Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health sovvenzioni R01HL089462 a SP.

1. Liposomi cationici Preparazione <ol><li> Autoclavare un matraccio pulito a fondo rotondo da utilizzare per la preparazione lipososmes. </li><li> Preparare soluzioni: <ol class="lalpha"><li> - Sciogliere 200 mg di dimetil ammonio bromuro dioctadecil (Doab) in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro. </li><li> - Sciogliere 200 mg di colesterolo in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro. </li><li> - Preparare e sterilizzare in autoclave a 5% di glucosio in 100 ml di RNA / DNA-asi acqua distillata gratuito. </li></ol></li><li> Risciacquare il pallone con il cloroformio. Aggiungere 5-10 ml al pallone, agitare e lasciare riposare per qualche minuto. Mantenere il matraccio coperto con un foglio di alluminio in ogni momento. Svuotare il cloroformio dal pallone. </li><li> Preparazione di liposomi: <ol class="lalpha"><li> - Aggiungere 315 ml di Doab magazzino soluzione al pallone. </li><li> - Aggiungere 200 ml di colesterolo soluzione madre al pallone. </li><li> - Aggiungere 9,5 ml di cloroformio nel matraccio unand mescolare con turbolenza. </li></ol></li><li> Impostare il rotavapor a 37 ° C, 100 rotazioni al minuto (rpm) o più (100-120 rpm). Il rotavapor deve essere collegato ad un controllo del vuoto acqua-pompa con un tubo di aspirazione collegato correttamente. </li><li> Collegare il serbatoio del gas argon e il rotavapor. </li><li> Collegare il pallone al rotavapor e regolare le impostazioni ottimali prima di abbassare nel bagnomaria. Aprire la prima valvola per l&#39;argon completamente in senso antiorario. Sempre aperto e chiudere la valvola prima. La seconda valvola controlla la pressione argon soffia al pallone. La pressione deve essere sempre gentile. </li><li> Abbassare la rotavapor nel bagnomaria, sufficiente per il pallone toccare l&#39;acqua senza essere completamente sommerso e accendere la velocità. </li><li> Attendere fino a quando tutti gli evapora il cloroformio, circa 10 min. Quindi arrestare la macchina. </li><li> Spegnere la velocità rotavapor e le valvole del serbatoio di argon. Ora il matraccio deve essere rimosso. </li><li> Aggiungere 2 ml di glucosio al 5% al ​​secolobeuta e per sciogliere i lipidi. </li><li> Gratta il fondo del pallone a fondo usando 1 ml di punta della pipetta per sciogliere tutti i lipidi. Dopo graffi, rimuovere ogni residuo lipidico dalla punta 1 ml nel pallone, se necessario, con una seconda punta. </li><li> Incubare la soluzione ottenuta in 42 ° C in bagno d&#39;acqua mentre lentamente vortex (15 rpm) la beuta. </li><li> Riempite la vasca sonicatore con acqua fredda. Sonicare la soluzione per almeno 20-30 min con la beuta retto e il fondo appena tocca l&#39;acqua. </li><li> Riscaldare il pallone in bagnomaria del rotavapor per 20 min a 42 ° C, a velocità zero, con il fondo rotondo immerso in acqua, questa volta. </li><li> Filtrare i liposomi attraverso un 0,47 micron e successivamente, 0,22 micron filtri per siringa. </li><li> Usando un piccolo estrusore, filtrare i liposomi attraverso una membrana 50 nm per generare una popolazione omogenea di unilamellari vescicole liposomiali. </li><li> Trasferire i liposomi di una provetta Eppendorf e posizionarlo sul ghiaccio. </li></ol><html> 2. Preparare i liposomi: siRNA-ITSN-1 Complessi <ol><li> Risospendere il on-target topo siRNA ITSN in tampone siRNA contenente HEPES 20 mM e cloruro di sodio 150 mM, pH 7,4, ad una concentrazione finale di 2 mg / mL. Tenerlo in ghiaccio prima della miscelazione. </li><li> Preparare i liposomi: siRNA complessi ITSN con un rapporto di 8 liposomi nmol RNA: 2 mg (o 400 liposomi nmol: 100 mcg siRNA ITSN). Nel presente studio, abbiamo aggiunto 50 ml di siRNA ITSN dalla soluzione madre (50 micron) per 100 ml di liposomi preparati al momento utilizzando un RNA / DNA-asi libera provetta Eppendorf. Si noti che la concentrazione di siRNA ITSN è molto importante perché un massimo di 150 pl di miscela può essere iniettato bilateralmente e retro-orbitale nel topo in una sola volta. </li><li> Conservare la miscela in ghiaccio in attesa di iniettare i topi. </li></ol> 3. Topo iniezione nella vena retro-orbitale (angolo interno della cavità oculare) jove_content &quot;&gt; Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida del Rush University Institutional Animal Care e del Comitato Usa. <ol><li> Anestetizzare il mouse per iniezione intraperitoneale di un mg / kg di peso corporeo ketamina 50 e 5 mg / kg di peso corporeo xilazina (miscela disponibile in commercio). A seconda del peso e l&#39;età degli animali, regolare il volume e la concentrazione di anestetici. I topi utilizzati nei topi di studio sono CD1 topi maschi, 6-8 settimane e pesano circa 25 grammi. Le siringhe sono tubercolina tipo 1 ml con l&#39;ago inserito. </li><li> Tenere le orecchie del mouse con una mano e ruotare il mouse su un lato per esporre l&#39;angolo interno dell&#39;occhio. Puntare mediale della plica semilunaris, evitare di toccare il bulbo oculare. </li><li> Avvicinare le caruncle lacrimali dell&#39;occhio tenendo la siringa contenente la miscela con un angolo di 45 gradi in tutti i tre assi. </li><li> Iniettare lentamente il composto e lasciare il mouse per recuperare con la parte iniettata in su. Se una grande liquidoforme di gocce nel luogo di inserimento dell&#39;ago, ritirare l&#39;ago, aspirazione indietro la goccia nella siringa e riprovare. Iniezioni ripetute sono fatto meglio alternando gli occhi, per consentire il recupero perfetto. Se non sei sicuro, questa tecnica può essere verificato iniettando colorante blu (50 pl, 0,5% di cristallo viola in metanolo) ed esponendo i polmoni del mouse per osservare la vascolarizzazione blu. </li><li> I topi in questo studio sono state iniettate ogni giorno 3 ° per 3 settimane senza incidenti mortali o effetti avversi. </li></ol> 4. Topo perfusione polmonare e Collezione tessuto per studi biochimici <ol start="0"><li> Impostare la pompa peristaltica di funzionare a 1,5 ml / min. </li><li> Preparare l&#39;ambiente: ventilatore, tavolo operatorio, strumenti, tamponi di cotone sterile, q-tips, stringhe, bicchieri, acqua distillata, equilibrato sale di Hank, tracciante. </li><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di miscela anestetica (100 mg / kg di peso corporeo ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina). </li&gt; <li> A livello del collo, rimuovere le ghiandole salivari ed esporre la trachea. </li><li> Inizia con laparotomia, accisa il diaframma, e seguire con toracotomia, esponendo i polmoni e il cuore. </li><li> Togliere il timo. </li><li> Utilizzando il microscopio ottico per una migliore precisione, cateterizzarla l&#39;arteria polmonare. </li><li> Fate tracheostomia e intubare il mouse usando la tracheostomia. Impostare il ventilatore ad una velocità di 150 colpi / min e volume tratto di 150 ml. </li><li> Come uscita, aprire l&#39;atrio sinistro. </li><li> Perfondere il mouse vascolare di polmone libera di sangue per 5 minuti, utilizzando la pompa peristaltica e la soluzione di Hank riscaldato a 37 ° C. </li><li> Perfondere il tracciante (8 nm oro-albumina 16) per ulteriori 10 min a parità di portata. </li><li> Lavare il tracciante non legato da 5 min perfusione polmonare con soluzione di Hank. </li><li> Seguite con fissazione in situ dei polmoni da 10 min perfusione del 4% (peso / volume), formaldeide, glutaraldeide al 2,5%, e l&#39;1% di acido tannico in 0,1 TUBItampone, pH 7,2. </li><li> Raccogliere i polmoni, rimuovere il tessuto eccessivo, tagliare piccoli blocchi (3/3 mm), e metterli in una fiala di scintillazione etichettato contenente 2 ml di miscela di fissativo. </li></ol> I topi scadranno completamente anestetizzato durante la procedura. 5. Polmone mouse Lavorazione tessuti per EM <ol><li> Preparare soluzioni: 1% Palade OsO 4, acetato veronal, e tampone Kellenberger. <ol class="lalpha"><li> - 1% Palade-oso 4 buffer contiene: 1 ml di acetato di magazzino veronal, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml di acido cloridrico 0,1 N, e acqua distillata fino a 5 ml di volume finale. </li><li> - Acetato soluzione di riserva veronal è ottenuta sciogliendo 1,15 g di sodio andydrous acetato e 2,94 g barbital in 100 ml di acqua distillata. </li><li> Soluzione-Kellenberger contiene 2 ml di acetato di magazzino veronal, 2,8 ml di acido cloridrico 0,1 N, 0,05 g di acetato di uranile, e 5.1 mldi acqua distillata, pH = 6. </li></ol></li><li> Lavare i blocchi polmonari in 0,1 M di sodio cacodilato tampone, pH = 7,4, brevemente 3 volte. </li><li> Fissare i campioni nel 4% (peso / vol) di formaldeide, glutaraldeide 2,5% in tampone PIPES 0,1, pH 7,2, per 1 ora, a temperatura ambiente. </li><li> Post-fissare con 1% Palade-osmio per 1 ora nel cofano, sul ghiaccio, al buio. </li><li> Risciacquare una volta con tampone Kellenberger. </li><li> Incubare i campioni in Kellenberger tampone per 2 ore a tutta la notte, a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare una volta in 50% di etanolo. </li><li> Disidratare con serie graduata di etanolo, 5 min / ciascuno: 70%, 95%, quindi 2 x 15 min al 100% di etanolo. </li><li> Passare a ossido di propilene al 100%, 2 x 15 min. </li><li> Rimuovere l&#39;ossido di propilene e aggiungere una miscela di ossido di propilene 50% e 50% Epon 812, incubare una notte, rotante su una ruota, a temperatura ambiente. </li><li> La mattina dopo, togliere il composto e aggiungere fresco Epon 812, almeno per 4-5 ore sulla ruota. </li><li> Utilizzando stampi conici raddoppiato, pienia metà strada con il fresco 100% Epon 812, aggiungere i campioni selezionati e metterli ai bordi. </li><li> Spostare gli stampi per l&#39;incubatore a 60 ° C e far loro cura per 48-72 ore. </li><li> Quando polimerizzato, inviare i blocchi per essere sottili (60-70 nm di spessore) sezionato. </li></ol>

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. 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Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sulla base di studi precedenti pubblicati da altri 9 e noi 1, 18 abbiamo sviluppato questa metodologia per il lungo termine abbattere di ITSN-1 in vivo per via endovenosa ripetuta (ogni 72 ore, per 24 giorni consecutivi) di specifici siRNA / complessi liposomi. Questo approccio sperimentale è efficiente, può essere utilizzato in modo sicuro e ripetutamente e può essere facilmente esteso per studiare il coinvolgimento di un gene che codifica una qualsiasi proteina di interesse in endotel...

Nudo siRNA non può penetrare la membrana cellulare, essendo di carica negativa, ed è facilmente degradata da enzimi nel sangue, tessuti e cellule. Recentemente anche con modifiche strutturali per migliorare la stabilità, l&#39;accumulo siRNA presso il sito bersaglio dopo somministrazione è estremamente basso e richiede un veicolo intracellulare efficiente 5. Liposomi cationici emersi come sicure acidi nucleici vettori con il potenziale per trasferire grandi pezzi di DNA / RNA in cellule incapsulando e proteggendo gli acidi nucleici da degradazione enzimatica 6. Inoltre, liposomi cationici interagiscono spontaneamente con il DNA / RNA, agevolando così il trasferimento genico nelle cellule 2. Più recentemente liposomi sono stati applicati per fornire vaccini e farmaci a basso peso molecolare 7. Consegna liposomiale di microRNA-7-esprimendo plasmide supera fattore di crescita epidermico recettore tirosina chinasi inibitore-resistenza in cellule tumorali del polmone 8. Quando ci si rivolge alendotelio vascolare, la consegna endovenosa è essenziale perché i complessi difficilmente attraversare la barriera endoteliale e stravaso in per nell&#39;interstizio 9. In confronto ad altri organi, ECS dal microcircolo del polmone hanno il maggior assorbimento e avidamente internalizzare liposoma cationico e DNA / RNA complessi, seguito dai linfonodi e placche di Peyer 9. La consegna per via endovenosa in modelli di roditori di siRNA tramite iniezioni vena retro-orbitale o la coda è stato dimostrato innocuo anche in alte concentrazioni, come ad esempio 50 mg / kg 10. Nella letteratura pubblicata la composizione di liposomi cationici differisce, in base alla formulazione lipidi ed il loro rapporto equimolare 11, 12. Vi è una vasta gamma di potenziali applicazioni utilizzando liposomi cationici per la consegna del gene in vivo, sia il targeting down-regulation/over-expression delle proteine, la consegna di vaccini o terapie anti-tumorali 13-15. Importante da ricordareè che l&#39;efficienza della membrana interazione DNA / RNA cellulare è regolata dal accoppiamento di forma fra i complessi generati e lipidi di membrana. Questo suggerisce che la composizione sartoria lipidi ai profili mirati membrana cellulare può essere utile e causare alti tassi di trasfezione in un particolare tipo di cellula 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Studi precedenti hanno mostrato che knockdown di ITSN-1s (KD ITSN), una proteina coinvolta nella regolazione endocitico polmone permeabilità vascolare e delle cellule endoteliali (EC) di sopravvivenza, la morte cellulare per apoptosi indotta, un ostacolo importante nello sviluppo di un sistema di coltura cellulare con prolungata ITSN-1s inibizione 1. Usando liposomi cationici come vettori, abbiamo esplorato il silenziamento del gene ITSN-1s nei polmoni del mouse con la somministrazione sistemica di siRNA mira ITSN-1 gene (siRNA ITSN). Liposomi cationici offrono diversi vantaggi per la consegna di siRNA: cassaforte con somministrazioni ripetute, nonimmunogenic, non tossico e facile da produrre 2. Prestazioni liposomi e attività biologica dipendono dalla loro dimensione, carica, lipidi composizione, la stabilità, la dose e la via di somministrazione 3 Qui, efficiente e specifici ITSN KD in polmoni topo è stata ottenuta utilizzando una combinazione ammonio bromuro dioctadecil colesterolo e dimetil. La consegna per via endovenosadi siRNA ITSN / cationico complessi liposomi transitoriamente abbattute proteina ITSN-1s e mRNA nei polmoni del mouse al giorno 3, che ha recuperato dopo ulteriori 3 giorni. Sfruttando i liposomi cationici come un vettore sicuro ripetibile, lo studio esteso per 24 giorni. Quindi, il trattamento retro-orbitale con complessi di fresco generato è stato somministrato ogni 3 giorni, inducendo sostenuta ITSN KD tutto lo studio 4. Topo tessuti raccolti in diversi momenti post-siRNA ITSN sono stati sottoposti ad analisi di microscopia elettronica (EM) per valutare gli effetti di KD cronica ITSN, in endotelio polmonare. Imaging ad alta risoluzione EM ci ha permesso di valutare le variazioni morfologiche causate da KDITSN nel letto vascolare polmonare (cioè rottura della barriera endoteliale, numero di caveolae e sovra-regolazione di vie di trasporto alternative diminuito), caratteristiche non rilevabili al microscopio ottico. Nel complesso questi risultati stabilito un importanteruolo portante di ITSN-1 nella funzione EC e l&#39;omeostasi del polmone, mentre illustra l&#39;efficacia della consegna del siRNA-liposomi in vivo.

Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA sono stati monitorati a diversi intervalli di tempo dopo la consegna di siRNA ITSN mediante Western blot e PCR convenzionale e quantitativa come in 4. Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA in siRNA polmoni del mouse ITSN trattati erano inferiori di circa il 75% con riferimento ai controlli durante atterramento continuo di ITSN-1s per 21 giorni. Senza ITSN-1s, dynamin-2, un importante partner interagenti del giocatore ITSN-1s ed essenziale in distacco caveo...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Ripetute iniezioni retro-orbitali di liposomes/siRNA/ITSN-1s cationici complessi nei topi, ogni 72 ore per 24 giorni, fornire in modo efficiente il duplex siRNA per il mouse microcircolo polmonare riducendo mRNA ITSN-1s e di espressione proteica del 75%. Questa tecnica è altamente riproducibile in un modello animale, non ha effetti collaterali ed evita infortuni mortali.

Silencing a lungo termine di Intersectin-1s in Polmoni mouse consegna ripetuta di un siRNA specifico tramite liposomi cationici. Valutazione degli effetti Knockdown al microscopio elettronico

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  Rush University. Ripetute iniezioni retro-orbitali di liposomes/siRNA/ITSN-1s cationici complessi nei topi, ogni 72 ore per 24 giorni, fornire in modo efficiente il duplex siRNA per il mouse microcircolo polmonare riducendo mRNA ITSN-1s e di espressione proteica del 75%. Questa tecnica è altamente riproducibile in un modello animale, non ha effetti collaterali ed evita infortuni mortali.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativo confocale e 3D microscopia elettronica di una cellula sensoriale specifico

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...