Wir erkennen den Beitrag von Renata Sano in der Konzeption des ersten Protokolls. Ad&#39;A. hält die Jewelers Für Kinder (JFC) Stiftungsprofessur für Genetik und Gentherapie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse GM60905, DK52025 und CA021764, und den amerikanischen libanesischen syrischen Assoziierte Charities (ALSAC) finanziert.

<html> Das folgende Protokoll ist für die Isolierung und Aufreinigung von MAMs und Edelsteine ​​aus Maushirn bestimmt Lösungen für die Isolierung von Mitochondrien, MAMs und Edelsteine ​​benötigt Fraktionierung, um rohes mitochondrialen Präparation zu erhalten: Lösung A: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) Lösung B: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) MAMs Isolation: Isolierung Medium: 250 mM Mannit, 5 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA Gradient Puffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (Endkonzentration) GEMs Isolation: Inhalt &quot;&gt; GEM Extraction Buffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) GEM solubilisierende Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf). Ein. First Step subzelluläre Fraktionierung: Entfernen der Kerne, lysierten Zellen und Zelltrümmer <ol><li> Einschläfern Maus in CO 2-Kammer. </li><li> Umgehend entfernen Gehirn, halbieren, legen in 2 ml Röhrchen auf Eis und wiegen. </li></ol> Hinweis: Bewahren Sie Gehirnhälften separaten während des gesamten Verfahrens. Das gilt für die Behandlung von einem einzigen Gehirn Hälfte. <ol start="3"><li> Die Hälfte Gehirn in einer vorgekühlten 2 ml Glas Dounce Gewebe Mahlwerk mit 1 ml kaltem Lösung A. mit insgesamt 15 Schlägen eines großen Freiraum Pistill homogenisiert. </li><li> Transfer zu einem 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis und verdünnterHomogenate bis zu 10 Volumina w / v, z. B. 0,225 g bis 2,25 ml. </li><li> Zentrifuge Proben bei 1.400 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Transfer zu einem 30 ml-Rundkolben aus Glas Zentrifugenröhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, um das Pellet zu stören. </li><li> Resuspendieren des Pellets in der gleichen 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal. </li><li> Übertragen zu einem frischen 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 710 × g für 10 min bei 4 ° C. Dies führt zu einem Pellet von Kerne und Zelltrümmer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Pool mit dem Überstand in Schritt 1,6 gespeichert. </li></ol> 2. Zweiter Schritt: Crude Mitochondrien Isolation <ol><li> Zentrifuge Überstände bei 13.800 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen auf Eis </li><li> Pellet in 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal. </li><li> Zentrifuge nach Schritt 2.1. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,4. </li><li> Das resultierende Pellet ist eine angereicherte mitochondrialen Fraktion. Pool die Überstände (Cytosol und ER), mit Parafilm abdecken und auf Eis. </li><li> Das Pellet mit 6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill in 4,8 ml / g (g wird auf die ursprüngliche Gehirngewicht bezeichnet) der Lösung B, in einer frischen Homogenisator. </li><li> Verwendung von Glas Pasteurpipetten, bereiten einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Rohr, das Hinzufügen anschließend dem Boden des Röhrchens wie folgt, sorgfältig sichergestellt keine Blasen gebildet werden: Resupended Pellet (0,32 M Saccharose) 3 ml 850 mM Saccharose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1 M Saccharose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3) </li><li> Zentrifugieren bei 82.500 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Die resultierende Trennung am Ende des Gradienten wird erzeugen drei Bands und ein Pellet: 1) Myelin und anderen Kontaminanten Membran (0,32 M - 0,85 M-Schnittstelle), 2) ER, Golgi, Plasmamembranen (0,85 M - 1 M-Schnittstelle); 3) Synaptosomen (1 M - 1,2 M-Schnittstelle), 4) Rohprodukt Mitochondrien (Pellet), das für die nachfolgenden Reinigungsstufen verwendet </li></ol> 3. Isolierung von Mitochondrien-assoziierte ER Membran, MAMs <ol><li> Resuspendieren des frisch isolierten rohen Mitochondrien von einer Gehirnhälfte, in 2 ml Isolation Medium mit frisch hinzugefügten Protease-Inhibitoren. </li><li> Bereiten Sie eine 30% Percoll Gradienten mit Gradient Puffer 8 ml pro halbe Gehirn, und in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Tube. </li></ol> * Hinweis: Achten Gradientenpuffer konzentrierter (1,43 mal), um die korrekte Endkonzentration nach d zu erreicheniluting Percoll und 30%. <ol start="3"><li> Layer mitochondriale Suspension auf der vorbereiteten Gradienten langsam zu vermeiden Blasen. </li><li> Zentrifugieren bei 95.000 × g für 30 min, 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Entfernen Sie die schwere Fraktion (unteres Band) FIRST mit einem Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die leichte Fraktion (oberes Band) SECOND mit einem anderen Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem separaten frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis. </li></ol></li><li> Verdünnte beide Fraktionen in Schritt 3.5 mit 10 ml Isolationsmedium und Zentrifuge gesammelt bei 6.300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen des Überstands aus der schweren Fraktion in Schritt 3,6 erhalten wird, das Pellet mit weiteren 10 ml Isolationsmedium und zentrifugieren, wie in Schritt 3.6. Das resultierende Pellet wird die reine mitochondriale Fraktion sein. </li><li> Den Überstand aus dem Licht Fraction in Schritt 3,6 bis einem Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen erhalten, auf Eis. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Hinzufügen ausreichender Isolation Medium zu dem Überstand in Schritt erhaltenen 3,8, um das Rohr und Zentrifuge bei 100.000 × g für 1 Stunde, 4 ° C zu füllen Das resultierende Pellet wird die MAMs Bruch sein. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen. </li></ol> Hinweis: Bei diesem Schritt können Sie auch bei 100.000 xg zentrifugieren für 1 Stunde, 4 ° C wird der Überstand in Schritt 2,6 gespeichert. Das Pellet wird der ER-Fraktion sein, und der Überstand der cytosolischen Fraktion. 4. Extraktion von Glycosphingolipid angereichert Mikrodomänen, GEMs <ol><li> Lyse pure Mitochondrien und / oder MAM Fraktionen in 500 ul-1 ml Extraktionspuffer für 20 min auf Eis. </li><li> Zentrifuge Lysaten bei 15.300 × g für 2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Sammle Überstände (Triton X-100 löslichen Material) und re-Zentrifuge Pelletsfür 2 min zu entfernen verbleibende lösliche Material. (Triton X-100 extrahiert Mitochondrien und / oder Triton X-100 extrahiert MAMs). </li><li> Solubilisierung Pellets in Lösungsvermittler Buffer. Diese solubilisierten Materials stellt die GEM Fraktionen und können zur weiteren Analyse verwendet werden. </li></ol>

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	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. 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Keiner der Autoren keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entspre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENZIEN </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fraktionierung </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Bicarbonate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid, Hexahydrate </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid, Dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fraktion V, Heat Shock, Lyophilisat </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Gemeinsam </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitoren Tablets, Complete EDTA-free </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylen Konische Zentrifugenröhrchen, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Round-Bottom Glass Zentrifugenröhrchen </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge Röhren, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Einweg-Flaschen aus Glas Pasteur Pipetten, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten 1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca 2 +-Kanal als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs 4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca 2 + 4,5,6 untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca 2 +, und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca 2 +-Signalisierung, inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca 2 +-Homöostase durch Puffern zytosolischen Ca 2 +-Konzentration wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca 2 + 4,8 Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca 2 +-Signalisierung und Regulation der mitochondrialen Ca 2 +-Konzentration, Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle 4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen 13,14 beschrieben. Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen 4,15 funktionieren.

Basierend auf unserer Erfahrung mit der Verwendung dieses Protokoll können wir sicher empfehlen es für die Isolierung und Reinigung von MAMs, Edelsteine ​​und mitochondriale Fraktionen aus Mäusehirn. Das Verfahren wie oben in hohem Maße reproduzierbar und konsistent. In Abbildung 1 zeigen wir ein repräsentatives Bild des Weges pure Mitochondrien und MAMs Schicht auf einem Percoll-Gradienten (Schritt 3,4). Eine definierte, milchige Band enthaltenden gereinigten Mitochondrien (Mito-P) segregiert ...

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Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K Aufrufe.  St Jude Children's Research Hospital. Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.