Somos gratos ao Dr. Thierry Pourcher por nos permitir usar o espectrômetro de fluorescência e por sua ajuda. O laboratório é financiado pelo Ligue Nationale Contre le Câncer (équipe labellisée), a Associação pour la Recherche contre le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du (INCA), a Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programa da UE FP7), o Centro A. Lacassagne, o Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e da Universidade de Nice ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Agradecemos ao Dr. M Christiane Brahimi-Horn para a leitura crítica e correção editorial.

Titulação Bioquímica de glicogênio 1. A lise celular <ol><li> Células de sementes a uma concentração de 0,5-2 x 10 6 por 100 prato mm de diâmetro. </li><li> Tratamento: incubar células 24, 48, ou 72 horas em baixa concentração de oxigênio (hipóxia), em uma estação de trabalho anaeróbio Bug-Box (Ruskinn Tecnologia Biotrace International Plc, Bridgend, Reino Unido), fixado em 1% ou 0,1% O 2, 94% ou 94,9% de N 2, e 5% de CO 2. Em paralelo, as células incubar em normoxia (21% de O2, 5% de CO 2). Mudança de meio (meio contendo glicose 25 mM) a cada 24 horas para minimizar as variações na concentração de glicose durante o tempo da experiência. </li><li> Após o tratamento, as células de lavagem 2x com PBS para remover vestígios de glicose a partir de meio de cultura. Raspe as células em PBS frio. </li><li> Centrifugar a solução a 1.000 rpm durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e lava-se o sedimento uma vez com PBS. O sedimento pode ser congelada a -20 ° C, antes de prosseguir.</li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de água destilada. Adicione 100 ml de glicogênio Hidrólise buffer fornecido com o glicogênio Assay Kit (Abcam). Ferver o lisado a 95 ° C durante 5 minutos para inactivar as enzimas. </li><li> Vortex e centrifuga-se o ligado a 13.000 rpm durante 10 min para remover os produtos insolúveis. Manter o sobrenadante. </li><li> Para normalizar os níveis de glicogénio para o teor de proteína entre as amostras, a quantificação de proteínas pode ser feito com 25-35 ul do sobrenadante utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA-Interchim). </li></ol> Algum do lisado pode ser utilizado para medir a concentração de glicose livre no interior das células. 2. A hidrólise de glicogênio <ol><li> Misturar 50 ul de sobrenadante (passo 1) com 1 ml da mistura de hidrólise enzimática. Esta mistura contém glucoamilase. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> A curva de calibração através da diluição do padrão de glicogénio (2 mg / ml) supplied com o kit, a uma solução de 10 ug / ml no tampão de hidrólise. Em seguida, preparar seis tubos separados, com 0, 4, 8, 12, 16, e 20 l de 10 ng / ml de padrão e ajustar cada tubo para um volume final de 50 ul com tampão de hidrólise para se obter uma concentração de glicogénio de 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16, e 0,2 ug / ml. Adicionar 1 ml de mistura de hidrólise de enzima nas normas e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> A concentração de glucose no fundo da linha de células, dada em termos de valor para a concentração de glicose livre, deve ser subtraído do valor para a concentração total de glicose (glicose a partir da hidrólise de glicogénio + livre de glucose) para determinar o nível de glicogénio na célula. 3. Desenvolvimento e leitura de fluorescência <ol><li> Para cada condição, preparar um tubo (tubo 1) para medir a concentração de glicose livre e dois tubos (tubos 2 e 3) para medir a concentração total de glicose (cada sagacidade tuboha volume diferente de glicogênio hidrolisada). </li><li> Adicionar 15 ul de sobrenadante extraído no final do passo 1 no tubo 1. Adicionar 35 ul de tampão de hidrólise para completar a um volume final de 50 ul. Fluorescência obtida dará a concentração de glicose livre. </li><li> Adicionar X ul de glicogénio hidrolisada (obtido no passo 2) no tubo 2. Ajustar para um volume final de 50 ul. Volume da amostra (X ul) tem de ser ajustada de acordo com a densidade celular e / ou tipo de célula, a fim de obter valores de fluorescência que não estão além concentrações da curva de calibração. </li><li> Adicionar 2 X ul de glicogénio hidrolisado no tubo 3. Ajustar para um volume final de 50 ul. </li><li> Prepare uma solução de desenvolvimento de amostras e padrões através da mistura para cada tubo de 48,7 l de Desenvolvimento do Buffer, 1 ml de Desenvolvimento mistura de enzimas e 0,3 l de OxiRed Probe (fornecido no glicogênio Assay Kit). Por exemplo, para duas condições, para preparar uma mistura de 12 tubos (6 para os padrões, 2 para a glicose livre e 4 de fluorescência total de glicose). </li><li> Adicionar 50 ul desta mistura a cada tubo e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Medir a fluorescência num comprimento de onda de excitação de 535 nm, um comprimento de onda de emissão de 587 nm, tal como recomendado, e uma fenda de 3 nm para a excitação e de emissão. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Titulação Bioquímica de glicogênio in vitro permite uma quantificação precisa das células conteúdo de glicogênio. Comparando com outras técnicas (PAS, de imunofluorescência com um anticorpo de glicogénio, etc.), Esta titulação é muito específica, sensível e reprodutível. Além disso, o método é conveniente, uma vez que não necessita de radioactividade mas um espectrómetro de fluorescência. No entanto, esta técnica é puramente quantitativa e não fornece informações sobre a di...

Glicogénio é um polímero de múltiplas ramificações de resíduos de glicose, que está presente no citoplasma de muitos tipos de células. É uma das principais formas de armazenamento de energia nas células e desempenha um papel importante no metabolismo da glicose. A maioria das células de mamíferos são capazes de produzir e armazenar glicogênio, que pode ser rapidamente degradado em glicose para promover a glicólise e ATP produção durante o estresse metabólico. Hepatócitos produzir grandes quantidades de glicogénio para regular o nível de açúcar no sangue, proporcionando assim um fornecimento contínuo de glicose no corpo. Em contraste, a concentração de glicogénio nos músculos (outras células, as células vermelhas do sangue, etc) é relativamente baixa. No entanto, a nível local, estas quantidades são suficientes para fornecer energia a curto prazo quando as células são repentinamente expostos a um ambiente privado de nutrientes. A síntese de glicogénio e a quebra de glicogênio segue os mesmos passos em todos os tecidos (Figura 1). Em primeiro lugar, a glucoseentra nas células por transportadores de glicose (GLUTs), e é rapidamente convertido a partir de glicose-6-fosfato (G6P) em glicose-1-fosfato (G1P) por fosfoglucomutase. G1P é então modificada em UDP-glucose, e o carbono C1 da UDP-glucose é ligado a um resíduo de tirosina de glicogenina, a proteína de ancoragem de glicogénio. Esta molécula, considerada um iniciador de glicogénio, é alargada por fixação da UDP-glucose para o terminal de glicose por uma α (1 → 4) ligação através da sintase do glicogénio. Finalmente, quando uma cadeia linear de mais de 11 resíduos de glicose é formada, a enzima de ramificação transfere um oligossacárido de terminal constituída por um mínimo de 6 resíduos de glicose para outro glicose de cadeia vizinha através de uma α (1 → 6) de ligação. A repetição desse processo dá uma enorme estrutura fractal contendo ramos que formam uma hélice com 6,5 glicose por turno. O glicogênio pode ser inversamente hidrolisada em glicose pela ação concertadadesramificadora de enzimas que hidrolisam o α (1 → 6) amarrado e glicogênio fosforilase que hidrolisa o α (1 → 4) glicosídica limite entre o último resíduo de glicose de um ramo ea molécula de glicogênio. Esta reação chamado glicogenólise é ativado, aumentando os níveis de AMP (refletindo o consumo de ATP) e inibida por glicose e ATP 2,3. Por microscopia electrónica, as moléculas de glicogénio tem sido descrito em muitos tipos de células como as partículas β livres (ou monoparticles glicogênio) de 15-30 nm de diâmetro. Em tipos de células específicas, tais como os hepatócitos, partículas β pode ser montado em um complexo para formar rosetas, também conhecidas como partículas α que variam em diâmetro de 80 nm, com um máximo de 200 nm, 4 </sup&gt;. A forma como estas partículas β estão ligados para formar grandes aglomerados de partículas α ainda não está completamente elucidado. Algumas evidências tende a demonstrar que as partículas β podem ser ligados por uma ligação covalente 5, ligações de hidrogénio, ou até mesmo através de interacções proteína-proteína 6. A quantidade de glicogénio armazenado nas células depende de vários parâmetros: (i) a quantidade de glicogenina na célula que inicia a síntese de glicogénio, (II), a actividade de sintase do glicogénio fosforilase e regulada por fosforilação da proteína / desfosforilação, (III) a concentração de glicose nas células, o que é dependente de vários parâmetros, tais como o fornecimento de glucose a partir do sistema vascular e a absorção de glicose pelas células. Os estoques de glicogênio estão fortemente regulada por regulação alostérica de hormônios biossintéticas através metabólitos intermediários, por hormônios que regulam o metabolismo energético e de nutrientes por sensoriamento vias de sinalização 7. É importante estarcapazes de quantificar de glicogénio em amostras biológicas para compreender melhor a importância do metabolismo do glicogénio em todo o corpo e nível celular. Descrevemos aqui um bioquímico preciso, reprodutível e conveniente ensaio in vitro para glicogênio. Esta técnica baseia-se na quantificação de fluorescência de glicose antes e depois da hidrólise específica de glicogénio. Existem outros métodos para a estimativa do nível de glicogénio nas células, mas a maioria deles não são quantitativas. Uma das primeiras técnicas descritas para a quantificação de glicogénio nas células foi baseada na medição da incorporação de [14 C]-glucose em glicogénio 8,9. O uso de radioactividade torna este processo mais difícil de manusear, mas tem a vantagem de fornecer a taxa de incorporação de glucose em glicogénio e para distinguir entre a distribuição dos resíduos de glicose nos ramos exteriores e no núcleo da molécula (isto também requer um β-amyloly adicionalsis e uma etapa de cromatografia). Outra técnica foi desenvolvido mais recentemente e baseia-se na incorporação de 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-desoxiglucose), um 2-desoxiglucose derivado fluorescente, em glicogênio 10. A intensidade de fluorescência medida reflecte a quantidade de glicogénio produzido e pode ser medida com um leitor de fluorescência. Distribuição de fluorescência na célula também pode ser avaliada por microscopia confocal. Entre as outras técnicas não quantitativa, ácido periódico de Schiff (PAS) é talvez a mais comum. Ele pode ser usado para a detecção de glicogénio em células fixadas, as secções de tecido em parafina ou congelado. Estas cores técnica histológica não especificamente polissacarídeos, glicolipídeos, glicoproteínas, celulose e mucinas neutras em roxo. A especificidade deste ensaio pode ser aumentada por tratamento de células ou secções de tecido fixadas com diastase, que digere especificamente glicogénio. Posteriormente,o nível de glicogênio pode ser qualitativamente estimada comparando amostras não hidrolisados ​​(todas as macromoléculas de carboidratos modificados) para amostras hidrolisadas (carboidrato macromoléculas modificado, exceto glicogênio). Coloração com PAS e análise microscópica, ao contrário de ensaios bioquímicos de glicogénio, fornece informação sobre a distribuição de glicogénio na célula, o qual pode ser difuso ou concentrado numa determinada parte da célula. No entanto, embora as diferenças das estimativas de coloração PAS em acúmulo de glicogênio entre diferentes condições, não é quantitativa 11. Um anticorpo monoclonal de rato originalmente feitas usando cartilagem condilar da mandíbula, o antigénio tem sido demonstrado que reagem com glicogénio em células e com glicogénio purificada in vitro, 12. Como este anticorpo reconhece especificamente cadeias de açúcar relacionados com o glicogénio, que é um instrumento útil para a detecção de glicogénio por imuno-histoquímica de uma forma mais específica do que a coloração PAS. </p&gt; A microscopia eletrônica é outra técnica que permite a visualização de grãos de glicogênio em células e avaliação do grau de armazenamento de glicogênio. Na verdade, o glicogênio partículas β são facilmente reconhecíveis com um microscópio eletrônico de elétrons como grânulos densos 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

Glicogénio é o principal polímero energético de glicose em animais vertebrados e desempenha um papel fundamental no metabolismo de todo o corpo bem como no metabolismo celular. Já existem muitos métodos para detectar o glicogênio, mas apenas alguns são quantitativos. Descrevemos aqui um método que utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio, que é baseada na degradação específica de glicogênio a glicose por glucoamilase. A glicose é oxidada então especificamente a um produto que reage com a sonda OxiRed para produzir fluorescência. Titulação é preciso, sensível e pode ser alcançado em extratos de células ou secções de tecidos. No entanto, em contraste com outras técnicas, que não dá informação sobre a distribuição de glicogénio na célula. Como um exemplo desta técnica, descrevemos aqui a titulação de glicogénio em duas linhas celulares de fibroblastos, chinês CCL39 de pulmão de hamster e humanas LS174 carcinoma do cólon, incubadas em normoxia (21% de O 2) contra a hipoxia (1% de O2). Nossa hipótese é que a hipóxia é um signal que prepara as células para sintetizar e armazenamento de glicogénio, a fim de sobreviver 1.

Um baixo nível de oxigénio (hipoxia), em sinais de tumores para células de tumor da necessidade de armazenar a energia para lidar com o esgotamento de nutrientes subsequente, a fim de sobreviver. Como o glicogênio é o principal polímero energético da glicose em células de mamíferos, estudamos a regulação do armazenamento de glicogênio em hipóxia. O cálculo e a normalização da concentração de glicogénio nos lisados ​​celulares devem ser realizadas sobre os dados brutos de fluorescência, como mostr...

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Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.2K visualizações.  University of Nice - Sophia Antipolis.  Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência. 

Vídeo: Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Titulação de coronavírus humanos Usando um ensaio de imunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Biologia

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Coleta de sangue para análise bioquímica em Zebrafish Adulto

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Cinética de crescimento exponencial na cultura de lote para analisar o metabolismo respiratório e fermentação

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...