SDC、ACH、そしてCJは、欧州研究評議会を通じて補助金（ERC-STG-2012から309509）を起動した状態でのサポートされていました。 J.-MNは、韓国国立研究財団（NRF）（2011から0018198）によってサポートされていました。パイオニア研究センタープログラム（2012-009586）韓国NRFを通して科学省、ICT、および将来の計画（MSIP）によって資金を供給。この作品は、グローバルフロンティアプロジェクト（H-GUARD_2013-M3A6B2078947）、韓国のMSIPによって資金を供給BioNanoヘルスガードセンターによってサポートされていました。 YKLとJ.-HHはソウル市、韓国のソウル科学フェローシッププログラムによってサポートされていました。ラベルされたRepタンパク質は、博士スアミョンからの寛大な贈り物だった。

1。準備とクリーニングをスライドさせて マイクロ流体チャンバは、石英スライドとカバーガラスで構成されている。プリズム型全反射蛍光（TIRF）顕微鏡法では、石英スライドの表面が撮像される。したがって、十分にH 2 O、アセトン、KOH、およびピラニア溶液を使用して石英スライドをきれいにすることが重要である。 Thが、多段階の洗浄は、単一分子蛍光測定を妨害表面に蛍光性有機分子を排除している。さらに、ピラニアエッチングは、ヒドロキシル基を生成することにより石英表面を親水性にする。遊離ヒドロキシル基は、工程3におけるアミノ-シラン化反応のために必須である。 <ol><li>掘削石英スライド。 3月4日ミリのダイヤモンドドリルビット（ 図2a）と石英スライドへの正孔の対を開けます。複数のチャネルが必要な場合は、より多くのパドリルIRSの孔（ 図2b）。これらの穴は、ステップ7でマイクロ流体チャンバー内に溶液を注入するために使用される。 <ol><li>掘削中のH 2 O中の湿ったドリルビットを保持します。ドリルビットの寿命を増加させる潤滑剤としてH 2 Oを行う。 </li><li>時折ドリルビットの先端をふくと、掘削穴に役立ちます。 </li><li>穴あけした後、PEG化プロセスの間に容易に識別するためのスライドの片側をマーク。マーカーは後で混乱を避けるために基準として使用することができる。マーキングについては、ダイヤモンドドリルビットを使用することができる。インクが表面に得るかもしれないので、任意のペンを使用しないでください。 </li></ol></li><li> H 2 Oで洗浄するガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐそれを3回繰り返し、汚れを除去するために5分間のMilliQ H 2 Oでスライドを超音波処理。水を配置して、再度3回スライドをすすぐミリQ H 2 Oは、130 Wは、このプロトコルで使用超音波処理能力であることに注意してください。高い超音波処理パワーは、石英スライドの寿命を低下させる可能性があります。 </li><li>アセトンで清掃。アセトンでのMilliQ H 2 Oを交換してください。 20分以上スライドをアセトンで超音波処理する。 </li><li> H 2 Oですすいだアセトンを破棄し、ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐ任意の残留アセトンを除去するために3回それを繰り返す。 </li><li> KOHでクリーニング。 1MのKOHで水を交換して、20分以上のスライドを超音波処理。過度のエッチング（ 例えば一晩KOH処理）は、表面の質を向上しますが、蛍光イメージングを妨害する可能性があり、傷を、ご紹介します。 </li><li> H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するために3回のMilliQ H 2 Oでスライドを洗浄します。 </li><li>ピラニアエッチング。 <ol><li>デュランのスライドホルダーやカスタムメイドのテフロンホルダーとPLにスライドを転送する化学フードに位置して、ビーカー（1L）でそれらをエース。 </li><li> H 2 SO 4の450ミリリットルビーカーを埋める。 </li><li> H 2 SO 4との間の3:1の比及びH 2 O 2に対するH 2 O 2を150mlを加える。ソリューションは自然に沸騰し始めると、温度が90℃とともに増加必ずH 2 O 2溶液は、反応を開始する前に室温であることを確認してください。そうでなければ、沸騰溶液の温度を90℃より低くてもよい</li><li>適切な混合のためのソリューションを撹拌し、ビーカーを20分間乱さしてみましょう。 </li><li>スライドホルダーと一緒にピラニア溶液からスライドを取り、ミリQ H 2 Oを含むスライドホルダーに入れてそれが室温に達する一方、指定された廃液ボトルにピラニア溶液を捨てる。 </li><li>ミリQ、H 2 Oでスライドを3回すすぎ細心の注意は、さらにステレオに注意が必要ですスライドの任意の可能な汚染を避けるためにピコ。 3に進みます。これは、すぐに次の手順を続行することをお勧めします。 *注意：ピラニア溶液は非常に反応性である。このソリューションの取り扱いには特別な注意を払うべきである。また、時にアセトン等の有機溶剤と混合して誤って、それが爆発の原因となります。 </li></ol></li></ol> 2。カバースリップのクリーニング マイクロ流体室は石英スライドとカバーのリップで構成されている。プリズム型TIRF顕微鏡を用いる場合には、カバースリップの表面が画像化されていない。したがって、唯一のH 2 O及びKOHでカバーガラスを清掃するのに十分である。ケースでカバーガラス（例えば客観型全反射顕微鏡を介して）画像化される必要がある、それはピラニア溶液（ステップ1.7）でカバースリップを治療することをお勧めします。カバースリップ表面のPEG化は、高品質ではない場合、それはタンパク質のためのシンクとして作用し得ることに留意されたいタンパク質濃度の変動を生じさせるdは。 <ol><li> H 2 Oですすいだ場所カバースリップガラス染色ジャー（24×30、24×40、または24×50ミリメートル2）。典型的には5〜15カバースリップは、単一のジャーに入れることができる。ミリQ、H 2 Oでカバーグラスを3回すすぎ</li><li> KOHでクリーニング。 1M KOHで水を交換して、20分以上カバースリップを超音波処理。 </li><li> H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するためのMilliQ H 2 Oでカバーグラスを3回すすいでください。 3に進みます。 </li></ol>スライドとカバーガラスの3。アミノ - シラン化 アミノ-シラン化化学を介してアミン基と石英スライドとカバースリップの表面を官能化する。メタノールはアミノ-シラン化反応の触媒としての溶媒と酢酸として使用される。 <ol><li>メタノールですすいだ。 Sから（染色皿にミリQ H 2 Oを交換してくださいメタノールでTEPS 1および2）。ステップ3.3までメタノールのスライドとカバースリップを保つ。メタノール中の不純物が表面に吸着するので、（ 例えば数時間）の時間を不必要に長期間スライドとメタノール中でカバースリップを保管しないでください。 </li><li>アミノシラン化溶液を調製する。 <ol><li>メタノールでパイレックスフラスコを数回すすいでください。 5分以上のメタノールで、フラスコを超音波処理。それは清浄に保たれている専用のフラスコを持っていることをお勧めします。 </li><li>フラスコにメタノール100mlを注ぐ。 </li><li>酢酸5mlを追加します。 </li><li> APTESの3ミリリットル（3 - アミノプロピルトリメトキシシラン）を追加し、軽く振って混和する。 </li></ol></li><li>アミノ - シラン化。 aminosilanizationの反応混合物とスライドとカバースリップが含まれている染色皿にメタノールを交換してください。 <ol><li> 20から30分間インキュベートします。インキュベーション中、1分間超音波処理一度。 </li></ol></li><li>メタノールですすいだ。 Aを交換してくださいメタノールとminosilanization反応。メタノールを捨て、新鮮なメタノール溶液を加える。この手順を3回繰り返します。 </li></ol>ポリマー（1回戦）を使用する4。表面パッシベーション NHS-エステル、ポリエチレングリコール（PEG）を結合することによって石英スライドとカバースリップのアミン被覆表面を不動態化する。この反応物を一晩、pH8.5のPEG溶液の飽和濃度を用いて行われる。 <ol><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。スライドとN 2ガ ​​スを使用してカバーグラスを乾燥させ、PEG化である必要があります側が上を向いているような方法で、きれいなピペットのボックスに配置します。ピペットボックスは部分的にミリQ H 2 Oで満たされているこの湿った環境では、一晩のインキュベーションの間に乾燥からPEG化ソリューションを防ぐことができます。 </li><li>反応バッファーを調製した。 10ml中の炭酸水素ナトリウム84mgを溶解することによって、新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH8.5）中の0.1 Mを調製ミリQ H 2 O pHを調整する必要がない。この溶液を次の利用（ 例えば、工程6.1）のために凍結保存することができる。 </li><li> PEG化溶液を調製する。 <ol><li> 1.5mlチューブ中のNHS-エステルのmPEG（5000 Da）でのNHS-エステルPEG（5000 Da）で13と8 mgのビオチン化0.2mgのPEGの混合物を準備します。スライドの数Nを調製する場合、単一のチューブ内でPEG混合物のN倍大きい量を準備する。 </li><li>新たに調製されたバッファ（ステップ4.2）の64μL（またはN回スライドのN個の数の64μL）を追加します。完全に溶解させるために上下にピペット。 </li><li>気泡を除去するために1分間、16,100×gで遠心分離して。その後ピペットないでください。そうでなければ、気泡は、ステップ4.4でPEG化干渉する形成する。 </li></ol></li><li> PEG化。 <ol><li>ステップ4.1からの乾燥石英スライドにPEG化混合物の70μlをドロップします。 24×50ミリメートル2 COV例に90μlを使用するerslip。 </li><li>ゆっくりと溶液上にステップ4.1からの乾燥カバースリップを配置。 </li><li> 、PEG化の均一で高い品質を持つように、気泡を導入しないように注意してください。表面張力により、気泡の大部分は自然に表面張力により5分以内に反応容積を残すことができる。 </li><li>暗くて湿気の多い環境でのスライドをインキュベートします。我々はpH8で使用するNHS-エステルPEGの半減期は約1時間である。最低でも、2時間のためにそれらをインキュベートする。一晩のインキュベーションは、PEG化（データは示さず）のより高い品質をもたらす。 </li></ol></li></ol> 5。長期保存 -20ºCでPEG化スライドや、N 2中のカバースリップを保存する <ol><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。慎重に、側にカバースリップをスライドさせて、スライドとカバーガラスを分解をMilliQ H 2 Oでそれらをすすぎ、およびN 2とそれらを乾燥させます。 </li><li>スライドとカバースリップを保存する。フォーRすぐに使用、ペグ（ステップ6）の第二ラウンドのための手順に従ってください。長時間保管するために、次の手順に従います。 <ol><li>一対のスライド及びPEG化された面が互いに離れる対向するよう50mlチューブ中でカバースリップを置く。 </li><li>部分的に、チューブを閉じ、チューブを真空した後、N 2でそれを埋める。これらのステップは、長時間のPEG化された表面を維持するのに役立ちます。しっかりとチューブをねじ込み、-20℃で保管しスライドの品質は、最大3ヶ月（ 図3a、右 ）こだわりのまま。 </li></ol></li></ol>ポリマー（2回戦）の使用6。表面パッシベーション PEG層の密度の高いをすると、表面上の任意の残りのアミン基をクエンチするPEG化の追加のラウンド。ショートNHS-エステルPEG分子（333ダルトン）の使用は、既存のPEG層に浸透するのに有効であり得る。これはRECです右側のスライドを使用する前に、PEG化のこの第二ラウンドを行う奨。 <ol><li>反応バッファーを調製した。新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.5）の0.1 Mを準備します。ステップ4.2からの凍結溶液を使用することもできる。 </li><li> PEG化溶液を調製する。炭酸水素ナトリウム緩衝液の63μlの250 mMのT4-PEGの7μLを溶解する。 </li><li> PEG化。ステップ4.4と同様の手順に従ってください。晩まで30分間インキュベートします。 </li><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。一対のスライドとカバーガラスを分解し、ミリQ H 2 Oで、それらを洗い流し、N 2でそれらを乾燥し、きれいなピペットボックスに保管してください。ステップ7で、マイクロ流体チャンバーの組み立てに進みます。 </li></ol> 7。マイクロ流体チャンバーの組み立て PEG化された石英スライドとカバースリップのペアを使用してマイクロ流体チャンバを組み立てる。両面粘着テープがスペーサーとして使用される。室はそのように、エポキシ接着剤で密封しているlutionsは石英スライドの穴を通って導入されています。 <ol><li> PEG化面を上にして平らな面に石英スライドを置きます。 </li><li>スライド上で、両面粘着性のテープを入れて斜めにPEG化表面上のチャネル（7ミリメートル、幅5）を作る。ホールはチャンネルの中心に位置していることを確認してください。チャンバーを製造するプロセスの間、PEG化表面を損なわないように注意してください。これは、（ 図2参照）を配置し、異なって両面粘着性テープを貼り付けることによって、マルチチャネルスライドすることが可能となる。 </li><li>優しく室を完成させる上でPEG化カバースリップを配置。 PEG化側が下に向けなければならない。 </li><li>両面テープが配置される領域の上にカバースリップを押すことによって、チャンバをシールする。チャンバーは水密閉なるように慎重に徹底的にそれを行う。 </li><li>エポキシ接着剤をチャンバーの端を閉じます。 </li><li>上ストレプトアビジンまたはニュートラを固定化P200ピペットを用いて、T50において、ストレプトアビジン又はニュートラアビジン溶液（10mMトリス-HCl [pH8.0中]、50 mMのNaCl緩衝液）の0.1 mg / mlの50μlの添加することによりビオチン化PEG層。 T50緩衝液100μlと同一平面のインキュベーションの1分後。 </li><li>あなたの1分子イメージングのためのビオチン化の生物学的分子を追加します。 </li></ol> 8。リサイクルをスライドさせます 石英スライドをリサイクルする。使用済みのスライドをカバーグラスや、両面粘着性のテープを外すことによってリサイクルされています。 <ol><li>使用後は、水道水に室に保管してください。水中での長期的なインキュベーションチャンバーの分解が容易になります。 </li><li>マイクロ波を用いた水道水室を沸かす。パイレックスビーカーを使用してください。 10分以上煮る。 </li><li>カミソリの刃を使用してカバースリップし、両面粘着性のテープを脱ぐ。その平面に垂直な石英スライドを押さないでください。それ以外の場合は、分割します。離れてチャネルからかみそりの刃を保つ。 OTherwise、チャネル上の傷が導入されています。 </li><li>指で擦って家庭用洗剤を使用してスライドを洗浄します。 </li><li>ガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。 10％の家庭用洗剤を追加し、20分以上のスライドを超音波処理。タブ多量の水でスライドを洗浄します。 </li><li> 1.2に進みます。 </li></ol>

<ol>
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C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

このプロトコルの中の重要なステップ これは、アミノ - シラン化反応の前に表面を親水性にすることが不可欠である。これは、ガラス/石英表面上の遊離ヒドロキシル基を生成するピラニアエッチングによって達成された。表面の親水性は徐々にダウンしたので、それが長期間にわたって、H 2 Oまたは空気のいずれかにさらさピラニアエッチングされた表面を維持しないことをお勧めします。 NHS-エステルPEG分子が反応性である。それは、-20ºCで一定分量を行い、窒素下でそれらを格納することをお勧めします室温でAPTES化学物質の貯蔵寿命が短い。これは、毎月新しいものと交換することをお勧めします。 このプロトコルの改変 何か実用的な理由でピラニアエッチングを使用できない場合には、長時間のKOHを用いてエッチング（ 例えば Overnight）、ヒドロキシル基を露出させるであろう。この代替アプローチの落とし穴は、スライドが深刻な傷が原因、数リサイクルの後に使用できなくなることである。 これは、しばしば蛍光性有機材料7を除去するのに有効であるプロパントーチを使用して、ガラス/石英表面を焼くために実施される。それはピラニアエッチングに冗長であるため、この手順は、このプロトコルには含まれていませんでした。この手順は、潜在的にヒドロキシル基の酸化につながることに注意してください。表面はKOHまたはピラニア溶液を用いてエッチングした後そのため、この手順が行われるべきではない。 7未満のpHを有する緩衝液は、単一分子イメージングのために使用される場合、PEGのコンフォメーションは、不動態化の程度を減少させる「ブラシ」と「マッシュルーム」から変化する。 7.0より低いpHが使用される場合、したがって、それはさらにジスクシンイミジル酒石酸を用いて表面を不動態化することが推奨される&lt;SUP&gt; 7。 展望 この作品は、高品質な表面パッシベーションを達成するための堅牢なプロトコルを提供してきました。このプロトコルは、タンパク質14、ならびに細胞抽出物および免疫沈降物15内でのタンパク質複合体に関与している単一分子蛍光研究のために有用であろう。これは、広くそのような力分光法とトルク分光16のような他の単一分子技術に使用される。また、表面17に吸着するから細胞を予防するために有用であろう。 この作品では提供されたプロトコルは、多段階の手順については、要求している。脂質-PEG 8およびポリリジン、PEG 9を用いた表面パッシベーションは、別のアプローチとして使用できます。日時は、それは実装が容易である任意の化学反応を必要としない。しかしながら、不動態化の程度は、化学MODIFを介して達成されるほど高くはない表面のication。

単一分子タンパク質の研究を行う際には、実験は、任意の表面に誘導されるタンパク質の機能不全又は変性1,2から自由になるように表面パッシベーションの高品質を達成するために不可欠である。例えば、ウシ血清アルブミンなどの界面活性剤で処理されたガラス表面は、一般に単一分子核酸試験3のために使用されているが、その不動態化の程度は、タンパク質の研究のために十分に高くない。ポリマー（ポリエチレングリコール、PEG）でコーティングされたガラス表面は、パッシベーション性能4-6に優れている。これにより、それは、単一分子蛍光研究7月10日に導入されて以来、単一分子タンパク質研究のための普遍的に使用されるようになった。ポリマーコーティング手順は、複数の表面処理7,11,12を必要とする。したがって、詳細な指示なしで全体の手順に従うことは困難である。多くの場合、表面保護の程度は、どのプロトコルIに依存して変化するSが続いた。ここでは、単一分子、タンパク質研究の主要なボトルネックの1が削除され、ステップ·バイ·ステップの手順、堅牢なプロトコルを提示する。概要については図1を参照してください。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

単一分子蛍光分光法は、ナノスケールでの生物学的現象の広い範囲を理解する上で器械であることが証明された。この技術は生物科学にもたらすことができるものの重要な例は、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用メカニズムの洞察である。タンパク質の相互作用は、単一分子レベルでプローブされる場合、タンパク質またはそれらの基質は、しばしば長期の観察を可能にするガラス表面上に固定化される。この固定化スキームは、望ましくない表面アーティファクトを導入することができる。したがって、それが不活性にするガラス表面を不動態化することが不可欠である。ポリエチレングリコール（PEG）を用いた表面コーティングは、非特異的にガラス表面と相互作用するタンパク質を防止する上で高いパフォーマンスを得るために際立っている。しかしながら、ポリマーコーティング手順は、表面には表面処理を必要とする一連の厳しい要件から生じる合併症のために、困難である手順の最後に任意の蛍光分子を含まない。ここでは、ステップ·バイ·ステップの手順で堅牢なプロトコルを提供する。これは、ピラニアエッチング、アミン基を有する表面官能化、および最終的にPEGのコーティングを含む表面洗浄を覆っている。 PEG層の高密度化を得るために、我々は、著しく不動態化の品質を向上させる二回にわたってPEG分子で表面を処理する新たな戦略を紹介する。誰もが高品質な表面パッシベーションを達成できるように、私たちは、代表的な結果だけでなく、それぞれの重要なステップのための実践的なアドバイスを提供します。

マイクロ流体チャンバアセンブリ後（ステップ7.1 - 7.6）ステップ7.7を行う前に、それがPEG化された表面の品質管理を行うことが推奨される。 表面不動態化が正常に行われた場合には、10未満が非特異的に撮像面積当たりのタンパク質が吸着される（25ミリメートル×25ミリメートル）1〜10nMの蛍光標識されたタンパク質は（ 左図3a）チャンバーに添加されたときに観察した。 洗浄または反応ステップのいずれかが正しく行われていない場合には、非特異的の数が有意に増加するタンパク質を吸着させ、CCD画面は蛍光信号によって飽和されてもよい。ピラニアエッチングがスキップされる場合、観察された非特異的吸着の100倍の量が存在する（図3a;中間残さコンペア）。二PEG化ステップがスキップされると、約3時間がありましたsaの非特異的吸着が観察さ多量の（ 図3b）。 PEG化の程度が低い（数ヶ月間、室温で保存例えば APTES）が満了化学物質が（データは示していない）が使用される場合に観察される。かなりの時間、それがPEG化されてから通過した場合に、その表面の質もドロップダウンし（ 図3a、右と左を比較してください）。 当社の認知する限り、それはPEG化の2回は、単一分子の研究のために導入されたのは今回が初めてである。 PEG化の2回は、PEG層形成（ 図3b）の最高の品質を保証します。二重PEG化の優れた性質が顕著に（ 動画1Bと一緒に映画1aと比較）映画の中で示されている。これらの映画では、溶液中の蛍光分子からのバックグラウンド信号は、二重PEG化だったときに非常に弱いことが観察されている<html>タンパク質は二重にPEG化層により、より効果的に反発されていることを示している、使用。この2段階のプロセスを強くお勧めしますが、あなたの実験は、最適でない不動態に許容される場合は、2番目のPEG化ステップは省略されることがあります。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：表面処理の回路図（a）の顕微鏡スライドをアセトン、KOH、およびピラニア溶液で洗浄される。これは、NHS-エステルPEGでAPTESおよびPEG化で官能化されている。必要に応じて、（b）は、カバースリップをピラニア溶液でKOH、並びに洗浄する。これは、NHS-エステルPEGでAPTESおよびPEG化で官能化されている。 fig2highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図2：マイクロ流体室（A）のシングルチャネル室。顕微鏡のスライドには、掘削穴が2つあります。これは、両面粘着テープの2スライスを使用してカバーガラスで組み立てられる。 （b）は、3チャンネルチャンバ。顕微鏡スライドは、掘削6穴があります。これは、両面粘着テープの4つのスライスを使用してカバーガラスで組み立てられる。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> 図3：溶液中の色素標識タンパク質で撮影したCCD画像 。 （a）は、CCDイメージが溶液中で10nMのCy3標識labeld担当して60X対物レンズを用いたプリズム型全反射蛍光顕微鏡によって撮影した。 （左）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （中央）表面はPREPAたこの資料に記載されているプロトコールに従って、赤が、ピラニアエッチングはスキップされました。 （右）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製し、窒素下-20℃で3ヶ月間保存した。 （b）は、溶液中で10 nMのCy3でlabeld担当で撮影したCCD画像。 （左）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （右）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って製造したが、PEG化の第二ラウンドはスキップされました。スケールバー=5μmである。 映画1：溶液中の色素標識タンパク質で撮影したCCDの映画 。 CCDムービーは、溶液中で10nMのCy3標識labeld担当して60X対物レンズを用いたプリズム型全反射蛍光顕微鏡によって撮影した。時間分解能は100ミリ秒である。 （a）は、表面がこの資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （b）は、表面がこの資料に記載されているプロトコールに従って調製したが、PEGylの第二ラウンドATIONはスキップされました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">こちらをクリックして</a>動画1Aを表示および<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">こちらをクリックして</a>動画1Bを表示する。

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Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

我々は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いてガラス表面を不動態化するための方法を記載している。このプロトコルは、表面洗浄、表面機能化、およびPEGコーティングをカバーしています。私たちは、既存の方法に比べて不動態の優れた品質が得られ2回のラウンドでのPEG分子で表面を処理するための新たな戦略を、ご紹介します。

単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

41.5K ビュー.  Delft University of Technology. 我々は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いてガラス表面を不動態化するための方法を記載している。このプロトコルは、表面洗浄、表面機能化、およびPEGコーティングをカバーしています。私たちは、既存の方法に比べて不動態の優れた品質が得られ2回のラウンドでのPEG分子で表面を処理するための新たな戦略を、ご紹介します。 

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

化学

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

土壌カラムを通して表面修飾カーボンナノチューブの輸送

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

表面酸化と還元を経て液体金属の表面張力を操作する方法

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE  - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

単一分子レベルでの環状ポリマーの合成と溶融状態におけるそれらの拡散運動のキャラクタリゼーション

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

安定した二環性 Aziridinium イオンと開環の Azaheterocycles の合成のための準備

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

金属有機性フレームワークの耐湿性を向上のための表面機能化

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) with a 4.6 nm pore size, and ordered silica porous matrix, SBA-15, with a 5.3 nm pore size. This work describes the surface properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the differently ordered porous materials with similar pore sizes. For this purpose, OMC and SBA-15 with highly ordered nanoporous structures are synthesized via impregnation of the silica matrix by applying a carbon precursor and by the sol-gel method, respectively. The porous structure of investigated systems is characterized by an N2 adsorption-desorption analysis at 77 K. To determine the electrochemical character of the surface of synthesized materials, potentiometric titration measurements are conducted; the obtained results for OMC shows a significant pHpzc shift toward the higher values of pH, relative to SBA-15. This suggests that investigated OMC has surface properties related to oxygen-based functional groups. To describe the surface properties of the materials, the contact angles of liquids penetrating the studied porous beds are also determined. The capillary rise method has confirmed the increased wettability of the silica walls relative to the carbon walls and an influence of the pore roughness on the fluid/wall interactions, which is much more pronounced for silica than for carbon mesopores. We have also studied the melting behavior of D2O confined in OMC and SBA-15 by applying the dielectric method. The results show that the depression of the melting temperature of D2O in the pores of OMC is about 15 K higher relative to the depression of the melting temperature in SBA-15 pores with a comparable 5 nm size. This is caused by the influence of adsorbate/adsorbent interactions of the studied matrices.

Here we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon (with a 4.6 nm pore size) and SBA-15 (with a 5.3 nm pore size). The work describes the surface and textural properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the materials.

合成多孔性カーボンとシリカ マトリックスの表面特性

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.