עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק פיתוח מדען של איגוד הלב האמריקני (14SDG18160021 כדי הסתייגות), R01 NIH ארה ב מעניקה HL 81753 HL 107304 ל XX ואת לקרן מאיו XX.

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (הלאומי באקדמיות העיתונות-2011), הן אושרו על ידי מאיו קליניק טיפול חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.
1. הכנת דג זברה בגיר
<ol><li>להגדיר זוגות רבייה מספיק למעבר טנקים לרכוש לפחות כפול כמו הדגים הכולל לצורך הזרקת DOX. אם משווים דגים עם רקע גנטי שונה, מתרבים כל הדגים בתוך באותו שבוע כדי להבטיח בקרת תואמות גיל.</li>
	<li>לאסוף את העוברים דגים בבוקר שלמחרת, להעביר אותם ל 100 מ מ פטרי, ולשמור אותם בתוך חממה 28.5 ° C. לשמור על העוברים על צפיפות נמוכה (< 100 עוברי/צלחת פטרי).</li>
	<li>רענון המים העובר מדי יום כדי למנוע חוסר איזון סקס, להסיר באופן ידני את הביצים מת במועד באמצעות פיפטה של העברה.</li>
	<li>הזן את אותו המספר של העוברים בכל טנק (לדוגמה, בתחילה כל טנק בינוני עוברי/3 L 60) כדי להבטיח בקרת צפיפות התאים.</li>
	<li>להתחיל paramecia האכלה ב 4 ימים לאחר ההפריה (dpf).</li>
	<li>בדוק את הדגים מדי יום במהלך השלב לנוער. להתאים את מספר הדגים לפי הצורך כדי להבטיח דגים דומה בצפיפות.</li>
	<li>כאשר הדגים מגיעים בגיל 4 שבועות, להעביר עד 20 דגים לתוך טנק בינוני חדש אחד 3 L לצמיחה נוספת. להתחיל להאכיל את הדג עם שרימפסים המקווקו בשידור חי.</li>
</ol>2. הכנה ואיחסון של פתרון מניות DOX
הערה: DOX ניתן לרכוש מחברות ביו שונות. המתחם נרכשת בדרך כלל כאבקה במיכלים חום כהה.
<ol><li>ביסודיות להמיס את האבקה DOX במים מיוננים כדי להבטיח שגושים לא גלויים, עם ריכוז הסופי של 5 מ"ג/מ"ל כפתרון מניות. Aliquot 1 מ"ל של מניות DOX לתוך כל שפופרת מנעול כספת 1.5 mL. לעטוף את הצינורות 1.5 mL בנייר רדיד אלומיניום כדי להגן על DOX מפני חשיפה קלה. הערה: לבצע שלב זה ברדס כימי.</li>
	<li>שמור את הפתרון מניות DOX ב 4 ° C עבור אחסון. לאחסון לטווח ארוך (> 4 שבועות) של פתרון מניות DOX, לבצע את 3 המקטע אופציונלי המתוארים להלן.</li>
</ol>3. בקרת איכות של DOX באמצעות דג זברה עוברי (אופציונלי)
הערה: DOX הוא שני לחות אור-והרגיש, כך הוא יכול לאבד את יעילותה סמים עבור מידול DIC לאחר אחסון מורחבים. עבור DOX לרכוש מחברות שונות, או קבוצות שונות אפילו מאותה חברה, זה שימושי לכייל את יעילותה סמים באמצעות פראי-סוג (WT) דג זברה העוברים לפני ביצוע הניסויים על דגים למבוגרים. שיטה זו נגזרת של דג זברה שדווחה עובריים DIC דגם21.
<ol><li>לאסוף WT דג זברה עוברי לפחות 2 זוגות של דגים. Dechorionate עוברי-24 שעות לאחר ההפריה (hpf) באופן ידני באמצעות מזרק עם מחט מיקרו. לחלופין, התייחס העובר עם proteinase K-הריכוז הסופי של µg/mL 10 למשך 10-15 דקות בחממה 30 מעלות צלזיוס. רענן את המים העובר לאחר dechorionation. להסיר את עוברי המת ולשמור על עוברי לפחות 36 של כל אצווה.</li>
	<li>לדלל את הפתרון מניות DOX במים טריים העובר כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר. אמצעי האחסון של פתרון נמצא µL 100 עבור כל העוברים 3. מערבבים את הפתרון DOX מדולל על ידי מערבולת. הפתרון מדולל הסופי צריך להיות אור, צבע אדום.</li>
	<li>להוסיף 100 µL טוב של פתרון DOX מדוללת של צלחת נקי 96-ובכן שקוף.</li>
	<li>לקחת 3 עוברי dechorionated עם פיפטה העברת פלסטיק, ולשמור את העוברים קרובה לסוף של קצה פיפטה. מכניסים את הטיפ פיפטה מכל קידוח בעזרת DOX פתרון. תן סוף הטיפ לגעת הפתרון ולאפשר את העוברים לשחות לתוך הבאר. הערה: להימנע באופן ידני דוחף את העוברים, אשר להוסיף עוד מים לתוך הבאר, לדלל את הפתרון DOX.</li>
	<li>לרענן את הפתרון DOX ב 48 hpf. בזמן הזה, להתבונן הבארות תחת מיקרוסקופ עם 10 X הגדלה לזיהוי עוברי המת (הפסקת פעימות הלב) או עוברי עם בצקת. לספור ולהסיר כל העוברים מת במועד, אחרת העוברים הנותרים חשופים הפתרון עם עוברי המת יכול למות מהר גם כן.</li>
	<li>בדוק את העוברים-72 hpf ולספור אותם. הטיפול DOX נחשב "יעילות התרופה טובה" אם > 25% מוות (הפסקת דופק) יכול להיות שנצפו בשתי קבוצות של העוברים.</li>
</ol>4. הזרקת טרום הכנה
הערה: דגים של 8 שבועות כדי בגיל 6 חודשים משמשים להזרקה DOX. משקל הגוף (BWs) דג התבגר קריוטיפ אינדיאני פראי (WIK) כדי להיות מוזרק יכול לנוע בין 0.2-0.5 g.
<ol><li>מהר את הדג במשך 24 שעות לפני ההזרקה.</li>
	<li>עזים ומתנגד הדג עם העובר מים המכילים tricaine 0.16 מ"ג/מ"ל. להשתמש בנייר סינון נקיה לייבוש המים משני צידי הגוף. למדוד את BW של כל דג בקנה מידה. קבוצת דגים בתוך 10% הבדל ב BW יחד להזרקה מאוחר יותר. הערה: כדי למזער את עומס העבודה בשלב זה, דג בתוך 10% הבדל ב BW נחשבים באותה המידה; לכן, להכין אחד DOX הפתרון עובד לפי הממוצע שלהן BW.</li>
	<li>תכנית להחדיר כל דג בוגר 5 µL של פתרון. חשב את הריכוז בעבודה DOX לפי BWs ובמספרים דגים. הערה: ללמוד cardiotoxicity כרונית למעלה לחצי שנה, השתמש DOX במינון של 20 מ"ג/ק"ג. ללמוד cardiotoxicity חריפה של DOX, ניתן להגדיל את המינון DOX עד 50 מ"ג/ק"ג של BW.</li>
	<li>לדלל את המניה DOX 1 x של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) עבור ריכוזים עבודה המתאימה. מערבולת לערבב את הפתרון. בקצרה ספין למטה כדי לאסוף את הפתרון.</li>
</ol>5. DOX הזרקת בדגים הבוגרים
<ol><li>המקום נקי 100 מ"מ צלחת פטרי עם ספוג בפנים, מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, ואז להתאים את המוקד. חותכים את הספוג לעשות חור של כ 4 ס מ אורך להחזיק דג. לעשות חור יותר עבור דג גדול יותר.</li>
	<li>מכינים מחט 34 G עם 10 µL מיקרו-מזרק. יש לשטוף את המחט עם מאגר x HBSS 1 כדי להסיר את כל הבועות של רחובות מן המזרק אבובים.</li>
	<li>עזים ומתנגד של הדגים הבוגרים העובר מים המכילים 0.16 מ"ג/מ"ל tricaine למשך 2 דקות. הערה: ההרדמה ממושכת מעל 5 דקות ולאחריו DOX הזרקת יכולה בקלות לגרום דג המוות.</li>
	<li>משרים את הספוג במים העובר עם tricaine, ולהעביר את הדג על גבי הספוג להזרקה.</li>
	<li>
לבצע הזרקת IP DOX באמצעות אחת משתי השיטות המתוארות להלן.
	<ol>
<li>IP קלאסי הזרקת29<ol>
<li>מקם את הדג עם הבטן למעלה בחלל של הספוג. במהירות הוספה המחט, עם 45° זווית לגוף דגים לתוך האמצע בין הסנפירים האגן, ולחדור כ 1-2 מ מ. לשחרר לאט לאט כל פתרון DOX. חכי 5 s לפני הוצאת המחט. בדוק את המשלוח DOX באמצעות צבע אדום גלוי בבטן הדג.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הזרקת IP חלופית<ol>
<li>מניחים את הדג רוחבית על גבי הספוג עם הקדמי בצד ימין. בעדינות לייצב את הדג בעזרת מלקחיים הקהה של יד שמאל, והחזק את המזרק-המיקרו עם יד ימין.</li>
			<li>מקם את המחט מתחת לקו לרוחב מעל האגן סנפיר, עם שפוע פונה כלפי מעלה. מצביע על המיקום בשעה שבע בזווית של 45°, את המחט 3-4 מ"מ עד חלל דגים הממוקם בין של אגן הירכיים את הסנפירים אנאלי, ואז לאט לאט את הבוכנה. בדוק את המשלוח DOX באמצעות צבע אדום גלוי בבטן הדג.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>במהירות העברת הדגים מוזרק מעבר נקי למיכל מלא במים טריים מערכת כדי לאפשר את הדגים לשחזר. יש לשטוף את המחט פעם אחת עם מאגר x HBSS 1 בין זריקות.</li>
</ol>6. שלאחר הזרקת דגים ניהול
<ol><li>לאחר ההזרקה, להחזיר את הדגים למערכת עם הפעלת זרימת הדם. במידת האפשר, לשמור על דגים שטופלו DOX בנפרד מהמערכת המרכזית כדי למנוע זיהום צולב בין טנקים שונים המשתפים את זרימת הדם.</li>
	<li>מהר את הדג מוזרק עוד 24 שעות להתאוששות. לבחון את הדגים מדי יום במהלך השבוע הראשון. הסר את הדג מת במועד כדי למנוע זיהום דגים אחרים. הערה: דגים מותם בתוך 24 השעות הראשונות צפויות בשל נגעים פיזיים שנגרמו על ידי ההזרקה.</li>
	<li>עוד יותר לשמור על הדגים הדגיש DOX עבור תצפיות האורך. הסר דגים מתים בזמן כדי למנוע זיהומים אחרים דגים במיכל. הערה: מספרי דגים מתועדים ליצירת עקומת הישרדות.</li>
	<li>השתמש מבחני ניסיוני שונים כדי פנוטיפ הדג הדגיש DOX, כגון אקוקרדיוגרפיה30, תפקוד הלב כתב מהונדס קו23, שחייה אתגר26, כימות של שיפוץ פתולוגיים אחרים סמני23.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Octavia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiomyopathy:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutic+strategies.">Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).</li><li>Singal, P. K., Iliskovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiomyopathy.">Doxorubicin-induced cardiomyopathy.</a> N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).</li><li>Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-Induced+Cardiotoxicity:+Overview+of+the+Roles+of+Oxidative+Stress.">Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress.</a> Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).</li><li>Ichikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiotoxicity+of+doxorubicin+is+mediated+through+mitochondrial+iron+accumulation.">Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation.</a> J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).</li><li>Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+death+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).</li><li>Sawyer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracyclines+and+heart+failure.">Anthracyclines and heart failure.</a> N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+molecular+basis+of+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).</li><li>Dodd, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+cardiomyopathy+is+associated+with+a+decrease+in+calcium+release+channel+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+a+chronic+rabbit+model.">Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model.</a> J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).</li><li>Mitry, M. A., Edwards, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+induced+heart+failure:+Phenotype+and+molecular+mechanisms.">Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms.</a> Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).</li><li>Aminkeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coding+variant+in+RARG+confers+susceptibility+to+anthracycline-induced+cardiotoxicity+in+childhood+cancer.">A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer.</a> Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).</li><li>Deng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficiency+increases+the+susceptibility+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).</li><li>Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+Gene+Association+Studies+of+Anthracycline-induced+Cardiotoxicity:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).</li><li>Wasielewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+genetic+predisposition+for+anthracycline-associated+cardiomyopathy+in+families+with+dilated+cardiomyopathy.">Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy.</a> Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).</li><li>Lebrecht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexrazoxane+prevents+doxorubicin-induced+long-term+cardiotoxicity+and+protects+myocardial+mitochondria+from+genetic+and+functional+lesions+in+rats.">Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats.</a> Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).</li><li>QuanJun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+Dexrazoxane+against+Doxorubicin-Induced+Cardiotoxicity:+A+Metabolomic+Study.">Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study.</a> PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).</li><li>Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexrazoxane+in+the+prevention+of+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).</li><li>Adams, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Galphaq+signaling:+a+common+pathway+mediates+cardiac+hypertrophy+and+apoptotic+heart+failure.">Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).</li><li>Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;final+common+pathway&amp;#34;+hypothesis+and+inherited+cardiovascular+disease.+The+role+of+cytoskeletal+proteins+in+dilated+cardiomyopathy.">The &amp;#34;final common pathway&amp;#34; hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy.</a> Herz. 25 (3), 168-175 (2000).</li><li>Kroumpouzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pathways+for+primary+hypertrophic+and+dilated+cardiomyopathy.">Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy.</a> Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).</li><li>Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Etiologies of cardiomyopathy and heart failure.</a> Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visnagin+protects+against+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+through+modulation+of+mitochondrial+malate+dehydrogenase.">Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase.</a> Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).</li><li>Asimaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+modulator+of+the+intercalated+disc+in+a+zebrafish+model+of+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+target+of+rapamycin+attenuates+cardiomyopathies+in+adult+zebrafish.">Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish.</a> Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish.">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Nkx2.5-Calr-p53+signaling+pathway+by+hyperglycemia+induces+cardiac+remodeling+and+dysfunction+in+adult+zebrafish.">Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish.</a> Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).</li><li>Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+GATAD1-Associated+Dilated+Cardiomyopathy+in+Adult+Zebrafish.">Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+cardiac+recessive+mutants+via+expression-based+insertional+mutagenesis+screening.">Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening.</a> Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modifier+screen+identifies+DNAJB6+as+a+cardiomyopathy+susceptibility+gene.">A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene.</a> JCI Insight. 2 (8), (2017).</li><li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish.">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models.">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).</li><li>Desai, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+doxorubicin-induced+chronic+cardiotoxicity+in+the+B6C3F1+mouse+model.">Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).</li><li>Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+juvenile+doxorubicin-induced+cardiac+dysfunction.">A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction.</a> Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).</li><li>Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+cardiomyopathy.">Doxorubicin cardiomyopathy.</a> Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).</li><li>Bang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast-derived+microRNA+passenger+strand-enriched+exosomes+mediate+cardiomyocyte+hypertrophy.">Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy.</a> J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).</li><li>Rassaf, T., Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+diabetic+cardiomyopathy+-+putative+role+of+the+retinoid+receptor-mediated+signaling.">Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling.</a> J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).</li><li>Wahbi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dilated+cardiomyopathy+in+patients+with+mutations+in+anoctamin+5.">Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5.</a> Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).</li><li>Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-dependent+pathways+suppress+myocardial+cell+hypertrophy.">Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).</li><li>Hershman, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+cardiac+risk+factors,+and+cardiac+toxicity+in+elderly+patients+with+diffuse+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.">Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).</li><li>Silber, J. H., Barber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+doxorubicin-induced+congestive+heart+failure.">Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.</a> Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), (2009).</li><li>Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protocol+for+the+oral+administration+of+test+chemicals+to+adult+zebrafish.">A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish.</a> Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+adult+zebrafish.">Gavaging adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

המודל של DIC מתקדמת, המינון של 20 מ"ג/ק"ג DOX נקבע ניסיוניים בתור המינון הגבוה גורם המוות דגים משמעותית במהלך 1 wpi אבל עדיין תוצאות במוות דגים וצמצום של תפקוד הלב לאחר wpi 4 (איור 3 ו איור 4C). מנה זו משולה אלה המשמשות לעתים קרובות במודלים DIC מכרסמים (15-25 מ"ג/ק"ג), המינון ה...

דוקסורוביצין (DOX), גם בשם Adriamycin, פותחה כמו תרופה אנטי-אמצעים מאז שנות ה-601,2. עכשיו זה עדיין בשימוש פעיל בשם כימותרפית חשוב עבור קשת רחבה של גידולים. עם זאת, יישום קליני של DOX היה הקשו על ידי שלה רעילות למינון, במיוחד cardiotoxicity מאופיין על ידי הסימפטומים משתנים החל שינויים electrocardiographic ללא תסמינים דלקת כרום הלב ולא מפוצה קרדיומיופתיה 1 , 2. עד כה, הועלו השערות הגדולות לפחות שלושה להסביר DIC, כולל חמצן תגובתי מופעל מינים (ROS)1,3,4,5, עיכוב של טופואיזומראז II-β ( 6,TOP2β)7, ו אפנון של סידן תאיים שחרור1,8,9. לצבירת ראיות גם מרמזת על נטייה גנטית מהווה גורם סיכון מרכזי DIC10,11,12,13. זהויות גנים הקשורים נטיות אלה DIC, לעומת זאת, נותרים אינו מודע לקיומם. Dexrazoxane הוא היחיד אדג'וונט סוכן שאושרו על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול DIC, אבל עם יישום מוגבל14,15,16, דבר המלמד את הצורך לזהות נוספים אסטרטגיות טיפוליות. מודלים חייתיים של DIC נידונות ולכן למטרות אלו. בשל הנגישות שלהם ואת הפשטות, מחקרים מכניסטית בדגמים DIC יכול באופן פוטנציאלי יש רחבה יותר השפעות על סוגים אחרים של cardiomyopathies: פתוגנזה נפוצה עשוי להיות משותף בין cardiomyopathies של חבלות מסיבות שונות, במיוחד בזמן מאוחר יותר שלבים פתולוגיים17,18,19,20.
בנוסף מודלים מכרסם של DIC, פותחו מודלים DIC דג זברה עם תפוקה גבוהה יותר כדי להקל על הגילוי של גורמים גנטיים חדשים והן הרפוי. מודל DIC עובריים הוקם העוברים דג זברה שקוף לסינון תרכובות טיפולית21. בהתחשב בכך cardiomyopathies הן מחלות תחילת למבוגרים עם הפתוגנזה פרוגרסיב, קרדיומיופתיה דג זברה בוגרת מודלים כבר פיתח22,23,24,25,26. אנחנו שנוצר המודל רכשה הראשון הנובע אנמיה כרונית24, ואחריו DIC כמודל קרדיומיופתיה רכשה השני דג זברה בוגרת23של שריר הלב. מצאנו כי הזרקה של סיילין יחיד DOX לתוך דג זברה בוגרת המניע cardiotoxicity המורכב שלב אקוטי בערך בתוך 1 בשבוע שלאחר ההזרקה (wpi), בעקבות שלב כרונית של שריר הלב עד 6 חודשים לאחר ההזרקה. בעוד haploinsufficiency של מטרת rapamycin מכניסטית(mtor) המשפרת את שריר הלב בשלב כרוני, היא מגזימה תמותת דגים בשלב אקוטי, דבר המלמד את הערך של המודל DIC למבוגרים להבחין תלויי-שלב מנגנונים23. אנחנו עוד יותר הוכיח כי המודל DIC למבוגרים יכול לשמש כדי להדגיש אוסף של דג זברה insertional לב (ZIC) המוטנטים שנוצרו באמצעות גישה המבוסס על transposon מוטגנזה מכוונת insertional27. מסך פיילוט זיהה 3 גנים ידועים של שריר הלב, כמו גם DnaJ (Hsp40) homolog, תת משפחה B וחבר 6b (dnajb6b) כמו חדש DIC הרגישות גנים28. לכן, הדור של המודל DIC למבוגרים בדג זברה הוביל מתודולוגיה חדשה המאפשרת זיהוי ממגבילי גנטיים עבור DIC, אשר משלים את הגנום כולו האגודה קיים מחקר (GWAS) ואת לוקוס תכונה כמותית (QTL באופן שיטתי ) ניתוח.
בתקופת הדור, יישומו של המודל DIC דג זברה למבוגרים, הבחנו וריאציות משמעותית בקרב חוקרים שונים ו/או אפילו בין זריקות שונות שביצע החוקר אותו. הטבע האורך של המודל מטיל אתגרים רישום תוצאות של חוקרים שונים, את תהליך פתרון הבעיות רציפים. כדי להקל על השימוש פשוט בתדר קרדיומיופתיה מתח שיטה זו על ידי קהילת המחקר, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו בפירוט, נוכח שני סוגים של הזרקת ה-IP, ולדון שיקולים להפחית וריאציות בקרב חוקרים שונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crossing tank</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td>Fish breeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Maintaining embryo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L medium tank</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT280</td>
			<td>Maintaining fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paramecia</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131560</td>
			<td>Food for juvenile fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live hatched brine shrimp</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>Food for adult fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml safe-lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No. 022363204</td>
			<td>For drug storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1213104</td>
			<td>For preventing light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>No. 03115887001</td>
			<td>For dechorionating embryo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>Vehicle for DOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>431741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L NanoFil micro-syringe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34 gauge needle&#160;</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NF34BV-2</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Argent</td>
			<td>MS-222</td>
			<td>Anesthetizing fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3539</td>
			<td>For embryo drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Bel-art product</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For transfering embryo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish

דג זברה בוגרת גנטית נגיש (רזבורה rerio) יותר ויותר שימש כמודל חוליות להבנת מחלות אנושיות כגון שריר הלב. בשל הנוחות amenability כדי מניפולציות גנטיות תפוקה גבוהה, הדור של קרדיומיופתיה רכשה מודלים, כגון המודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה (DIC) בדג זברה למבוגרים, פותח את דלתות השדרות מחקר חדש, לרבות גילוי סימני פיסוק שריר הלב באמצעות בדיקה גנטית קדימה. שונה מהמודל DIC דג זברה עובריים, חריפה הראשונית והן לאחר מכן כרונית השלבים של שריר הלב יכול להיקבע במודל DIC דג זברה למבוגרים, המאפשרת לימוד מנגנוני איתות תלויי-הבמה אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, ניתן להשיג תוצאות משתנה עם המודל הנוכחי, אפילו בידי חוקרים מנוסים. כדי להקל על יישום העתידי של המודל DIC, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד ליצור מודל זה DIC בדג זברה בוגרת. ומתארות שתי דרכים חלופיות בקרום הבטן הזרקה (IP). בהמשך נדון אפשרויות כיצד להפחית וריאציות כדי להשיג תוצאות אמינות ואת לספק הצעות כיצד לפרש את התוצאות בהתאם.

כאן, שתי שיטות לביצוע הזרקה IP למודל DIC בדג זברה בוגרת מוצגים. תוך שימוש קלאסי, מבוססת IP הזרקת שיטת29, צוין כי הפתרון DOX מוזרק (צבע אדום) יכול לפעמים מתריסה החוצה מהמיקום שבו חדרו המחט. הזריקה IP חלופית משתמש במיקום שונה לתקוע מחט זה 3-4 מ מ בלבד הצפק איפה DOX הוא שוחרר ...

Watch this Scientific Journal Video about A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish at JoVE.com

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

מודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה בדג זברה למבוגרים

שיטה לייצר מודל קרדיומיופתיה דוקסורוביצין-induced למבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) מתואר כאן. שתי דרכים חלופיות של הזרקת בקרום הבטן מוצגים ואת התנאים כדי להפחית וריאציות בין קבוצות שונות ניסיוני הנדונים.

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

a-doxorubicin-induced-cardiomyopathy-model-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Views.  Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. שיטה לייצר מודל קרדיומיופתיה דוקסורוביצין-induced למבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) מתואר כאן. שתי דרכים חלופיות של הזרקת בקרום הבטן מוצגים ואת התנאים כדי להפחית וריאציות בין קבוצות שונות ניסיוני הנדונים.

Video: A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory and large scale clinical trials has revealed that diabetic complications progress unimpeded via the phenomenon of metabolic memory even when glycemic control is pharmaceutically achieved. Gene expression can be stably altered through epigenetic changes which not only allow cells and organisms to quickly respond to changing environmental stimuli but also confer the ability of the cell to "memorize" these encounters once the stimulus is removed. As such, the roles that these mechanisms play in the metabolic memory phenomenon are currently being examined.
We have recently reported the development of a zebrafish model of type I diabetes mellitus and characterized this model to show that diabetic zebrafish not only display the known secondary complications including the changes associated with diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and impaired wound healing but also exhibit impaired caudal fin regeneration. This model is unique in that the zebrafish is capable to regenerate its damaged pancreas and restore a euglycemic state similar to what would be expected in post-transplant human patients. Moreover, multiple rounds of caudal fin amputation allow for the separation and study of pure epigenetic effects in an in vivo system without potential complicating factors from the previous diabetic state. Although euglycemia is achieved following pancreatic regeneration, the diabetic secondary complication of fin regeneration and skin wound healing persists indefinitely. In the case of impaired fin regeneration, this pathology is retained even after multiple rounds of fin regeneration in the daughter fin tissues. These observations point to an underlying epigenetic process existing in the metabolic memory state. Here we present the methods needed to successfully generate the diabetic and metabolic memory groups of fish and discuss the advantages of this model.

Metabolic memory is the phenomenon by which diabetic complications persist and progress unimpeded even after euglycemia is achieved pharmaceutically. Here we describe a diabetes mellitus zebrafish model which is unique in that it allows for the examination of the mitotically transmissible epigenetic components of metabolic memory in vivo.

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Tachycardia-Induced Cardiomyopathy As a Chronic Heart Failure Model in Swine

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment methods. Here, we present such a model by tachycardia-induced cardiomyopathy, which can be produced by rapid cardiac pacing in swine.
A single pacing lead is introduced transvenously into fully anaesthetized healthy swine, to the apex of the right ventricle, and fixated. Its other end is then tunneled dorsally to the paravertebral region. There, it is connected to an in-house modified heart pacemaker unit that is then implanted in a subcutaneous pocket. 
After 4 - 8 weeks of rapid ventricular pacing at rates of 200 - 240 beats/min, physical examination revealed signs of severe heart failure - tachypnea, spontaneous sinus tachycardia, and fatigue. Echocardiography and X-ray showed dilation of all heart chambers, effusions, and severe systolic dysfunction. These findings correspond well to decompensated dilated cardiomyopathy and are also preserved after the cessation of pacing.
This model of tachycardia-induced cardiomyopathy can be used for studying the pathophysiology of progressive chronic heart failure, especially hemodynamic changes caused by new treatment modalities like mechanical circulatory supports. This methodology is easy to perform and the results are robust and reproducible.

Here, we present a protocol to produce tachycardia-induced cardiomyopathy in swine. This model represents a potent way to study the hemodynamics of progressive chronic heart failure and the effects of applied treatment.

טכיקרדיה-Induced קרדיומיופתיה כמודל אי ספיקת לב כרונית, חזיר

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac performance in the absence of hypertension, valvular, congenital, or ischemic heart diseases, and which may be related to infection, autoimmune or metabolic abnormalities, or family inheritance. It can progress into congestive heart failure with a poor prognosis. Doxorubicin (Dox) is widely employed as a chemotherapeutic drug, but its use is limited because it causes DCM-like changes of the myocardium. Its myocardial toxicity is attributed to oxidative stress, chronic inflammation, and cardiomyocyte apoptosis. A model of DCM exploiting these Dox-induced DCM symptoms has not been established.

Described is a protocol to establish a Doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy (DCM) model in mice via long-term intraperitoneal injection of Doxorubicin.

דגם מורין המושרה על ידי דוקסורוביצין של קרדיומיופתיה מונפשת ב- Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...