SDC, ACH, וCJ נתמכו על ידי החל מענקים (ERC-STG-2012-309,509) באמצעות המועצה האירופית למחקר. J.-MN נתמכה על ידי הקרן הלאומית למחקר (NRF) (2011-0,018,198) של קוריאה; ותכנית פיוניר מרכז המחקר (2012-009586) דרך NRF של קוריאה ממומנת על ידי משרד המדע, טכנולוגיות המידע והתקשורת, ותכנון עתידי (MSIP). עבודה זו נתמכה גם על ידי מרכז לבריאות bionano-Guard ממומן על ידי MSIP של קוריאה כגלובל פרונטיר הפרויקט (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL וי-HH נתמכו על ידי מדע תכנית העמיתים של סיאול סיאול עיר, קוריאה. חלבון הנציג שכותרתו היה מתנה נדיבה של ד&quot;ר סוא מיונג.

<ol>
	<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaces+and+orientations:+much+to+FRET+about.">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li><li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes:+surface+passivation+and+immobilization.">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules.">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li><li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+that+resist+biodegradation.">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li><li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility.">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li><li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2007).</li><li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies.">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li><li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene+glycol)+layers+on+metal+oxide+surfaces:+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption.">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li><li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection.">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li><li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro.">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay.">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689 (2010).</li><li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces.">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li><li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level:+introducing+the+tools+and+applications.">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li><li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes.">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

שלבים קריטיים בפרוטוקול זה זה חיוני כדי להפוך את הידרופילי השטח לפני תגובת האמין silanization. זו הושגה באמצעות תחריט פיראניה אשר יוצר קבוצות הידרוקסיל חופשיות על משטח הזכוכית / קוורץ. מומלץ לא לשמור את פני השטח חרוטים פיראניה נחשף לאו H 2 O או באוויר במשך תקופה ארוכה של זמן מאז hydrophilicity של פני השטח יורד בהדרגה. מולקולות NHS-אסתר PEG הן תגובתי. מומלץ לעשות aliquots ולאחסן אותם תחת חנקן ב-20 º C. חיי המדף של החומר הכימי APTES בטמפרטורת החדר הוא קצרים. מומלץ להחליף אותו עם אחד חדש בכל חודש. שינויים של פרוטוקול זה כאשר אתה לא יכול להשתמש בתחריט פיראניה מכל סיבה מעשית, ייתכן שלחרוט באמצעות KOH לתקופה ארוכה של זמן (למשל overnight), שגם יאפשר לקבוצות הידרוקסיל חשופות. המלכודת של גישה חלופית זו היא שהשקופיות הופכת להיות שמישים אחרי כמה ממחזרת בשל סריטות קשות. זה לעתים קרובות נהוג לשרוף משטח הזכוכית / קוורץ באמצעות לפיד פרופאן, שהוא יעיל בחיסול חומרים אורגניים ניאון 7. הליך זה לא נכלל בפרוטוקול זה כי זה מיותר לתחריט פיראניה. שים לב שהליך זה יהיה פוטנציאל לגרום לחמצון של הקבוצות הידרוקסיל. לפיכך, הליך זה לא צריך להתבצע פעם אחת משטח היה חרוט באמצעות KOH או פתרון Piranha. כאשר חיץ עם pH הנמוך מ -7 משמש להדמית מולקולה בודדת, קונפורמציה של PEG משתנה מ&quot; פטרייה &quot;ל&quot; מברשת&quot;, אשר מפחיתה את מידת פסיבציה. לכן, כאשר הוא משמש pH נמוך מ7.0, מומלץ לpassivate המשטח באמצעות disuccinimidyl tartarate &lt;נוסףsup&gt; 7. פרספקטיבות עבודה זו סיפקה פרוטוקול חזק להשגת פסיבציה פני השטח באיכות גבוהה. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור מחקרי הקרינה מולקולה בודדת כי הם מעורבים עם חלבונים 14 כמו גם קומפלקסי חלבונים בתוך תא ותמציות immunoprecipitates 15. זה יהיה בשימוש נרחב לטכניקות מולקולה בודדת אחרות כגון ספקטרוסקופיה הכוח וספקטרוסקופיה מומנט 16. זה יהיה שימושי גם למניעת תאים מadsorbing למשטח 17. הפרוטוקול האמור בעבודה זו דורש לנהלים רב שלביה. פסיבציה פני השטח באמצעות השומנים PEG 8 ופולי-ליזין PEG 9 זמינות כגישה חלופית. מאז, הם אינם דורשים כל תגובות כימיות היא קל ליישום. עם זאת, מידת פסיבציה היא לא גבוהה כמו שמושג באמצעות modif הכימיication של פני השטח.

בעת ביצוע מחקר חלבון מולקולה בודדת זה חיוני כדי להשיג איכות גבוהה של פסיבציה פני השטח, כך שהניסוי הוא חופשי מכל תקלה חלבון מושרה משטח או 1,2 denaturation. בעוד משטח זכוכית שטופלו בשטח, כגון אלבומין בסרום שור, משמש בדרך כלל למחקרי חומצות גרעין מולקולה בודדת 3, מידת פסיבציה אינה גבוהה מספיק ללימודי חלבון. משטח זכוכית מצופה בפולימר (פוליאתילן גליקול, PEG) הוא מעולה ב4-6 ביצועי פסיבציה. וכך, זה הפך להיות אוניברסלי המשמש למחקרי חלבון מולקולה בודדת מאז שהוצג למחקר הקרינה מולקולה בודדת 7-10. הליך ציפוי הפולימר דורש טיפולי שטח מרובים 7,11,12. לכן, קשה לעקוב אחרי כל ההליך ללא הוראות מפורטות. לעתים קרובות את מידת פסיבציה פני השטח משתנה בהתאם לפרוטוקול שבו אנישל אחריו. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק עם הוראות צעד אחר צעד, אשר תסיר אחד מצווארי הבקבוק העיקריים של מחקרי חלבון מולקולה בודדת. ראה איור 1 עבור סקירה.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

ספקטרוסקופיה הקרינה המולקולה בודדת הוכיחה להיות אינסטרומנטלי בהבנת מגוון רחב של תופעות ביולוגיות בקנה המידה ננומטרי. דוגמאות חשובות של מה שטכניקה זו יכולה להניב למדעי ביולוגיה הן התובנות מכניסטית על חלבונים ואינטראקציות חומצת חלבון גרעין. כאשר אינטראקציות של חלבונים נחקר ברמת המולקולה בודדת, החלבונים או מצעים שלהם לעתים קרובות משותקים על משטח זכוכית, המאפשר תצפית לטווח ארוך. ערכת קיבוע זה עשויה להציג את ממצאי משטח לא רצויים. לכן, זה הכרחי כדי passivate משטח הזכוכית כדי להפוך אותו אדיש. ציפוי פני השטח באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG) בולט לביצועים גבוהים שלה במניעת חלבונים מהלא ספציפי באינטראקציה עם משטח זכוכית. עם זאת, הליך ציפוי הפולימר הוא קשה, בשל הסיבוך הנובע מסדרה של טיפולי שטח והדרישות המחמירות שמשטח צריךלהיות חופשי של כל מולקולות ניאון בסוף ההליך. כאן, אנו מספקים פרוטוקול חזק עם הוראות צעד אחר צעד. היא משתרעת על ניקוי שטח, כולל תחריט פיראניה, functionalization שטח עם קבוצות האמינים, ולבסוף ציפוי PEG. כדי להשיג צפיפות גבוהה של שכבת PEG, אנחנו מציגים אסטרטגיה חדשה לטיפול במשטח עם מולקולות PEG יותר משני סיבובים, שלהפליא משפר את איכות פסיבציה. אנו מספקים תוצאות נציג, כמו גם עצות מעשיות לכל שלב קריטי כל כך שכל אחד יכול להשיג את פסיבציה פני השטח באיכות הגבוהה.

לאחר ההרכבה תא microfluidic (שלב 7.1-7.6) ולפני ביצוע שלב 7.7, מומלץ לבצע את בקרת האיכות של פני השטח PEGylated. אם פסיבציה פני השטח כבר נעשתה בהצלחה, יש פחות מ -10 הלא ספציפי adsorbed חלבונים לאזור הדמיה (25 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ) נצפו כאשר 1-10 חלבון שכותרתו fluorescently ננומטר מתווסף לתוך התא (איור 3 א, משמאל). כאשר כל אחד משלבי הניקוי או תגובה לא בוצע כראוי, מספר הלא ספציפי adsorbed חלבונים מגביר באופן משמעותי, ומסך CCD עשוי להיות רווי ידי אותות הקרינה. לדוגמא, אם תחריט פיראניה מדלג, יש 100 פעמים כמות גדולה יותר של ספיחה הלא ספציפית שנצפתה (איור 3 א; להשוות נשאר עם באמצע). כאשר צעד PEGylation השני הוא דילג, היה כ 3 זמןsa כמות גדולה יותר של ספיחה ציינה שאינו ספציפי (איור 3 ב). מידה נמוכה של PEGylation הוא ציין כאשר כימיקלים פגו (למשל APTES לאחסן בטמפרטורת חדר במשך כמה חודשים) משמשים (מידע לא מוצג). האיכות של פני השטח גם יורדת למטה כאשר כמות משמעותית של זמן עבר מאז שזה היה PEGylated (איור 3 א; להשוות נשאר עם ימין). למיטב ידיעתנו, זה הפעם הראשונה ששני הסיבובים של PEGylation הם הציגו ללימודי מולקולה בודדת. שני סיבובים של PEGylation להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר של היווצרות שכבת PEG (3 ב איור). הטבע מעולה של PEGylation הכפול מוצג בהבלטה בסרטים (השווה 1a סרט עם 1b סרט). בסרטים אלה, אותות רקע ממולקולות ניאון בפתרון הם נצפו להיות הרבה יותר חלשים כשPEGylation הכפול היה<html> בשימוש, אשר מציין כי חלבונים הם הדפו בצורה יעילה יותר על ידי שכבת pegylated כפליים. למרות שתהליך בן שני שלבים זה מומלץ בחום, צעד PEGylation השני עשוי להיות דילוג אם הניסוי שלך הוא נסבל לפסיבציה שאינה אופטימלית. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1:. סכמטי של טיפולי שטח () שקופית מיקרוסקופ הוא ניקה עם אצטון, KOH, ופתרונות פיראניה. הוא פונקציונליות עם APTES וPEGylated עם NHS-אסתר PEG. (ב) coverslip הוא ניקה עם KOH, כמו גם עם פתרון Piranha במידת צורך. הוא פונקציונליות עם APTES וPEGylated עם NHS-אסתר PEG. &quot;Width =&quot; fig2highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 2:. תא microfluidic (א) קאמרי ערוץ אחד. יש שקופיות מיקרוסקופ שני חורים שנקדחו. זה מורכב עם coverslip באמצעות שתי פרוסות קלטת דו צדדית דביקה. (ב) חדר שלושה ערוצים. יש שקופיות מיקרוסקופ שישה חורים שנקדחו. זה מורכב עם coverslip באמצעות ארבע פרוסות של קלטת דו צדדית דביקה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: תמונות CCD נלקחו עם חלבונים שכותרתו צבע בתמיסה. (א) תמונות CCD נלקחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך הכל ההשתקפות הפנימית פריזמה הסוג באמצעות עדשה אובייקטיבית 60x עם 10 ננומטר Cy3-labeld נציג בתמיסה. (משמאל) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה. (תיכון) פני השטח היה תכשיריםאדום בעקבות הפרוטוקול במאמר זה, אבל תחריט פיראניה היה לדלג עליו. (מימין) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה ומאוחסן במשך 3 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס תחת חנקן. (ב) תמונות שצולמו עם CCD 10 ננומטר Cy3-labeld נציג בתמיסה. (משמאל) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה. (מימין) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה, אבל הסיבוב של PEGylation השני לדלג עליו. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. סרט 1: סרטי CCD נלקחו עם חלבונים שכותרתו צבע בתמיסה. סרטי CCD נלקחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך הכל ההשתקפות הפנימית פריזמה הסוג באמצעות עדשה אובייקטיבית 60x עם 10 ננומטר Cy3-labeld נציג בתמיסה. הרזולוציה הזמן היא 100 אלפיות שנייה. (א) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה. (ב) משטח הוכן בעקבות הפרוטוקול במאמר זה, אבל את הסיבוב השני PEGylation היה לדלג עליו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">לחץ כאן</a> לצפייה בסרט ו1a <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">לחץ כאן</a> לצפייה בסרט 1b.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies at JoVE.com

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

אנו מתארים שיטה לpassivating משטח זכוכית באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול זה מכסה ניקוי פני השטח, functionalization פני השטח, וציפוי PEG. אנחנו מציגים את האסטרטגיה חדשה לטיפול במשטח עם מולקולות PEG יותר משני סיבובים, אשר מניב איכות מעולה של פסיבציה בהשוואה לשיטות קיימות.

פסיבציה משטח ללימודי חלבון מולקולה בודדת

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

41.3K Views.  Delft University of Technology.  אנו מתארים שיטה לpassivating משטח זכוכית באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול זה מכסה ניקוי פני השטח, functionalization פני השטח, וציפוי PEG. אנחנו מציגים את האסטרטגיה חדשה לטיפול במשטח עם מולקולות PEG יותר משני סיבובים, אשר מניב איכות מעולה של פסיבציה בה?...

Video: Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

הובלה של פחמן-שונה Surface דרך טור קרקע

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

שיטה למניפולציות מתח פנים של מתכת נוזלית באמצעות חמצון פני שטח והפחתה

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - Native נקה ג&#39;ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

סינתזה של מחזורי פולימרי אפיון Motion הפעפוע שלהם במדינת הממסים ברמת המולקולה הבודדה

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

הכנת יציב Aziridinium Bicyclic יונים, פתיחת הטבעת שלהם לסינתזה של Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

Functionalization פני השטח של מסגרות מתכת-אורגנית להתנגדות לחות משופר

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) with a 4.6 nm pore size, and ordered silica porous matrix, SBA-15, with a 5.3 nm pore size. This work describes the surface properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the differently ordered porous materials with similar pore sizes. For this purpose, OMC and SBA-15 with highly ordered nanoporous structures are synthesized via impregnation of the silica matrix by applying a carbon precursor and by the sol-gel method, respectively. The porous structure of investigated systems is characterized by an N2 adsorption-desorption analysis at 77 K. To determine the electrochemical character of the surface of synthesized materials, potentiometric titration measurements are conducted; the obtained results for OMC shows a significant pHpzc shift toward the higher values of pH, relative to SBA-15. This suggests that investigated OMC has surface properties related to oxygen-based functional groups. To describe the surface properties of the materials, the contact angles of liquids penetrating the studied porous beds are also determined. The capillary rise method has confirmed the increased wettability of the silica walls relative to the carbon walls and an influence of the pore roughness on the fluid/wall interactions, which is much more pronounced for silica than for carbon mesopores. We have also studied the melting behavior of D2O confined in OMC and SBA-15 by applying the dielectric method. The results show that the depression of the melting temperature of D2O in the pores of OMC is about 15 K higher relative to the depression of the melting temperature in SBA-15 pores with a comparable 5 nm size. This is caused by the influence of adsorbate/adsorbent interactions of the studied matrices.

Here we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon (with a 4.6 nm pore size) and SBA-15 (with a 5.3 nm pore size). The work describes the surface and textural properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the materials.

מאפייני משטח של פחמן Nanoporous מסונתז סיליקה מטריצות

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, chemistry, and their potential to enable advanced materials. To effectively understand and regulate the physico-chemical properties and potential adverse effects of nanoparticles, validated measurement procedures for the various properties of nanoparticles need to be developed. While procedures for measuring nanoparticle size and size distribution are already established, standardized methods for analysis of their surface chemistry are not yet in place, although the influence of the surface chemistry on nanoparticle properties is undisputed. In particular, storage and preparation of nanoparticles for surface analysis strongly influences the analytical results from various methods, and in order to obtain consistent results, sample preparation must be both optimized and standardized. In this contribution, we present, in detail, some standard procedures for preparing nanoparticles for surface analytics. In principle, nanoparticles can be deposited on a suitable substrate from suspension or as a powder. Silicon (Si) wafers are commonly used as substrate, however, their cleaning is critical to the process. For sample preparation from suspension, we will discuss drop-casting and spin-coating, where not only the cleanliness of the substrate and purity of the suspension but also its concentration play important roles for the success of the preparation methodology. For nanoparticles with sensitive ligand shells or coatings, deposition as powders is more suitable, although this method requires particular care in fixing the sample.

A number of different procedures for preparing nanoparticles for surface analysis are presented (drop casting, spin coating, deposition from powders, and cryofixation). We discuss the challenges, opportunities, and possible applications of each method, particularly regarding the changes in the surface properties caused by the different preparation methods.

הכנת חלקיקים לניתוח ToF-SIMS ו- XPS

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...