עבודה זו נתמכה על ידי מכון לאומי לבריאות DK083327 גרנט, וDK093491 (לSZH).

1. הכנת תאי לבלב acinar לסידן הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ הדגירה HEPES המכיל 20 HEPES המ&quot;מ, 95 מ&quot;מ NaCl, 4.7 מ&quot;מ KCl, 0.6 מ&quot;מ MgCl 2, 1.3 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 10 מ&quot;מ, גלוטמין 2 מ&quot;מ, ו1 × חומצות אמינו לא החיוניות בינוני מינימום של הנשר. התאם את הפתרון הסופי ל-pH 7.4 עם NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ דגירה BSA על ידי הוספת BSA (1% w / v סופי) עד 25 מ&quot;ל של חיץ הדגירה HEPES (כמתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ עיכול collagenase על ידי הוספת 1.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(200 יחידות / מ&quot;ל) מסוג 4 collagenase ו1 מ&quot;ג / מיליליטר מעכבי טריפסין סויה עד 6 מ&quot;ל של חיץ הדגירה BSA (שתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מ&quot;מ 22x22 חומצה לשטוף ידי טבילה בשני חלקי HNO 3 וחלק HCl אחד במשך שעה 2. ואז למזוג מים ובאמצעות חנות DI ב70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר אחד בחנק CO 2. אוריינט בעלי החיים במצב שכיבה, ולהכין את שטח הבטן על ידי CLEaning עם 70% אתנול. בצע laparotomy לחשוף את חלל הבטן. לנתח את הלבלב ולשטוף באופן מיידי בסירה קטנה המכילה 6 שוקלים מ&quot;ל של חיץ עיכול collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם לנתח את כל חתיכות גדולות של כלי דם או שומן נראים לעין, ולאחר מכן להסיר 5 מ&quot;ל של חיץ עיכול collagenase ולהוסיף אותו בחזרה לצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במספריים לנתיחה משובח טחון הלבלב בסירה הקטנה במשקל המכילה 1 מ&quot;ל של חיץ עיכול collagenase. בשר טחון עד לפתרון שהתקבל מופיע מפוזר באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוצר הטחון בבקבוק פלסטיק Erlenmeyer מ&quot;ל 125, ולהוסיף 5 מ&quot;ל הנותר של חיץ עיכול collagenase למכל. ודא הרקמה היא שקועה באופן מלא במאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולנער ב 90 סל&quot;ד למשך 30 דקות. במהלך תקופה קצרה זו של השבתה, להכין אגוניסטים הפעלת סידן (למשל caerulein, carbachol) ולשטוף את מכסה חומצת שטף מ&quot;מ 22x22התלושים עם מים די. יבש, ולאחר מכן למקם על גבי משטח שטוח בשורה של סרט מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות לעכל הושלם, להעביר את ההשעיה חזרה לצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולאפשר לתאים להתיישב. פיפטה בזהירות את חיץ עיכול collagenase ולהחליף עם 6 מ&quot;ל של חיץ הדגירה BSA. בתוקף ללחוץ את הצינור ביד למשך 10 שניות על מנת לפזר את התאים לקבוצות קטנות יותר. מייד עם רועד, להסיר כל פסולת גדולה, צוף מהתקשורת בלתי המוסדרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים שנותרו כדי להתיישב, ולהחליף את התקשורת עם חיץ הדגירה BSA טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.11 פעמיים, עד שההשעיה מורכבת רק קבוצות קטנות שהן רק דק גלויות לעין בלתי מזוינת. התאים צריכים להיות דומים לאלו שמתוארים באיור 1 א (בשורה העליונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ הדגירה BSA ולהחליף עם חיץ הדגירה HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 750 מיקרומטר, מניות 100X של Fluo-04:00 ב10% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את התאים בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל את ההשעיה התא וחיץ הדגירה HEPES ללא BSA. כדי לעשות זאת, להוסיף נפח מתאים (1:100 דילול) של פתרון המניות להשעית התא. לאחר מכן צלחת μl 500 של השעיה זו על כל coverslip מ&quot;מ 22x22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור coverslips בחושך בטמפרטורת חדר. קח Ca 2 + המדידות הראשון 30 דקות לאחר טעינה. הצבע יוסר באופן אוטומטי מהמדיום על התחלת זלוף, שאמור להתרחש 30 דקות לאחר טעינת צבע. </li></ol> 2. מדידת הסידן בתאי לבלב acinar <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל זלוף הגדרה עם מים די ולמלא עם כמות מתאימה של חיץ או אגוניסט. ראש כל מזרק עם חיץ או אגוניסט כדי להבטיח זרימה תקינה. הצמד מזרקים לטבעת עומד כ 1-2 מטרים מעל הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפינצטה העדינה לתפוס בזהירות מההשעיה שלו קצה אחד coverslip המכילה תא. הטה את המכסהלהחליק 45 °, ולאפשר למאגר העודף לברוח. מקם את coverslip על גבי אטם הגומי עם התאים על גבי coverslip, ולהרכיב את החדר (איורים 2 א ו -2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את תא זלוף לבמה ולהכניס את הצינור המכיל חיץ לכניסה הראשונה של החדר (איור 2 ג). הפעל את המזרק המכיל חיץ על ולאפשר לחיץ perfuse על כל פני השטח של coverslip. ברגע שהמאגר שהגיע בקצה השני של החדר, להוסיף קו ואקום ליניקת הוואקום. הכנס את כל צינורות אחרים (המכיל אגוניסט, מעכבים, וכו &#39;) למקומו המתאים שלהם לאורך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים או באמצעות, או אובייקטיבי 200X 400X 1.4 מספרי צמצם וארגון לייזר כדי לרגש את צבע Fluo-04:00 באורך גל של 488 ננומטר (איור 1 א, למטה). כוח ההגדרות של לייזר צריכים להיות מותאמות באופן שהצינור המכפיל (PMT) אינו רווי באור הנפלט. בנוסף, מתח על פני PMT צריך להיות מותאם לגילוי אור מרבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותות פליטה ארוכים לעבור של 515 ננומטר&gt; נאספים במהירויות מסגרת של 2-5 שניות / מסגרת להמחשה של דפוסי oscillatory איטיים ו0.2-0.3 שניות פריימים / המאפשר הדמיה מהירה יותר, גלי סיד הגלובליים (איורים 3 ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה הושלמה, סגור את המזרקים ולהסיר את כל צינורות. לפרק את התא וחזור על שלבי 2.2-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים כערכים מספריים של עוצמת הקרינה לאורך זמן והעברה לתמונת J (חבילת תוכנה המסופקת כתוכנה החופשית על ידי המכון הלאומי לבריאות וניתן למצוא <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתמונות סלולריות בזמן אמת ולזהות אזורים של עניין (ROIs, כלומר הפסגה, basolateral, גרעיני, וכו &#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את עוצמות הקרינה לROIs אלה וRepresent כעוצמת הקרינה בעוצמה / תחילת המחקר הקרינה (כלומר F/F0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור העתקים על ידי התוויית F f / 0 לעומת זמן. בנוסף להעתקים, תמונות נציג מסופקות בדרך כלל ומוצגות באמצעות pseudocolor. </li></ol> 3. הכנת תאי לבלב acinar למבחני פגיעה בתא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת חמה DMEM-F-12 (ללא פנול האדום) ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף BSA (0.1% w / v סופי), וHCl (50 מיקרומטר סופי) לתקשורת את ה-F-12 DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 50 מ&quot;ל של DMEM לתוך צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ collagenase על ידי הוספת 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(12 U / מ&quot;ל) של collagenase הסוג IV עד 10 מ&quot;ל של תקשורת בתוספת DMEM-F-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר אחד בחנק CO 2. אוריינט בעלי החיים במצב שכיבה, ולהכין את שטח הבטן על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בצע laparotomy לחשוף את חלל הבטן. לנתח את הלבלב ולשטוף באופן מיידי בסירה קטנה במשקל גontaining 6 מ&quot;ל של חיץ collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה באמצעות מספריים לנתיחה קנס עבור 3-5 דקות או עד לפתרון שהתקבל מופיע מפוזר באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמה הטחון בבקבוק 125 מ&quot;ל Erlenmeyer עם 5 מ&quot;ל של חיץ collagenase נוסף, ולאחר מכן למקום 37 ° C אמבט מים עם הרועד בסל&quot;ד 90 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרשימת שייקר, לאפשר לתאים להתיישב לזמן קצר, וחילופים עם 5 מ&quot;ל של חיץ collagenase טרי. ואז דגירה של 35 דקות נוספות ב 37 ° C אמבט מים עם הרעד ב90 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ resuspend לעכל באמצעות פיפטה העברה עד ההשעיה מופיעה הומוגנית ללא גושי תא ברורים. ואז בעדינות פיפטה ההשעיה התא דרך רשת ניילון מראש רטובה לתוך בקבוק חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ פיפטה 3 מ&quot;ל נוסף של תקשורת ה-F-12 DMEM טרי (עם collagenase) מבעד לרשת, על מנת לכפות דרך כל תאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6-10 מ&quot;ל נוסף של DMEM מדיה F-12 וllow התאים ליישוב במשך 2-3 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים, ולהסיר את supernatant לאחר לשטוף הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה טרי DMEM-F-12, resuspend התאים, ואת צלחת μl 500 של השעיה תא לתוך באר כל צלחת תרבית רקמת 48 היטב. התאים צריכים להיות דומים לאלו שמתוארים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הצלחת לשבת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 90 סל&quot;ד במשך 5 דקות לפני הוספת אגוניסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את התאים עם משתנה אגוניסטים במשך 2-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת בזווית כדי לאפשר לתאים להתיישב ופיפטה בזהירות aliquot של תקשורת (בדרך כלל 100 μl) והקפאת הבזק בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את ההשעיה התא הנותרת. הקפאת פלאש היא לא חיונית למדידות LDH. כפי שניתן שמרו לדגימות אלטרנטיביות על קרח, אם הם יהיו assayed באותו היום או לאחסן -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 4. מדידה דלף קטט דהידרוגנאז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lאני&gt; דהידרוגנז דליפת חומצת החלב מדוד (LDH), תוך שימוש בעיקר בחומרים הכימיים וההנחיות שסופקו בערכת 96 Promega CytoTox ללא רדיואקטיבי Cytotoxicity assay (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים ספציפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את מצע LDH (המסופק בערכה) עם 12 מ&quot;ל של חיץ assay (גם סיפק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי השעיה תא קפוא ודגימות תקשורת באמבט מים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת μl 50 של כל דגימת תקשורת בצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעית התא, להוסיף נפח ההכרחי של מאגר תמוגה 10X, כך שהריכוז הסופי הוא 1X. בקצרה מערבולת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות lysed ב 250 XG במשך 4 דקות לפסולת תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlysates התא, צלחת μl 50 של דילול 1:10 לבאר כל צלחת 96 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מצע משוחזר היטב כל אחד, דגירה את הצלחת בחושך בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידיהוספת 50 μl של להפסיק פתרון (מסופק בערכה) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד הספיגה ב 490 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנוסחות הבאות לחישוב זליגת% LDH. הצפיפות האופטית מתחת מתוקנות על ידי הפחתה מתוך קריאת OD ריקה מהיטב המכיל רק PBS, מצע, ולהפסיק פתרון. </li></ol> LDH בתקשורת = (מדיה OD492) X (גורם לדילול תקשורת) X (כרך של תקשורת) * מאז הוא בדרך כלל מיותר לדלל דגימות בתקשורת, גורם לדילול יהיה לרוב equal1. סה&quot;כ LDH = (X X (lysate OD 490) (גורם לדילול lysate) (כרך א בהשעית תא)) + (X X (מדיה OD 490) (גורם לדילול) (כרך של תקשורת aliquoted לדגימה)) <img alt="משוואת 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. הדבקה של תאי לבלב עם acinar Adenovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןתאי לבלב acinar כאמור בסעיף 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעד 3.12, להוסיף 10 יחידות 7 זיהומיות (IFUs) של אדנווירוס להשעית תא דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה צלחת 2 מ&quot;ל של השעיה תא בצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רוב בונה ביטוי, תאים צריכים להיות מספקת נגועים בתוך 18 שעות, ועבור חלק ממבני לוציפראז, רק בתוך 6 שעות. </li></ol>

<ol>
	<li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2++signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy.">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolar+and+submicromolar+Ca2++spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells.">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis.">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li><li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells.">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice.">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li><li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation.">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li><li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury.">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2++waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini.">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li><li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Ca2++wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells.">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li><li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling.">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis.">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca(2+)+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells.">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li><li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini.">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red.">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li><li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini.">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice.">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo.">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li></ol>

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

שיטת בידוד התא והמבחנים שלאחר מכן מתוארות כאן מייצגים כלים רבי עוצמה שבה ללמוד את התכונות הפיזיולוגיות וpathophysiological של הלבלב אקסוקרינית. השיטה לבידוד תאי לבלב acinar מפוזר תוארה לראשונה על ידי אמסטרדם וג&#39;יימיסון 11 בשינה 1972. השיטות שהוצגו כאן הותאמו משיטות הבידוד האחרונות יותר שתוארו על ידי ואן אקר ועמיתיו 12. למרות שטכניקות אלה הן שחזור מאוד ולמד בקלות, יש כמה תכונות קריטיות לכל שיטה שצריכה להתבצע באופן מדויק. הבנת פרטים טכניים אלה תאפשר ליישום בעיות ירי קל יותר ומשופר. בהכנת התאים למדידות סידן, גילה שהלבלב ממכרסמים צעירים מניב תוצאות עקביות יותר. את acini יותר יחולק בצורה שווה, ואולי משום שהם מכילים פחות רקמת fibro-שומנית. עבור<html> Ca 2 + מדידות, אנו מכינים acini קטן הדמיה תא בודד אופטימלית. זה דורש ריכוז collagenase גבוה (1.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​או 200 U / מ&quot;ל) בהשוואה לזה המשמש למדידות LDH. למדידות LDH, אנו מכינים acini גדול יותר מכיוון ששיטה זו פגיעתו פחותה, בתחילת מחקר. ההכנה, אם כן, מקבלת ריכוז collagenase נמוך יותר (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​או 91 U / ml). לCa 2 + מדידות, זה קריטי, כי תאים להיות מצופה על coverslips חומצת שטף. המטרה של החומצה לשטוף היא לספק משטח נקי, כמו גם אינטראקציות אלקטרוסטטיות שתאפשר דבקות המרבית של acini. תא טאק (BD Bioscience) יכול לשמש כתחליף או בנוסף לשיטה זו. בנוסף לכך, זה קריטי, כי Ca 2 + הצבע טעון בחיץ דגירה ללא BSA במטרה (1) כדי למנוע את הצבע מהכריכה לBSA ו( 2) כדי לאפשר acini לדבוק מקסימאלי לcoverslips חומצת שטף . t &quot;&gt; חדר זלוף תאר היה. תאים מסחריים שנועדו מותאמים אישית ומערכות זרימה, לעומת זאת, זמינים דרך מכשירים וורנר. בנוסף לזלוף, הקמת ואקום מוסדר כראוי מהווה גורם קריטי במניעת תאי acinar מלהיות שואבים את coverslip. כאשר מודדים אותות סידן מתאי לבלב acinar, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ confocal. Confocal הדמיה משתמשת בחריר מול צינור מכפיל כדי לחסל אור מעל או מתחת למישור המוקד. בניגוד לכך, הדמיה רחבה בתחום מזהה אור לאורך נתיב העירור של הדגימה, המאפשרת את המיקוד של אור (אור כלומר מעל ומתחת למישור הרצוי של מוקד) לזהם את תמונת הקרינה של הדגימה. היתרון של מיקרוסקופיה confocal מעל השדה רחב הוא שהיא מאפשרת הדמיה דק קטע של מדגם, כמו גם שחזור 3D של פרוסות אופטיות שנאספו לאורךציר ה-Z. בנוסף, מיקרוסקופיה confocal מספקת מערכות איסוף במהירות גבוהה אשר יכול ללכוד שינויים מהירים בקרינת סידן באמצעות דיסק מסתובב, סורק קו, סורק sweptfield, או אפילו אזורים המצומצמים מסורק נקודה. שינויים במרחב ובזמן סיד דפוסי איתות כגון גלים ותנודות, בהתאמה, ניתן למדידה מהימנה באמצעות חישוב 0 F / F, אבל זה לא אינדיקציה אמיתית של [Ca 2 +]. מדידות כמותיות של [Ca 2 +] ניתן לחשב באמצעות עירור אורך גל יחיד וצבעי סיד פליטה כגון Fluo-4, למרות שטעויות יכולות להתרחש במדידות אלה בשל photobleaching ולצבוע אובדן 13,14. [Ca 2 +] ניתן למדוד בצורה מדויקת יותר על ידי שימוש בצבעי ratiometric, כגון Fura2 או Indo1 15, אבל זה לא מעשי במיקרוסקופי confocal ביותר בגלל הדרישה של לייזר UV לעירור. מצד השני, concomitaשימוש NT של Fluo-3-4 או Fluo וFura, אדום יכול לאפשר יחס הדמיה באמצעות קו 488 ננומטר העירור שקיים ברוב המיקרוסקופים confocal 16. דליפת LDH היא כלי רגיש למדידת פציעת תא acinar 7,17. שיטה נוספת היא משלימה propidium ספיגת יודיד 18. זיהומי אדנווירוס להשיג שיעורי זיהום גבוהים בacini התרבותי 19. הריכוז של וירוס ייתכן שיהיה צורך טיטרציה. בנוסף, כדאי לספק תנאי בקרה דומים שבו מבנה adenoviral אחר רלוונטי גם נגוע. רוב מחקרי הזיהום שלנו האחרונים ב 12 שעות. עם זאת, לתקופות ארוכות יותר, ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת את DMEM-F12 בתחילת הדרך.

שינויים דינמיים בסיד cytosolic נחוצים לאירועים סלולריים acinar הן פיסיולוגיים ופתולוגיים. תופעות אלה מסתעפות של סידן נחשבות לנבוע מדפוסי מרחב ובזמן שונים של סידן איתות 1. לדוגמה, אנזים והפרשת נוזלים מתא acinar צמוד לקוצי סידן מאזור מוגבל של מוט הפסגה שבו ההפרשה מתרחשת 2. לעומת זאת, גל סידן גלובלי ואחרי אותות סידן שאינה oscillatory האינטנסיביים קשור לאירועים פתולוגיים מוקדמים שמובילים לדלקת לבלב חריפה 3,4. אלה כוללים הפעלת התוך acinar פרוטאז, הפרשת אנזים מופחתת, ופגיעה בתא acinar. המעבדה שלנו משתמשת מבודד לבלב acini ללמוד האירועים האלה תחילת פתולוגיים שיובילו למחלה גם in vivo ו במבחנה 5-7. השיטות, כמפורט כאן לתאר בידוד של תאי acinar העיקריים לצורך מדידת CYרמות הסידן tosolic ופגיעה בתא. שיטה לזיהום adenoviral של תאים אלה היא גם סיפק.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mice</td>
 <td>NCI</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3624-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3040-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M-8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C79</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextrose</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>1916-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G-8540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11140-050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>EM</td>
 <td>SX0593</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T-9003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbon Dioxide</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td> 124-38-9 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td>
 <td>Crystalgen </td>
 <td>26-0005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection kit</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14161-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td>LabChem</td>
 <td>LC222102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000, P100, P10 pipettes</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>FA10005P</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weighing boat</td>
 <td>Heathrow Scientific</td>
 <td>HS1420A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1020-2500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352095</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20170-293</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>22 x 22 mm glass coverslips</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>032811-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A483-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A142-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized water</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 x 18 mm coverslips</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>021510-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laboratory film</td>
 <td>Parafilm</td>
 <td>PM-996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luer lock</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>932777</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 ml syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>DG567805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 &frac34; gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>9328270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE50 tubing</td>
 <td>Clay Adam</td>
 <td>PE50-427411</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flat head screwdriver </td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM F-12, no Phenol Red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21041-025 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30.5 gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 CC syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>309603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml Erlenmeyer flask</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FB50025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh filter </td>
 <td>Nitex</td>
 <td>03-150/38</td>
 <td>150 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3548</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well tissue culture plate </td>
 <td>Costar</td>
 <td>3795</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td>7727-37-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytotoxicity assay kit</td>
 <td>Promega</td>
 <td>G1782</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adeno-GFP</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Gift from J. Williams</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring stand with clamps</td>
 <td>United Scientific</td>
 <td>SET462</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perifusion chamber</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum line</td>
 <td>Manostat</td>
 <td>72-100-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath with shaker</td>
 <td>Precision Scientific</td>
 <td>51220076</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>LSM 710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioTek Synergy H1 plate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>11-120-534</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>Nuaire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture Incubator</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>3110</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection

תא acinar הלבלב הוא תא parenchymal העיקרי של הלבלב אקסוקרינית וממלא תפקיד עיקרי בהפרשת אנזימי לבלב לתוך צינור הלבלב. זהו גם האתר לייזום של דלקת בלבלב. כאן אנו מתארים כיצד תאי acinar מבודדים מכל רקמת לבלב ואותות סידן תוך נמדדים. בנוסף, אנו מתארים את הטכניקות של transfecting תאים אלה עם מבני adenoviral, ולאחר מכן מדידת הדליפה של חומצת החלב דהידרוגנז, סמן של פגיעה בתא, בתנאים אשר יגרום לפגיעה בתא acinar במבחנה. טכניקות אלה מספקים כלי רב עוצמה כדי לאפיין acinar תא הפיסיולוגיה והפתולוגיה.

דוגמה של מדידות סיד סלולריים acinar בתגובה לגירויים פיסיולוגיים מסופקת באיור 3. תאי acinar היו עמוסים הסיד לצבוע Fluo-4 וperfused עם אצטילכולין האנלוגי carbachol (CCH; 1 מיקרומטר)) 8. תאים הגיבו בצורה של גל סיד אשר יוזם באזור הקודקוד ומתפשט לאזור basolateral 3,9. העתקי נציג המוצגים באיור 3 מדגימים את דפוס שיא הרמה הטיפוסי נצפה בדרך כלל עם carbachol 1 מיקרומטר. לעומת זאת, שימוש במינונים תת מקסימאלי של כולציסטוקינין האנלוגי caerulein (10 בלילה) מניב תגובות oscillatory סיד (איור 4) 10. דליפה של LDH מתאי acinar בתגובה לאגוניסטים דלקת לבלב וישכנע מוצגת באיור 5. כאן אנו מדגימים עליית ריכוז תלויה בדליפת LDH בנוכחות caerulein, carbachol, או לאהוא מרה חומצה גופרתי חומצת taurolithocholic-3 (TLCS). הריכוזים הדרושים על מנת לגרום לזליגה מקסימלי של LDH עולים בקנה אחד עם אלה הנדרשים כדי לגרום להפעלת פרוטאז התוך acinar ואיתות סיד פתולוגיים, דבר המצביע אירועים אלה עלולים להוביל לפציעה. תאי acinar נדבקו באדנווירוס כתב לוציפראז, כי הוא מונע על ידי האמרגן לגורם מורד Cn מפעיל, גרעין של תאי T מופעל (NFAT; איור 6 א). אנו מספקים נתונים מייצגים אימות זיהום השיטה שלנו, הוכחת עליית ריכוז ותלויה זמן בפעילות NFAT-לוציפראז בנוכחות TLCS (האיורים 6B ו6C). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig1.jpg" /> איור 1. נציג תמונות של תאי לבלב acinar folגעיית הכנות שונות. () תאי acinar מוכנים לCa 2 + מדידות, כפי שדמיינו בהגדלה 630X. בשורה עליונה מציגה מיקרוסקופ שדה בהיר, בשורה תחתונה מציגה תאי acinar עמוסים Ca 2 + הצבע Fluo-4 ו דמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. (ב) תאי acinar מוכנים למבחני cytotoxicity, כפי שדמיינו בהגדלה 400X. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig2.jpg" /> איור 2. . קאמרי perifusion () התא מורכב משלוש שכבות:. מתכת פשוטה; אטם גומי; וכיסוי פלסטיק (ב &#39;) אטם הגומי ממוקם על גבי המתכת וcoverslip מ&quot;מ 22x22 המכילה תאים מושם כלפי מעלה על גבי אטם הגומי. כיסוי הפלסטיק מוברג לבסיס המתכת וcoverslip מ&quot;מ 18x18 ממוקמת על גבי. (ג) הוא התא אזמאובטח על הבמה מיקרוסקופ. אבובים, מאגר המכיל או אגוניסט, מוזן לתוך פתחי הכניסה הממוקמות על קצו של החדר (חץ). צינורות נפרדים מובילים לואקום (ראש חץ). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig3.jpg" /> איור 3. אות סיד שיא רמה טיפוסית על גירוי עם carbachol (1 מיקרומטר). () משמאל לימין; תצוגת שדה מוארת של acinus כותרת ב() Pical ו (ב) אזורי asolateral עניין מתא acinar. תאים הועמסו עם מחוון סיד Fluo-4 (5 מיקרומטר). על הגירוי עם carbachol הפיזיולוגי (1 מיקרומטר; אח אנלוגי), התמונות הבאות מראות את תחילתו של אות הסיד באזור הפסגה ואחרי התפשטות לאזור הבסיס (ב) כל תמונה ספונת (1-4), מתאימה למסגרת. יחד עם נציג התחקות של שינוי בקרינה לאורך זמן עבור כל אזור של עניין. תמונות הןמיוצג בpseudocolor עם סולם צבעים (מימין למטה). חיצים שמאלה וימינה להראות זמן של עליית סיד הראשונה באזורי apical והבסיסיים, בהתאמה. נתון זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. (Orabi AI, AU שאה, Muili ק &#39;, י&#39; לואו, מחמוד SM, אחמד ע &#39;, ריד א, אתנול SZ חוסיין משפר הפעלת פרוטאז-Induced carbachol ומאיץ גלי סידן בacini לבלב חולדה המבודד. כתב העת לכימיה ביולוגית , 2 86, 14,090-14,097 (2011)). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig4.jpg" /> איור 4. תנודת סידן אופיינית על גירוי caerulein (10 בלילה). (א) שינויים בכל סיד cytosolic תא נמדדו פעם אחת לשנייה על ידי מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות באמצעות הסיד לצבוע Fluo-4 / AM. תמונות מוצגות בpseudocolor עם הצבע שלקייל (ימין למעלה). (ב) עלילת נציג של הקרינה לאורך הזמן נרשמה מתא בודד שטופל בcaerulein (10 בלילה) ב-pH 7.4. נתון זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. (ריד בבוקר, חוסיין &quot;ז, א זורק, אלכסנדר מ &#39;, א שאה, גורליק FS, pH תאי נמוך נתנזון MH גורם נזק בתא acinar הלבלב על ידי סידן שיפור איתות כתב העת לכימיה ביולוגית, 286, 1919-1926 ( 2011)). <img alt="איור 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig5.jpg" /> איור 5. מדידת פגיעה בתא מהתאים שטופלו באגוניסטים acinar דלקת לבלב וישכנע שונים. בתאי acinar מבודדים, דהידרוגנז דליפת חומצת החלב (LDH) שימש כדומחוון ochemical של פציעה. טופלו תאי acinar מבודדים עם ריכוזים שונים של () caerulein (1-100 ננומטר) (ב) carbachol (1 מיקרומטר -1 מ&quot;מ) ו (ג) TLCS (50-500 מיקרומטר), ו% דליפת LDH נמדד לאחר 2 משאבי אנוש. (N = 3). #, *, P &lt;0.05 לעומת השליטה וTLCS לבד, בהתאמה. <img alt="איור 6" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391fig6.jpg" /> איור 6. מדידת פעילות לוציפראז בתאי לבלב acinar הנגועים Adeno-NFAT-לוציפראז. () סכימה לזיהום של תאי לבלב acinar עכבר עיקריים עם הצטברות NFAT-לוציפראז. (ב &#39;) מנהל מTLCS (5-500 מיקרומטר) פעילות NFAT-לוציפראז המושרה. (C) כמובן זמן להפגין adenoviral של הארה עם TLCS (500 מיקרומטר) שניתנה על 6hr התקופה. (N = 3). *, #, P &lt;0.05, ביחס לשליטה או TLCS לבד, בהתאמה.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection at JoVE.com

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

אנו מתארים שיטת הכנה לשחזור של תאי לבלב acinar עכבר מעכבר לצורך בחינת אותות סיד סלולריים acinar ופציעה סלולרית עם גירויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית. שיטה לזיהום adenoviral של תאים אלה היא גם סיפק.

הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Google

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. אנו מתארים שיטת הכנה לשחזור של תאי לבלב acinar עכבר מעכבר לצורך בחינת אותות סיד סלולריים acinar ופציעה סלולרית עם גירויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית. שיטה לזיהום adenoviral של תאים אלה היא גם סיפק.

Video: Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

הערכת יכולת ההפרשה של תאי הלבלב Acinar

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

מדידות סוגר השופכה Cystometric או חיצוני בחולדות ער עם קטטר מושתל ואלקטרודות ומאפשר למדידות חוזרות

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...