עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם BSF בין ארה&quot;ב לישראל לתואר ראשונה וEDSBS היא חובה של כיסא פרופסור הילדה וססיל לואיס בגנטיקה מולקולרית.

הערה: נהלים מעורבים נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) במכון ויצמן למדע. הכנת .1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של acini הלבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 מ&quot;ל של HEPES בינוניים ביקרבונט קרבס-Ringer הטרי (KRBH) לפני שמתחיל. מערבבים 140 mM NaCl, 4.7 מ&quot;מ KCl, 1.16 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ CaCl 2, 11 מ&quot;מ גלוקוז, 10 HEPES מ&quot;מ. הוספת אלבומין בסרום שור (BSA) ומעכב 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​טריפסין הסויה (STI) (בינוני resuspension). הכן 5 - 10 מ&quot;ל של resuspension בינוני בתוספת Collagenase (~ 0.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל) (בינוני עיכול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן בינוני KRB ל~ 30 דקות. הוספת BSA אחרי חמצון כדי למנוע מבעבע. להביא מדיומים resuspension ועיכול ל37 C °. הערה: החמצון הבינוני מפחית את תמותת תאים ומשפר את ההיענות לsecretagogues. ההשפעה של חמצון היא לכאורה לפחות למשך 6 שעות. </li><li&gt; להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או CO 2 מחנק, על פי הנחיות טיפול בבעלי החיים מוסדיות. מניחים את החיה הקריבה על הגב שלה, לצרף אותו לכרית לנתיחה ולנקות את משטח הבטן עם אתנול. הערה: על מנת למנוע זיהום, חיטוי הכלים לנתיחה ומים המשמשים למדיום KRBH לפני השימוש. סנן בינוני KRBH דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. לפני הכריתה של הלבלב לשטוף הכלים נתיחה עם 70% אתנול ולבצע נתיחה על ספסל נקי. לבצע זיהומים נגיפיים בקבינט ביו בטיחות ברמת 3. הוספת אנטיביוטיקה לO / הבינוני culturing N (ראה סעיף 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריתת הלבלב העכברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך נרחב עור בטן ושכבה התת עורית. זהה את הכבד, קיבה, מעי, הלבלב וטחול (איור 1). הערה: בשלבים הבאים, לטפל ברקמת הלבלב בעדינות ולהימנע מהחלת forc המכני מוגזםדואר כדי למנוע אוטומטי עיכול של מות הרקמות ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי שימוש בשני מלקחיים בוטים, לשלוף את המעי הדק. התחל מהקצה הפרוקסימלי המעי הדק, בסמוך ליציאה מהבטן. הפרד את הלבלב מהמעי ולשמור אותו בתוך חלל הגוף. ברגע שמגיע למעי גס, שם לב רקמה ורוד / לבן חיבור. אל תבלבל אותו עם הלבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות כמה שיותר רקמת לבלב ככל האפשר מבלי איסוף רקמת שומן או חיבור. הסר את הלבלב על ידי ניתוקו מהטחול והקיבה וחיתוך כלי דם בבטן מתחתיה (איור 1 א-C). הערה: מאחר שהתשואה של acini לבלב מחיה אחת היא גבוהה, אפשר להימנע מלאסוף את כל רקמת הלבלב כדי למנוע איסוף רקמות אחרות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול Collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הלבלב כמה פעמים במדיום resuspension מחוממות ל37 מעלות צלזיוס ולהסיר חלקים הנותרים של אי לבלברקמות. לטבול את הלבלב ב~ 5 מ&quot;ל של מדיום עיכול מחומם מראש בבקבוקון נצנץ 20 מ&quot;ל. לרכך את הלבלב לחתיכות של 1-3mm. למקם אותו באמבט מים מחומם (בצורה אופטימלית תחת תסיסה של ~ 100 סל&quot;ד). כדי להאיץ את תהליך העיכול, פיפטה רקמה עד מתעכל ומטה אחת לכמה דקות. הערה: משך הזמן של עיכול collagenase תלוי בעיקר בריכוז collagenase ועל כמות הכוח מכאני מיושמת על הרקמה. שימוש ב0.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase כ 15 דקות וpipetting הרקמה עם טפטפת 5 מ&quot;ל קלקר עם 2 מ&quot;מ פתח כל 3 - 5 דקות, וכתוצאה מכך acini של 10 - 30 תאים. בעקבות עיכול, ההשעיה מופיעה עכורות המכילה חתיכות גלויות של רקמה. מאז יעילות collagenases משתנה בין סוגים מסחריים שונים והרבה, לקבוע את העיתוי של מערכת עיכול באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה וסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה מתעכל לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולסיים חפירהestion ידי הוספת 45 מ&quot;ל של מדיום resuspension. סנן את ההשעיה דרך גס (~ 1 מ&quot;מ) רשת מתכת לתוך צינור טרי. צנטריפוגה הזרימה דרך ב100 × גרם במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspended הלבלב מתעכל ב50 מ&quot;ל של מדיום resuspension. סנן את ההשעיה דרך רשת ניילון 70 או 100 מיקרומטר. צנטריפוגה כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר acini הצף, פגום, לבטל את supernatant וresuspend רקמת הלבלב ב3 - 5 מ&quot;ל של מדיום resuspension. החל 1 מ&quot;ל חלקים של acini הלבלב לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל מלא 7 מ&quot;ל של מדיום resuspension. לאפשר acini להסתפק ב2 - 3 דקות. לאסוף acini שהתיישב בחלק התחתון של הצינור עם טפטפת מ&quot;ל 1, וחזור על שלב זה 2 - 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה acini הלבלב תחת מיקרוסקופ אור או לנתח כדי לבדוק את מצבם. באיור 2, להתבונן על טוהר הבידוד ונזקים שנגרם לתאי duriבידוד ng. השתמש acini אלה באופן מיידי או תרבות עד 20 שעה. </li></ol></li></ol></li></ol> .2 עמילאז Assay ההפרשה הערה: assay הפרשת עמילאז משמש כמדד גלובלי ליכולת ההפרשה של acini לבלב. זו מושגת על ידי איסוף המדיום שבו acini הלבלב הודגרו, וקביעת פעילות עמילאז של המדיום, בדרך כלל על ידי שימוש בערכה מסחרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר תנאי ניסוי לבדיקה (לעומת למשל שאינו מגורה המגורה). השתמש לפחות שלושה משכפל עבור כל מצב. בנוסף, להוסיף סט של משכפל כדי לקבוע את התוכן הכולל הסלולרי עמילאז (מדגם &#39;סך הכל&#39;) ומערכת לפעילות עמילאז של המדיום (מדגם &#39;אפס&#39;). תווית צלחת רב גם שבassay יתקיים, ושני סטים של microtubes לכל אחת מהחזרות לשימוש. צלחת 12- או 24 גם: הערהים יכול לשמש כדי לפקח על 1 ו0.5 מ&quot;ל של השעיות acinar, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את acini פעמיים ב30 מ&quot;ל של מדיום resuspension KRBH דגירה אותם במדיום resuspension ל30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לצלחת רב גם להוסיף טיפת 10μl של secretagogue להגיע הריכוז הסופי המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> acini הלבלב להגיב לשיפוע של secretagogue באופן דו phasic. הריכוזים עם ערכי הפרשה אופטימליים הם 50 - 100 PM של כולציסטוקינין (CCK) ו1μM של Carbachol (איור 3 א) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף וresuspend acini במדיום resuspension. ודא שacini מופצים homogenously בכמויות שווים ההשעיה וaliquot של השעיה לתוך הצלחת רבות גם ולתוך microtubes כותרת total&#39; &#39;. דגירה את הצלחת ל30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. (רצוי באמבט מים תחת תסיסה קלה (~ 50 סל&quot;ד)). הערה: מספר acini המדויק עשוי להשתנות בין experiments אבל צריך להיות דומה בחזרות בתוך כל ניסוי. לפיכך, aliquoting המדויק של ההשעיה acini הוא קריטי להשוואה בין משכפל ותנאים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לייצר &#39;סך הכל&#39; ו &#39;אפס&#39; דגימות. צנטריפוגה microtubes &#39;סך הכל&#39; לכמה שניות ב5,000 × גרם ולהסיר 50 μl מsupernatant לתוך microtubes &#39;zero&#39; שכותרתו ומניחה אותם על 4 מעלות צלזיוס. Lyse acini בדגימות &quot;בסך הכל&quot; על ידי הוספת טריטון X-100 microtubes להגיע ריכוז סופי של 1%. מערבולת microtubes במרץ. הערה: Aliquote &#39;סך הכל&#39; משכפל דומה למשכפל של הניסוי. Lysing acini, מוביל לשחרור בסך הכל תוכן עמילאז. לחלופין, לאסוף את acini בכל מצב וlyse בסוף הניסוי, כדי לקבוע את התוכן הסלולרי של כל לשכפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את רוב i ההשעיה acinarn כדי הסט הראשון של microtubes שכותרתו מראש. צנטריפוגה microtubes לכמה שניות ב5,000 × גרם. מעבירים את supernatant לסט השני של microtubes שכותרתו מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay supernatant לפעילות עמילאז עם ערכה מסחרית. חישוב אחוזי עמילאז מופרשים. הערה: חשוב מאוד לקרוא את פעילות עמילאז בטווח ליניארי שלה. להציג את האחוז של עמילאז מופרש כאחוזים מעמילאז שוחררו מתוכן כולל ראשוני. הפחת את רמת עמילאז הרקע של מדיום מכל שלושה עותקים ולחלק אותו על ידי התוכן הכולל הראשוני דומה המנורמל. </li></ol> .3 הדמיה חיה של הפרשת לבלב הפרשה מacini הלבלב יכולה להיות במעקב באופן ישיר על ידי הדמיה לחיות. שימוש בצבעי ניאון שונים וחיישנים, הדמיה חיה מאפשרת האפיון של הפרשה ברזולוציה משנה הסלולר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום resuspension טרי מחומצן כמו שאניn צעד 1.1 ולהביא אותו ל37 ºC. הגדר את המיקרוסקופ, ואם מצוידים בבקר טמפרטורה, להתאים אותו ל37 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את תאי acinar ב30 מ&quot;ל של מדיום resuspension ולמקם אותם בשקופית זכוכית או פלסטיק. הערה: אם צבעי lipophilic ישמשו לתייג לקרום פלזמה שכותרתו עם צבעי lipophilic, להכתים את acini על כך שלא יותר מ 5 דקות כדי למנוע תיוג של קרומים פנימיים על ידי אנדוציטוזה. לאורך כל העבודה, להתמודד עם acini בעדינות ולהימנע pipetting מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבמיקרוסקופ, acini תמונת המורפולוגיה שלו ברור, ולהימנע מהדמיה של acini המציג blebs basolateral או וקואולות תאית. הוסף טיפת secretagogue חכם או על ידי שימוש בתא זלוף, או במהלך או מייד לפני תחילתו של הדמיה. הערה: עדשות הגדלה גבוהות עם פתחים מספריים גבוהים (למשל × 63 / 1.4 או × 100 / 1.4) מומלץ לבחון מבני subcellular. </li></ol> 4. O / N תרבות של הלבלב acini (טכניקת תרבית תאים חלופי) הערה: O / culturing N משמש לעתים קרובות לזיהום בנגיף Adeno. הזיהום מתבצע ב10 6 -10 7 pfu מ&quot;ל / ל9 - 16 שעות לפני הבדיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> acini לבלב תרבות עד 20 שעה. acini Resuspended מתקבל מלבלב יחיד ב25 מ&quot;ל מדיום תרבות (DMEM בתוספת עוברי עגל בסרום (FCS) (5%), נתרן פירובט (1%), אנטיביוטיקה (1%), L-גלוטמין (0.5%), BSA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וSTI (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ומחולק לחמש 10cm צלחות. להדביק acini עם וירוס בקבינט ביו בטיחות ברמת 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודגרות acini הלבלב ב37ºC באוויר humidified 5% CO 2. לאפשר acini להתאושש במדיום resuspension מחומצן ל30 דקות לפני הבדיקה שלאחר מכן 3,8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

חוץ תרבות vivo לשעבר, הגדרות חלופיות ללימוד הפרשת אקסוקרינית כוללות מיקרוסקופיה ומדידת intravital של נוזלים מצינור הלבלב. מיקרוסקופיה Intravital הוצגה לפעול גם בעכבר בלוטות רוק 10. שיטה זו יכולה להקליט את ההפרשה בזמן אמת בחיה שלמה, אבל מוגבלת ברזולוציה שלה ועל ידי האמצעי למניפולציה של רקמות אקסוקרינית. הערכת הפרשה על ידי איסוף נוזלים מצינור הלבלב הושגה בחולדות מורדמות 11. עם זאת, מאז cannulation של צינור הלבלב הוא קשה מאוד, הוא השתמש בשיטה זו רק לעתים רחוקות. לעומת הגדרות אלה, תרבות vivo לשעבר של acini הלבלב היא פשוטה, מהירה ומאפשרת אמצעי נגיש למעקב ולמניפולציה של התאים, מבלי להפריע לארגון של הרקמה שלמה 4,5. אף על פי כן, יש הגדרה זו חסרונותיו. לבלבתאי acinar הם עדינים בטבע ורגיש מאוד לשינויים בתנאי תרבות. מאז התאים נטענים עם אנזימי מפרקי חלבונים, הם נוטים תמוגה ומוות של תאים. כתוצאה מכך, תרבות זו היא קצרה מועד ובדרך כלל לא מחזיק מעמד מעל 20 שעה. זה תמיד הכי טוב כדי לזהות ולפתור בעיות כפי שהן עולות. הצעד מתודולוגית המפתח הוא לבודד acini לבלב שלם בלי סימנים משמעותיים של נזק לתאים ולתמותה. סימנים כאלה הם ברורים ממבט ראשונים, וכוללים פסולת מוגזמת תא וacini עם blebs basolateral או וקואולות תאית. בassay הפרשת עמילאז, נזק לתאים יביאו לנמוך מגורה / יחס הפרשה מגורה שאינו. כדי למנוע נזק כזה, מומלץ לטפל ברקמות בעדינות, להוסיף BSA וSTI למדיום, ולהעשיר אותו עם חמצן. לדוגמא, ללא חמצון, פריקת תא מוגזמת של מסכות עמילאז האפקט של גירוי secretagogue (איור3 ג). עם זאת, בשל שבריריותה של רקמת אקסוקרינית, כמה נזק לרקמות היא כמעט בלתי נמנעת - צריכים להיות מושלכים תכשירים כאלה. עבור assay הפרשת עמילאז, supernatant, אשר מכיל עמילאז מופרש אבל הוא ללא תאים, יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 - 2 ימים. supernatant זה אמור להיות assayed ידי ערכה מסחרית. ערכות זמינות רבות מסתמכות על מחשוף של מצע עמילאז מלאכותי והשחרור לאחר מכן של chromophore. לפיכך, ריכוזי עמילאז גבוהים יותר יובילו לשינוי מהיר יותר בצבע של הפתרון. מאז עמילאז מופרש סופו של דבר לשחרר את כל chromophore מהמצע, זה חיוני כדי לעקוב אחר התגובה לאורך זמן, ולהשתמש רק בנתונים שנאספו במהלך השלב ליניארי. הדמיה חיה של acini לבלב יכולה להיות חוויה מתסכלת לחוקר. הכנות תא מסוימות, במיוחד אלה של acini הנגוע, לא יכולות להיות מתאימות לחייםהדמיה בשל מורפולוגיה התפשרה של acini או לרמות לא מספקות של חיישני הניאון. גם בהכנות מתאימות, זה עלול לקחת זמן כדי לאתר דגימות מתאימות. כך הדמיה עשויה לדרוש זמן רב. Lifeact-GFP, בדיקה F-אקטין, היא 12 ראויים לציון. כלי זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של F-אקטין במהלך הפרשת לבלב עד 16 שעות לאחר הדבקה, ברמה של רזולוציה שלא ניתן הייתה להשיג בדגימות acinar קבועות. בנוסף, שימוש במעקב הבדיקה Lifeact אפשר אירועי exocytosis יחידים, כשלפוחית ​​zymogen לבלב עובר ציפוי אקטין זמן קצר לפני exocytosis 3,13. באופן קולקטיבי, כאשר משתלטים עליו, בטכניקות שתוארו כאן מציעות החוקר אומר להעריך את הפרשת לבלב, ועל ידי רתמת אותו לזהות משתתפי רומן בתהליך רב שלבים זה. בנוסף, לאור הדמיון המבני ותפקודי בין הלבלב ואיברי אקסוקרינית אחרים,ניתן ליישם את הטכניקות הללו לרקמות אקסוקרינית אחרות גם כן 3.

לבלב אקסוקרינית מהווה רוב המסה של הלבלב של היונקים והוא ייעודי לייצור והפרשה של אנזימי עיכול 1. היחידה התפקודית של לבלב אקסוקרינית, acinus, היא מקבץ של תאי האפיתל המהווה ומניות לומן משותף. על גירוי הורמונלי או עצבי, שלפוחית ​​מלאה באנזימים מועברות לתא שטח הפסגה, נתיך איתו ולגרש את התוכן שלהם לתוך לומן 1-3. אז האנזימים המופרשים מרוקנים על ידי קבוצה התגבשה של צינוריות למעי דק, שבו הם מאיצים את השבירה של מזון לחומרים מזינים. וידאו זה מדגים כיצד שלם acini מבודדים מכל הלבלב וכיצד ניתן להעריך את יכולת ההפרשה שלהם. באמצעות התקנה זו, הפרשת לבלב היא לכמת על ידי מדידת הכמות היחסית של עמילאז ששוחרר בעקבות גירוי. לחלופין, הפרשה ניתן הדמיה חי על ידי השימוש בשונהחיישנים וצבעים. התקנת vivo לשעבר של acini הלבלב היא יתרון שכן acini המבודד, אשר שומר על מאפיינים רבים של הלבלב שלם, ניתן להשפיע ופיקוח בקלות רבה יותר מאשר בכל בעלי החיים 4-6. התקנה זו פותחה במקור בסוף שנת 1970 והייתה מאז להארכה למחקר של כמה רקמות אקסוקרינית כגון הרוק ובלוטות החלב 3-7. יש לציין, שהוא מאפשר לימוד ההפרשה עם הפרעה מינימאלית לארגונים הסלולריים המורכבים האפיתלים מקוטבים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

תאי acinar לבלב לייצר ולהפריש אנזימי עיכול. תאים אלה מאורגנים כצביר אשר מהווה ומניות לומן משותף. עבודה זו מדגימה כיצד יכולת ההפרשה של תאים אלה יכול להיות מוערכת על ידי התרבות של acini המבודד. ההתקנה היא יתרון שכן acini המבודד, אשר שומר על מאפיינים רבים של לבלב אקסוקרינית שלם ניתן להשפיע ופיקוח בקלות רבה יותר מאשר בכל בעלי החיים. בידוד נכון של acini הלבלב הוא דרישת מפתח, כך שהתרבות vivo לשעבר תייצג את הטבע בvivo של acini. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד acini שלם מהלבלב של העכבר. בהמשך לכך, בשתי שיטות משלימות להערכת הפרשת לבלב מוצגות. Assay הפרשת עמילאז משמש כמדד גלובלי, תוך הדמיה ישירה של הפרשת לבלב מאפשרת האפיון של הפרשה ברזולוציה משנה הסלולר. באופן קולקטיבי, טכניקות presenטד כאן מאפשר קשת רחבה של ניסויים כדי ללמוד הפרשת אקסוקרינית.

acini הלבלב שבודדו כראוי להציג מורפולוגיה סטריאוטיפית כאשר נצפים על ידי אור מועבר. תחומים basolateral שלהם צריכים להופיע בסיבוב ונטול blebs. תחום הפסגה מוקף במאות שלפוחית ​​הפרשה ומופיע בצבע כהה (איור 2 א, ב &#39;). הגרעינים נמצאים בסיס לאזור לפוחי. פסולת תא ומרכיבים של מערכת ductal לבלב ושל הלבלב האנדוקרינית, אשר ניתן לאתרם בבידוד acini (איור 2 ג, ד) בשלבים מוקדמים, צריכה להיות נעדרה מהשעית acinar הסופית (איור 2 א, ב &#39;). בידוד נאות עלול לגרום לדור של blebs basolateral ושבירה של תאים אשר שחרור העיכול שלהם אנזימים לתוך המדיום (איור 2E, F). שחרור עמילאז מacini הלבלב מתאר עקומה דו phasic כאשר זמם נגד הריכוז של secretagogues (איור 3 א). Wגירוי ithout כ -5% מהתוכן הראשוני הוא שוחרר במהלך 30 דקות של דגירה. בעקבות גירוי, מספר זה גבוה בשיעור של עד 5 פי. Acini שהיה O תרבותי / N, להציג יחס נמוך יותר של גירוי לעומת שחרור עמילאז בסיסי בהשוואה לacini מבודד טרי. חשוב לציין, acini התרבותי שנדבקו בוירוסי Adeno להציג הפרשת עמילאז בסיס גבוהה ורגיש מגורה הפרשה (איור 3 ב, ג). זה ובכך קריטי כדי להדביק acini שליטה עם מנה דומה של וירוס שליטה. הדמיה חיה של acini צריכה לאפשר זיהוי ברור של תחומים basolateral ופסגה של תאי acinar. צבעי lipophilic יכולים להיות אינסטרומנטלי להבחנה בין תחום הצר הפסגה וההיבטים הרוחביים וbasolateral של התאים (איור 4). תחת גירוי פיסיולוגי, הפרשה מכוונת באופן בלעדי למשטח פסגת 1,9. שימוש בבדיקת F-אקטין Lifeact-GFPמאפשר הדמיה חיות של שלפוחית ​​הפרשה, שכן שלפוחית ​​zymogen לבלב עוברת ציפוי אקטין זמן קצר לפני exocytosis (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig1highres.jpg" width="400" /> לוקליזציה .1 איור של הלבלב ואיברים סמוכים. (AC) הלבלב והאיברים סמוכים לאחר החתך של עור הבטן ושכבה התת עורית (), לפני ואחרי הפרדת לבלב מאיברים שכנים, (ב) ו (ג), בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51799/51799fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 בידוד של acini לבלב. (א) ו (ב) הלבלב acini מבודד להציג מורפולוגיה סטריאוטיפית כראוי; תחומים basolateral להופיע בסיבוב נטול blebs ו, ואילו תחום הפסגה שלהם מוקפים במאות שלפוחית ​​הפרשה ומופיע בצבע כהה (חץ). (C) ושל (ד) פסולת נייד ורכיבים של המערכת של צינוריות הלבלב ניתן לאתרם בבידוד acini שלבים המוקדמים (נקודות חצים כדי צינור אקסוקרינית). (E) ו( F) תוצאות בידוד לא נכונה בדור של blebs basolateral (E, חץ), ושבירה של תאים, אשר פריקת העיכול שלהם אנזימים לתוך המדיום ( F, חץ). ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51799/51799fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 מדידה של שחרור עמילאז מacini המבודד. () שחרור עמילאז מacini הלבלב מתארת ​​עקומה דו phasic כאשר זמם נגד הריכוז של secretagogue. Acini היו מבודדים ועזב להתאושש במשך 30 דקות לפני גירוי עם הריכוזים מצויינים של כולציסטוקינין (CCK). תוצאות מייצגות את הממוצע וSEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים. (B) acini שהיו O התרבותי / N, להציג יחס נמוך יותר של גירוי לעומת שחרור עמילאז בסיסי בהשוואה לacini מבודד טרי. acini התרבותי שנדבקו בוירוסי Adeno להציג הפרשה גבוהה בסיסית עמילאז והפרשה עוררה רגישה. (C) ללא חמצון תנאי התרבות יובילו לdi מוגזםscharge של עמילאז, שמסכות האפקט של גירוי secretagogue. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4 הדמיה חיה של הפרשת לבלב. בשידור חי מגורה תאי acinar, להביע Lifeact-GFP (LA, ירוק, אפור) ומוכתם בצבע lipophilic FM4-64 (אדום). שימוש בבדיקת Lifeact מאפשרת הדמיה חיות של אירועי היתוך יחידים של שלפוחית ​​מצופה אקטין (חיצים). תאים נדבקו O / N עם אדנווירוס-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), מוכתמים ומגורה קצר עם CCK 100 PM לפני תחילתו של הדמיה. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51799/51799fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

acini לבלב המבודד לשמור המורפולוגיה שלהם in vivo ופעילות ומציע דרכים רבות עוצמה לניטור וטיפול הפרשה. עבודה זו מדגימה כיצד ניתן לבודד acini מלבלב העכבר, וכיצד ניתן להעריך את יכולות ההפרשה שלהם.

הערכת יכולת ההפרשה של תאי הלבלב Acinar

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

assessing-the-secretory-capacity-of-pancreatic-acinar-cells

Google

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  Weizmann Institute of Science.  acini לבלב המבודד לשמור המורפולוגיה שלהם in vivo ופעילות ומציע דרכים רבות עוצמה לניטור וטיפול הפרשה. עבודה זו מדגימה כיצד ניתן לבודד acini מלבלב העכבר, וכיצד ניתן להעריך את יכולות ההפרשה שלהם. 

Video: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

השתלת איי הלבלב לקופסית הכליה בעכברים סוכרתיים של

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

פונקצית phenotyping עכבר ריאתי<em&gt; In vivo</em&gt; עם קיבולת הריאות לשדר

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

כימות פיגמנט רשתית, אפיתל, פגוציטוזה והצטברות ליפופוסצין;

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

מחבר זרקור: מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...