezzo unico cervello. <ol start="3"><li> Luogo cervello metà in pre-refrigerati 2 smerigliatrice di vetro tessuto Dounce ml contenente 1 ml di soluzione fredda A. Omogeneizzare con 15 colpi totali di un pestello spazio di grandi dimensioni. </li><li> Trasferire in una provetta da 15 ml falcon, su ghiaccio, e diluireomogenati fino a 10 volumi w / v, ad esempio 0,225 g di 2,25 ml. </li><li> Centrifugare campione a 1400 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione il supernatante e trasferirlo in una 30 ml a fondo rotondo tubo di vetro, sul ghiaccio. Fare attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il precipitato in stessi 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta. </li><li> Trasferire in una nuova provetta 15 ml falcon e centrifugare a 710 xg per 10 min a 4 ° C. Ciò si traduce in un pellet di nuclei e detriti cellulari. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante e piscina con il surnatante salvato nel passaggio 1.6. </li></ol> 2. Secondo passo: Crude Isolamento mitocondri <ol><li> Centrifugare supernatanti a 13800 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, su ghiaccio </li><li> Risospendere il pellet in 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta. </li><li> Centrifugare come punto 2.1. </li><li> Ripetere i passaggi 2,2-2,4. </li><li> Il pellet risultante è una frazione arricchita mitocondriale. I supernatanti (citosol e ER), coprire con parafilm e tenere in ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet con 6 colpi di un pestello piccolo gioco, in 4,8 ml / g (g è riferito al peso del cervello originale) di soluzione B, in un omogeneizzatore fresco. </li><li> Usando pipette Pasteur in vetro, preparare un gradiente discontinuo di saccarosio in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, aggiungendo successivamente al fondo della provetta come segue, con attenzione, assicurando bolle si formano: Resupended pellet (0,32 M saccarosio) 3 ml 850 mM saccarosio (in 1 mM NaHCO3) 3 ml 1 M Saccarosio (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml di 1,2 M saccarosio (in 1 mM NaHCO3) </li><li> Centrifugare a 82500 xg per 2 ore a 4 ° C. La separazione risultante alla fine del gradiente produrrà tre bande e un pellet: 1) mielina e altri contaminanti membrana (0,32 M - 0,85 M di interfaccia), 2) ER, Golgi, membrane plasmatiche (0,85 M - 1 M di interfaccia); 3) sinaptosomi (1 M - 1,2 M di interfaccia), 4) grezzo mitocondri (pellet) che viene utilizzato per le successive fasi di purificazione </li></ol> 3. Isolamento dei mitocondri associata a membrana ER, MAMs <ol><li> Risospendere il greggio appena mitocondri isolati da una metà del cervello, in 2 ml di terreno di isolamento contenenti inibitori della proteasi appena aggiunti. </li><li> Preparazione di un gradiente Percoll 30% con il tampone di gradiente da 8 ml per metà del cervello, e il luogo in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman. </li></ol> * Nota: Assicurarsi tampone gradiente più concentrato (1,43 volte) per ottenere corretta concentrazione finale dopo diluting Percoll al 30%. <ol start="3"><li> Sospensione livello mitocondriale in cima gradiente preparato lentamente per evitare eventuali bolle. </li><li> Centrifugare a 95.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Rimuovere la frazione pesante (fascia inferiore) prima con una pipetta Pasteur di vetro e versare in un nuovo fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio. </li><li> Rimuovere la frazione leggera (banda superiore) con un altro SECONDO Pasteur pipetta di vetro e versare in un separato fresco a fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio. </li></ol></li><li> Diluire entrambe frazioni raccolte nel passaggio 3,5 con 10 ml di mezzo di isolamento e centrifugare a 6300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Scartare il sopranatante della frazione pesante ottenuta nella fase 3.6, risospendere il pellet con un altro supporto 10 ml Isolamento e centrifugare nuovamente, come passo 3,6. Il pellet risultante sarà la frazione pura mitocondriale. </li><li> Trasferire il surnatante dal Frac Lucezione ottenuta nello stadio da 3,6 a un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, sul ghiaccio. Eliminare il pellet. </li><li> Aggiungere mezzo di isolamento al supernatante ottenuto nel passaggio 3,8 per riempire il tubo e centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C. Il pellet risultante sarà la frazione MAMs. Rimuovere con attenzione ed eliminare il surnatante. </li></ol> Nota: A questo punto, si può anche centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C, il surnatante salvato nella fase 2.6. Il pellet sarà la frazione ER e supernatante la frazione citosolica. 4. Estrazione di glicosfingolipidi-microdomini arricchiti, GEM <ol><li> Lyse puri frazioni mitocondri e / o MAM in 500 pl-1 ml di tampone di estrazione per 20 min in ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 15300 lisati xg per 2 minuti a 4 ° C. </li><li> Raccogliere surnatanti (Triton X-100 materiale solubile) e ri-centrifuga pelletsper 2 minuti per rimuovere restante materiale solubile. (Triton X-100 mitocondri estratti e / o Triton X-100 MAMs estratti). </li><li> Solubilizzare pellet in solubilizzanti tampone. Questo materiale solubilizzato rappresenta le frazioni GEM e può essere utilizzato per ulteriori analisi. </li></ol>

<ol>
	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

I siti di contatto tra membrane intracellulari o tra organelli e la membrana plasmatica di cellule rappresentano dinamiche piattaforme di segnalazione per processi cellulari di base. La caratterizzazione accurata della loro funzione e la composizione sia in condizioni fisiologiche e patologiche richiede protocolli di purificazione affidabili e riproducibili. I metodi qui descritti sono stati specificamente ottimizzate dal nostro laboratorio per l&#39;isolamento e la purificazione dei MAMs e loro gemme corrispondenti del...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTI </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Frazionamento </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di Sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio, esaidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio, diidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Frazione V, shock termico, liofilizzato </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio dodecil solfato (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comune </td></tr><tr><td> Compresse inibitori della proteasi, completi EDTA-free </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Glass tessuto Grinders </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml in polipropilene Tubi per centrifuga coniche, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml a fondo rotondo in vetro da centrifuga Tubi </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml a fondo rotondo in vetro CentriFuge Tubi </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi ultracentrifuga, Ultra-Clear, pareti sottili, mm 14x89 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipette, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

Organelli intracellulari sono strutture altamente dinamiche con diversa forma e composizione, che sono sottoposti a stimoli intrinseci ed estrinseci delle cellule-specifiche. Le loro membrane sono spesso giustapposti a siti di contatto definiti, che diventano centri per lo scambio di molecole di segnalazione e dei componenti della membrana 1,2,3,4. Le inter-organelli microdomini di membrana che si formano tra il reticolo endoplasmatico (ER) ei mitocondri all&#39;apertura del IP3-sensibili Ca 2 + sono noti canali come i mitocondri associato-ER membrane o MAMS 4,5,6. La proteina / lipide composizione e le proprietà biochimiche di questi siti di contatto di membrana sono stati ampiamente studiati in particolare in relazione al loro ruolo nella regolazione intracellulare Ca 2 + 4,5,6. La ER serve come fonte principale di Ca 2 + intracellulare, e in questa capacità regola una miriade di processi cellulari a valle di Ca 2 + segnalazione, including post-traduzionale folding delle proteine ​​e proteine ​​maturation7. Mitocondri, invece, mantenere l&#39;omeostasi Ca 2 +, tamponando citosolico Ca 2 + concentrazione impedendo così l&#39;apertura di percorsi apoptotici a valle di Ca 2 + squilibrio 4,8. La natura dinamica delle MAMs li rende luoghi ideali di base per analizzare i meccanismi cellulari, tra cui Ca 2 + di segnalazione e regolazione di mitocondriale Ca 2 + sopravvivenza concentrazione, la biosintesi dei lipidi e dei trasporti, il metabolismo energetico cellulare e 4,9,10,11,12. Diversi protocolli sono stati descritti per la purificazione di questi microdomini di tessuto epatico e cellule coltivate 13,14. Assunzione di metodi precedentemente pubblicati in considerazione, abbiamo adattato un protocollo per l&#39;isolamento dei mitocondri e MAMs dal cervello di topo adulto. Per questa procedura, abbiamo aggiunto un ulteriore passaggio di purificazione, cioè un estrazione Triton X100, che enables l&#39;isolamento del glicosfingolipide arricchito microdomini (GEM), frazione dei MAMs. Queste preparazioni GEM condividere componenti proteiche diverse con zattere caveolae e lipidi, derivati ​​dalla membrana plasmatica o altre membrane intracellulari, e si propone di funzionare come la raccolta punti per il raggruppamento delle proteine ​​recettori e per interazioni proteina-proteina 4,15.

Sulla base della nostra esperienza con l&#39;utilizzo di questo protocollo possiamo tranquillamente lo consiglio per l&#39;isolamento e la purificazione di MAMs, gemme e frazioni mitocondriali di cervello di topo. La procedura indicata è altamente riproducibile e coerente. In figura 1 si mostra una immagine rappresentativa dello strato modo puro mitocondri e MAMs su un gradiente Percoll (passo 3.4). A definito, banda lattiginoso contenente purificata mitocondri (Mito-P) segrega al fondo del tubo ultrac...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain at JoVE.com

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K Views.  St Jude Children's Research Hospital. Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.