במודל סיליקוזיס העכבר המתואר שנוצר על ידי עירוי לייזר תוך כדי אבק סיליקה גבישי, כל השעיית CSD מספר פעמים דימה את התרחשות ופיתוח סיליקוזיס אנושי במידה רבה. שיטה זו חוסכת זמן וחוסכת ברמה, כמו גם מעשית ויעילה. יתר על כן, אינו גורם לפגיעה מכנית בדרכי הנשימה העליונות עקב הניתוח.
שיטה זו יכולה לשמש גם להכנת מודלים של מחלות של וירוסים, חיידקים, וכו '. מי שידגים את ההליך יהיה הנגבינג קאו, תלמיד כיתה אמן מהמעבדה שלי, המיומן בהכנת מודל עכבר הסיליקוזיס. התחל עם הכנת אבק סיליקה גבישי או CSD לפחות יום אחד לפני מתן טפטוף האף.
לשם כך, טוחנים סיליקה במכתש אגת במשך חצי שעה. כדי לבדוק את גודל החלקיק וצורתו, הכינו את הדגימה לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים או SEM באמצעות סרט מוליך כדי לקשור את חלקיקי הסיליקון. בעזרת מייבש שיער, נשפו בעדינות את החלקיקים שאינם מחוברים היטב לפני שהמשיכו לצלם את התמונה.
לאחר מכן, מערבבים את סיליקה הקרקע מלוחים סטריליים בריכוז של 20 מיליגרם למיליליטר באמצעות שייקר קולי. לבסוף, מערבל את מתלה CSD מוכן במשך 10 שניות. יש לתת 50 מיקרוליטר CSD לעכבר המורדם באמצעות טפטוף אף למשך ארבע עד שמונה שניות.
טפל בעכבר הבקרה עם כמות שווה של מלח, ולאחר מכן החזיק את גוף העכבר עם כף היד, צבוט את העור בחלק האחורי של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה תוך קיבוע הגפיים האחוריות של העכבר עם האצבעות האחרות. לחץ בעדינות על אזור פעימות הלב של העכבר עם האצבע המורה השנייה חמש עד 10 פעמים למשך חמש שניות. מחממים את רקמת הריאה המשובצת בפרפין על פלטה חמה בחום של 60 מעלות צלזיוס במשך יותר מארבע שעות.
כדי להסיר שעווה וללחח את החלק של הפרפין, השרו את המגלשה בקסילן למשך 30 דקות פעמיים, ואז טבלו את המגלשה ברצף במשך חמש דקות כל אחת באתנול נטול מים 95%85% ו-75%, ולבסוף, במים נטולי יונים, ואז הניחו את המגלשה בדלי מכתים המטוקסילין למשך 10 דקות לפני ששטפו בעדינות תחת מים זורמים במשך חמש דקות. טבלו אותו בדלי מכתים של אאוסין למשך 10 שניות. לאחר התייבשות הדגימה ב 75% 85% 95% ואתנול נטול מים במשך חמש דקות כל אחד, לנקות את קטע הרקמה על ידי טבילתו קסילן במשך חמש דקות, ולאטום אותו עם כ 60 מיקרוליטר של טיפות שרף ניטרלי.
הניחו בזהירות את שקופית הכיסוי מעל המקטע. לצביעת מאסון, יש להכתים את דגימות הפרפין המעוות והלחות בהמטוקסילין 50% של Weigert למשך 10 דקות, ולאחר השריית הרקמה באתנול חומצי למשך 10 שניות, שטפו את המגלשה בעדינות במים זורמים להדבקת גרעינים. לאחר מכן, להכתים את הדגימה עם טיפות של תמיסת כתמים אדומים במשך שבע דקות, ולשטוף עם 30% חומצה הידרוכלורית פתרון עבודה במשך דקה אחת.
לאחר טבילת המגלשה ב-95% אלכוהול למשך 20 שניות, יש לייבש את הדגימה באתנול נטול מים למשך שנייה עד שלוש שניות פעמיים, וכפי שהודגם קודם, לנקות ולאטום את הדגימה. עבור צביעה אדומה של סיריוס, יש לחדור לאזור נטול השעווה והלח למשך שעה אחת עם תמיסת צביעה אדומה של סיריוס, ולאחר מכן להכתים את גרעיני התא למשך שמונה עד 10 דקות עם תמיסת צביעת המטוקסלין של מאייר. שטפו אותו בעדינות תחת מים זורמים במשך 10 דקות לפני ייבוש, ניקוי ואטימה של המגלשה.
יש להחדיר את דגימת הפרפין ללא שעווה ולחות עם 30 מיליליטר של תמיסת אחזור אנטיגן EDTA של שלושה מיליגרם למיליליטר. מרתיחים את הדגימה במשך 20 עד 30 דקות לפני ששוטפים אותה במים נטולי יונים, ודגרים עליה ב-PBST למשך חמש דקות. השרו את הדגימה במשך 15 דקות בתמיסת מי חמצן טרייה שהוכנה 0.3%, ושטפו אותה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם PBST.
חדרו את קרום הדגימה למשך 15 דקות עם תמיסת טריטון 100 0.3%, וחסמו עם 30 עד 40 מיקרוליטר אלבומין בסרום בקר 5% או BSA למשך שעה אחת. לאחר הסרת תמיסת החסימה, יש להוסיף נוגדנים ראשוניים מדוללים כראוי NF-kappa B ו-CD-68, ולדגור על הדגימה למשך הלילה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בקופסה רטובה של מיקרוסקופ. למחרת, לאחר העברת הדגימה לטמפרטורת החדר למשך שעה, שטפו אותה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם PBST.
יש לדגור על הדגימה במשך שעה בארנב נגד עכבר חזרת פרוקסידאז המסומן נוגדנים משניים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימות שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם PBST, ולאחר מכן דגרו על הדגימה עם מצע DAB המתאים לאנזים המסומן בנוגדן במשך חמש עד 20 דקות. לאחר המרווה את התגובה עם מים deionized, נגד הדגימה במשך 30 שניות עם hematoxylin של Weigert.
שטפו אותו תחת מים זורמים למשך דקה, ייבשו, נקו ואטמו את הרקמה. לפני שתמשיך לניתוח כתם מערבי, הומוגניזציה של הרקמה עם RIPA פתרון עבודה על קרח במשך חמש דקות באמצעות מטחנה חשמלית כף יד. לדגור במשך שעה על קרח עם רעיד, וצנטריפוגה הומוגנט ב 14, 800 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
אספו את הסופרנטנט, וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חיץ העמסה פי 5 לסופרנטנט, ואז חממו את תמיסת אחסון החלבון של שישה מיקרוגרם למיקרוליטר שהוכנה עם RIPA באמבט מתכת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אחסנו 100 מיקרוליטר של תמיסת החלבון בכל צינור במינוס 80 מעלות צלזיוס.
עבור אלקטרופורזה, לדלל את aliquots לשניים עד שלושה מיקרוגרם למיקרוליטר עם RIPA lysate, ולאחר מכן להוסיף 20 מיקרוגרם של מדגם לכל באר כדי להפעיל את הג'ל. העבירו את החלבון לקרום PVDF שהופעל מראש עם מתנול למשך 20 שניות בשיטת העברה רטובה עם זרם של 400 מיליאמפר למשך שעה עד שעתיים. לאחר שטיפת הממברנה חמש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם תמיסת PBST, לחסום עם 5% BSA או חלב דל שומן למשך שעה אחת.
יש לטבול את הרצועות בתמיסת נוגדנים ראשונית המכילה NF-kappa B ובטא אקטין מדולל ב-5% BSA. נערו את הרצועות בעדינות למשך הלילה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס לפני ששטפו אותן עם PBST. לאחר מכן, לדגור על הרצועות, תחילה בנוגדן המשני המדולל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעד עדין, ולאחר מכן עם מפתח כימילומינסנציה משופר למשך שלוש דקות.
חשוף את הרצועה למצלמת ג'ל למשך 20 שניות ומדוד את הערך האפור של הרצועה כדי להעריך את רמת החלבון באמצעות תוכנת המערכת. תמונות SEM של CSD הראו כי החלקיקים היו בעלי צורה לא סדירה. צביעה אדומה של סיריוס שבוצעה למדידת שקיעת קולגן הראתה כי התקדמות פיברוזיס ריאתי בעכברים הואצה באופן משמעותי לאחר חשיפה ל-CSD במשך חודש.
מיקרוסקופיה מקטבת חשפה שלושה סוגים שונים של סיבי קולגן, מתוכם סיבי קולגן מסוג אחד המוצגים באדום מהווים גורם סיכון לסיליקוזיס, אולם לא נמצאה פיברוזיס משמעותי בקבוצת הרכב. זה צוין גם על ידי ציוני פיברוזיס בהתאמה. צביעת רקמת ריאה של עכבר שטופלה ב- CSD הראתה גושי סיליקה טיפוסיים המאופיינים בנמק נוזלי לאחר פגוציטוזה של CSD במרכז מוקף מקרופאגים בפריפריה.
צביעת מסון הראתה גם כי הגושים היו מועשרים ב- CSD מלווה בפיברוזיס. צביעת האימונוהיסטוכימיה של CD-68 חשפה עוד יותר את הנוכחות הרחבה של מקרופאגים ברקמת הריאה. מיקרוסקופ אור מקוטב הראה כי מקרופאגים אלה בלעו CSD, מה שגרם לפגיעה ריאתית חמורה.
צביעת אימונוהיסטוכימיה הראתה צביעת NF-kappa B גבוהה יותר, מה שמצביע על תגובה דלקתית גבוהה יותר בקבוצה שטופלה ב- CSD מאשר בקבוצת הרכב. כתם מערבי מייצג הראה גם כי לעכברים שטופלו ב- CSD היה ביטוי NF-kappa B גבוה יותר בריאה, וההבדל בביטוי בין שתי הקבוצות היה משמעותי. כדי למנוע חסימה נשימתית ולקדם התאוששות נשימתית, יש לעסות בעדינות את אזור הלב של העכבר חמש עד 10 פעמים כפי שהודגם לאחר תקופה של חמש שניות.
מודל זה יכול לחקור מנגנון בסיסי כלשהו של סיליקוזיס ולסייע בבדיקת תרופות טיפוליות, יחד עם קביעת פרמטרים מכריעים כמו מינון ומשך. טכנולוגיה זו מציעה אמצעי נוח, יעיל וחסכוני לחשוף מודלים של עכברים לחלקיקים בין אם הם מוסיפים חיידקים. ניטור התנהגות עכברים יכול לסייע בקביעת ההשפעות האפשריות של שאיפת חומר חלקיקי.
