SDC, ACH, e CJ sono stati sostenuti da Starting Grants (ERC-STG-2012-309509) attraverso il Consiglio europeo della ricerca. J.-MN è stato sostenuto dal National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) della Corea; e il Programma Pioneer Research Center (2012-009586) attraverso la NRF della Corea finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e futuro Planning (MSIP). Questo lavoro è stato supportato anche dal Centro per BioNano Salute-Guard finanziato dalla MSIP della Corea come Frontier Global Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL e J.-HH sono stati sostenuti dal Seoul Science Fellowship Program della città di Seoul, Corea. La proteina Rep etichettato era un dono generoso del Dr. Sua Myong.

1. Scorrere Preparazione e pulizia Una camera di microfluidica è composto di una diapositiva quarzo e un coprioggetto. In prisma di tipo a riflessione totale interna fluorescenza (TIRF) microscopia, la superficie del vetrino di quarzo viene esposta. Pertanto, è importante pulire una diapositiva quarzo accuratamente con H 2 O, acetone, KOH, e soluzioni Piranha. Th è pulizia multi-step elimina molecole organiche fluorescenti su una superficie che interferiscono con le singole misure di fluorescenza della molecola. Inoltre, l&#39;attacco piranha rende la superficie idrofila quarzo generando gruppi idrossilici. I gruppi idrossilici liberi sono essenziali per la reazione ammino-silanizzazione nel passaggio 3. <ol><li> Diapositive quarzo Drilling. Praticare un paio di fori in una diapositiva quarzo con un bit 3/4 mm punta di diamante (Figura 2a). Se si desiderano più canali, forare più pairs di fori (Figura 2b). Questi fori servono per iniettare soluzioni in una camera microfluidica nel passaggio 7. <ol><li> Mantenere la punta bagnata in H 2 O durante la perforazione. H 2 O esegue come lubrificante, che aumenta la durata della punta. </li><li> Occasionali asciugandosi la punta del trapano aiuta fori. </li><li> Dopo fori, segnare un lato del vetrino per una facile identificazione durante il processo di PEGylation. I marcatori possono essere utilizzati come riferimento per evitare confusione in seguito. Per la marcatura, una punta di diamante può essere utilizzato. Non utilizzare la penna in quanto l&#39;inchiostro potrebbe ottenere sulla superficie. </li></ol></li><li> Pulizia con H 2 O. Porre i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro. Tipicamente 5 a 15 vetrini possono essere collocati in un singolo barattolo. Sciacquare i vetrini con MilliQ H 2 O. Ripetere 3 volte e sonicare i vetrini con MilliQ H 2 O per 5 minuti per rimuovere lo sporco. Smaltire l&#39;acqua e sciacquare gli scivoli di nuovo 3 volte conMilliQ H 2 O. Si noti che 130 W è la potenza sonicazione utilizzato per questo protocollo. Potenza sonicazione superiore potrebbe diminuire la durata delle diapositive di quarzo. </li><li> Pulizia con acetone. Sostituire il MilliQ H 2 O con acetone. Sonicare i vetrini con acetone per 20 minuti o più. </li><li> Risciacquo con H 2 O. Eliminare il acetone e lavare i vetrini con MilliQ H 2 O. Ripetere per 3 volte per rimuovere eventuali residui di acetone. </li><li> Pulizia con KOH. Sostituire l&#39;acqua con 1 M KOH e sonicare le diapositive per 20 minuti o più a lungo. Incisione eccessivo (ad esempio di notte trattamento KOH) migliorerà la qualità della superficie, ma introdurrà graffi, che potrebbero interferire con fluorescenza. </li><li> Risciacquo con H 2 O. Risciacquare i vetrini con MilliQ H 2 O per 3 volte per rimuovere tracce di KOH. </li><li> Piranha incisione. <ol><li> Trasferire i vetrini in un portavetrini Duran o un titolare di Teflon misura e plli ace in un becher (1 L) che si trova in una cappa chimica. </li><li> Riempire il bicchiere con 450 ml di H 2 SO 4. </li><li> Aggiungere 150 ml di H 2 O 2 in rapporto 3:1 tra H 2 SO 4 e H 2 O 2. Una volta che la soluzione inizia a bollire spontaneamente, la temperatura aumenta oltre 90 ° C. Assicurarsi che la soluzione di H 2 O 2 è a temperatura ambiente prima di iniziare la reazione. In caso contrario, la temperatura di ebollizione della soluzione può essere inferiore a 90 ° C. </li><li> Agitare la soluzione per una corretta miscelazione e lasciare il becher indisturbato per 20 min. </li><li> Prendete le diapositive dalla soluzione piranha insieme con il supporto per diapositive, e metterli in un supporto diapositiva contenente MilliQ H 2 O. Nel frattempo, scartare la soluzione piranha in una bottiglia di scarico designata, una volta raggiunta la temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare i vetrini 3 volte con MilliQ H 2 O. La cura supplementare dovrebbe essere presa in ulteriore steps per evitare ogni possibile contaminazione dei vetrini. Continua al punto 3. Si consiglia di procedere immediatamente con le seguenti operazioni. * Attenzione: La soluzione piranha è estremamente reattivo. Quando si maneggia questa soluzione estrema cautela dovrebbe essere presa. Inoltre, quando per errore miscelato con solventi organici come acetone, può causare esplosioni. </li></ol></li></ol> 2. Pulizia Coverslip Una camera di microfluidica è composto di una diapositiva quarzo e un labbro coperchio s. Quando viene usato un microscopio TIRF prisma-tipo, la superficie di un vetrino non viene esposta. Pertanto, è sufficiente pulire un coprioggetto solo con H 2 O e KOH. Nel caso un coprioggetto deve essere ripreso (ad esempio attraverso l&#39;obiettivo di tipo microscopia TIRF), si raccomanda di trattare i coprioggetti con soluzione Piranha (Passo 1.7). Si noti che se PEGylation della superficie coprioggetto non è di alta qualità, potrebbe agire come un dissipatore di proteine ​​per und dar luogo a variazioni della concentrazione proteica. <ol><li> Risciacquo con H 2 O. Inserire coprioggetto (24 x 30, 24 x 40 o 24 x 50 mm 2) in una vaschetta di colorazione vetro. Tipicamente 5 a 15 coprioggetto può essere collocato in un vaso singolo. Lavare i coprioggetti 3 volte con il MilliQ H 2 O. </li><li> Pulizia con KOH. Sostituire l&#39;acqua con KOH 1M e sonicare le lamelle per 20 minuti o più a lungo. </li><li> Risciacquo con H 2 O. Lavare i coprioggetti 3 volte con MilliQ H 2 O per rimuovere tracce di KOH. Passare alla fase 3. </li></ol> 3. Amino-silanizzazione di diapositive e Coprivetrini Funzionalizzazione della superficie dei vetrini quarzo e il coprioggetto con gruppo amminico tramite la chimica ammino-silanizzazione. Il metanolo viene usato come solvente e acido acetico come catalizzatore per la reazione ammino-silanizzazione. <ol><li> Risciacquo con metanolo. Sostituire il MilliQ H 2 O nei piatti di colorazione (da SPTO 1 e 2) con metanolo. Mantenere le diapositive e le coprioggetto in metanolo fino al punto 3.3. Non conservare i vetrini e coprioggetto in metanolo per un inutilmente lungo periodo di tempo (ad esempio alcune ore) da impurezze in metanolo adsorbire alla superficie. </li><li> Preparare una soluzione amino-silanizzazione. <ol><li> Risciacquare una beuta Pyrex più volte con metanolo. Sonicare il pallone con metanolo per 5 minuti o più. Si consiglia di avere un pallone dedicato che viene mantenuta pulita. </li><li> Versare 100 ml di metanolo nel pallone. </li><li> Aggiungere 5 ml di acido acetico. </li><li> Aggiungere 3 ml di APTES (3 amminopropil trimetossisilano) e mescolare delicatamente agitandolo. </li></ol></li><li> Amino-silanizzazione. Sostituire il metanolo nei piatti di colorazione che contengono le diapositive e il coprioggetto con la miscela di reazione aminosilanization. <ol><li> Incubare per 20-30 min. Durante l&#39;incubazione, sonicare volta per 1 min. </li></ol></li><li> Risciacquo con metanolo. Sostituire l&#39;unareazione minosilanization con metanolo. Eliminare il metanolo e aggiungere una soluzione di metanolo fresco. Ripetere questa procedura per tre volte. </li></ol> 4. Passivazione della superficie Uso Polymer (al primo turno) Passivazione della superficie ammina rivestita di diapositive di quarzo e coprioggetto coniugando NHS-estere polietilene glicole (PEG). Questa reazione viene condotta con la concentrazione di saturazione della soluzione di PEG a pH 8.5 notte. <ol><li> Asciugatura diapositive e lamelle. Asciugare le diapositive e le coprioggetti con N 2 gas e metterli in scatole pipetta puliti in modo tale che il lato che deve essere PEGylated è rivolto verso l&#39;alto. La scatola pipetta è parzialmente riempita con MilliQ H 2 O. Questo ambiente umido impedisce soluzione PEGylation si secchi durante la notte di incubazione. </li><li> Preparazione del tampone di reazione. Preparare 0,1 M di tampone fresco bicarbonato di sodio (pH 8,5) sciogliendo 84 mg di bicarbonato di sodio in 10 ml diMilliQ H 2 O. Non c&#39;è bisogno di regolazione del pH. Questa soluzione può essere conservata congelata per l&#39;uso successivo (ad es Fase 6.1). </li><li> Preparazione soluzione PEGylation. <ol><li> Preparare una miscela di 0,2 mg PEG biotinilato NHS-estere PEG (5.000 Da) 13 e 8 mg di NHS-estere mPEG (5.000 Da) in una provetta da 1,5 ml. Nel preparare numero N di diapositive, preparare N volte più grande quantità della miscela PEG in un unico tubo. </li><li> Aggiungere 64 ml (o N volte 64 microlitri per numero N di diapositive) del buffer appena preparato (punto 4.2). Pipettare su e giù per sciogliere completamente. </li><li> Centrifuga con 16.100 xg per 1 minuto per eliminare le bolle d&#39;aria. Non pipettare dopo. In caso contrario, le bolle d&#39;aria si formano che interferiscono con PEGylation al punto 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Goccia 70 ml di miscela PEGylation a una diapositiva quarzo essiccata dal punto 4.1. Utilizzare 90 ml nel caso di 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Inserire delicatamente un vetrino asciugato dal punto 4.1 sopra la soluzione. </li><li> Per avere un uniforme e di alta qualità di PEGylation, fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria. A causa di tensione superficiale, la maggior parte delle bolle d&#39;aria possono spontaneamente lasciare il volume di reazione entro cinque minuti a causa della tensione superficiale. </li><li> Incubare i vetrini in un ambiente buio e umido. L&#39;emivita di NHS-estere PEG che usiamo a pH 8 è circa un&#39;ora. Come minimo, li incubare per 2 ore. Notte di incubazione porta alla più elevata qualità di PEGylation (dati non mostrati). </li></ol></li></ol> 5. Conservazione a lungo termine Memorizzazione delle diapositive pegilato e coprioggetto in N 2 a -20 ° C. <ol><li> Asciugatura diapositive e lamelle. Disassemblare con cura il vetrino ed il coprioggetto facendo scorrere il vetrino ad un lato, sciacquare con MilliQ H 2 O, e asciugarle con N 2. </li><li> Memorizzazione di diapositive e lamelle. For uso immediato, seguire la procedura per il secondo turno di PEGylation (punto 6). Al fine di conservare per un periodo di tempo più lungo, seguire i passi successivi. <ol><li> Posizionare una coppia del vetrino e coprioggetto in un tubo da 50 ml tale che le superfici siano rivolti PEGilate distanti. </li><li> Parzialmente chiudere il tubo, aspirare il tubo, e poi riempirlo con N 2. Questi passaggi aiutano preservare la superficie PEGylated per un lungo periodo di tempo. Avvitare il tubo ermeticamente e conservarlo a -20 ° C. La qualità delle diapositive rimane buona per 3 mesi (Figura 3a, destra). </li></ol></li></ol> 6. Passivazione della superficie Uso Polymer (secondo turno) Ulteriori giro di PEGylation per rendere lo strato più denso PEG e anche per estinguere eventuali gruppi amminici rimanenti sulla superficie. L&#39;uso di brevi molecole NHS-estere PEG (333 Da) può essere efficace a penetrare in uno strato PEG esistente. E &#39;recmanda di fare questo secondo round di PEGylation destra prima di utilizzare una diapositiva. <ol><li> Preparazione del tampone di reazione. Preparare 0,1 M di tampone fresco bicarbonato di sodio (pH 8,5). La soluzione congelata dal punto 4.2 può anche essere usato. </li><li> Preparazione soluzione PEGylation. Sciogliere 7 ml di 250 mM MS4-PEG in 63 ml di tampone bicarbonato di sodio. </li><li> PEGylation. Seguire la stessa procedura della Fase 4.4. Incubare per 30 min fino a tutta la notte. </li><li> Asciugatura diapositive e lamelle. Smontare la coppia di slitta e il vetrino, sciacquare con MilliQ H 2 O, asciugarle con N 2, e tenerli in una scatola pipetta pulita. Procedere per l&#39;assemblaggio di una camera di microfluidica al punto 7. </li></ol> 7. Assemblare una sezione Microfluidic Assemblare una camera microfluidica utilizzando una coppia di quarzo diapositiva PEGylated e un copri. Nastro biadesivo appiccicoso viene utilizzato come spaziatore. La camera è sigillata con colla epossidica e, cosìluzioni vengono introdotte attraverso i fori della diapositiva quarzo. <ol><li> Posizionare un vetrino di quarzo su una superficie piana con il lato PEGylated rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Effettuare un canale (larghezza 5 a 7 mm) in diagonale sulla superficie PEGylated mettendo nastri biadesivi appiccicose sul vetrino. Assicurarsi che i fori sono posizionati al centro del canale. Fare attenzione a non rovinare la superficie PEGylated durante il processo di creazione di una camera. E &#39;possibile effettuare una diapositiva multi-canale, inserendo e attaccare i nastri biadesivi appiccicose diverso (vedere Figura 2). </li><li> Posizionare delicatamente un coprioggetto PEGylated sulla parte superiore per completare la stanza. Il lato PEGylated deve essere rivolto verso il basso. </li><li> Sigillare la camera premendo il vetrino sopra la zona dove si trovano i nastri su due lati. Fatelo delicatamente, ma accuratamente in modo che la camera diventa acqua ermeticamente chiusi. </li><li> Chiudere i bordi della camera con colla epossidica. </li><li> Immobilizzare Streptavidina o neutravidina sulPEG biotinilato strato aggiungendo 50 ml di 0,1 mg / ml di soluzione di streptavidina o NeutrAvidin a T50 (10 mM Tris-HCl [pH8.0], 50 mM tampone NaCl) usando una pipetta p200. Dopo 1 min di incubazione, lavare con 100 microlitri di tampone T50. </li><li> Aggiungi molecole biologiche biotinilati per la vostra rappresentazione singola molecola. </li></ol> 8. Scorrere Recycling Riciclaggio diapositive quarzo. Vetrini usati sono riciclati togliendo i coprioggetti e nastri a doppia faccia appiccicoso. <ol><li> Dopo l&#39;uso, conservare le camere in acqua di rubinetto. Incubazione lungo termine in acqua facilita lo smontaggio delle camere. </li><li> Lessare le camere in acqua di rubinetto utilizzando un forno a microonde. Utilizzare un bicchiere Pyrex. Bollire per 10 minuti o più. </li><li> Togliere i coprioggetti e nastri a doppia faccia appiccicose con una lama di rasoio. Non premere una diapositiva quarzo perpendicolare al suo piano. In caso contrario, si rompe. Mantenere la lametta dal canale. Otherwise, introduce graffi sul canale. </li><li> Sciacquare i vetrini utilizzando un detergente per uso domestico da sfregamento con le dita. </li><li> Porre i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro. Tipicamente 5 a 15 vetrini possono essere collocati in un singolo barattolo. Aggiungere 10% detergenti per la casa e sonicare le diapositive per 20 minuti o più a lungo. Sciacquare i vetrini con una grande quantità di acqua tab. </li><li> Passare al punto 1.2. </li></ol>

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	<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaces+and+orientations:+much+to+FRET+about.">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li><li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes:+surface+passivation+and+immobilization.">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules.">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li><li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+that+resist+biodegradation.">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li><li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility.">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li><li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2007).</li><li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies.">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li><li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene+glycol)+layers+on+metal+oxide+surfaces:+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption.">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li><li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection.">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li><li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro.">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay.">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689 (2010).</li><li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces.">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li><li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level:+introducing+the+tools+and+applications.">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li><li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes.">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Passaggi critici all&#39;interno di questo protocollo È essenziale per rendere idrofila la superficie prima della reazione ammino-silanizzazione. Ciò è stato ottenuto attraverso l&#39;incisione piranha che genera i gruppi idrossilici liberi su una superficie di vetro / quarzo. Si raccomanda di non tenere la superficie incisa Piranha esposti sia H 2 O o aria per un lungo periodo di tempo da quando l&#39;idrofilia della superficie scende gradualmente. Le molecole NHS-estere PEG sono reattivi. Si consiglia di effettuare aliquote e memorizzarli sotto azoto a -20 º C. La durata della sostanza chimica APTES a temperatura ambiente è breve. Si consiglia di sostituirlo con uno nuovo ogni mese. Modifiche di questo protocollo Quando non è possibile utilizzare l&#39;attacco piranha per qualsiasi ragione pratica, si può incidere con KOH per un lungo periodo di tempo (ad esempio, overnight), che farà anche gruppi ossidrile esposti. L&#39;insidia di questo approccio alternativo è che la diapositiva diventa inutilizzabile dopo un paio di ricicli a causa di gravi graffi. Essa è spesso praticata per bruciare una superficie di vetro / quarzo utilizzando propano torcia, che è efficace per eliminare materiali organici fluorescenti 7. Questa procedura non è stata inclusa in questo protocollo perché è ridondante l&#39;incisione piranha. Si noti che questa procedura potenzialmente causare l&#39;ossidazione dei gruppi ossidrilici. Pertanto, questa procedura non deve essere eseguita una volta una superficie è stato inciso con KOH o soluzione Piranha. Quando un tampone con pH inferiore a 7 è utilizzata per l&#39;imaging singola molecola, la conformazione di PEG cambia da &quot;fungo&quot; a &quot;pennello&quot;, che riduce il grado di passivazione. Pertanto, quando si utilizza pH inferiore a 7,0, si raccomanda di passivazione ulteriormente la superficie usando Disuccinimidil tartrato &lt;sup&gt; 7. Prospettive Questo lavoro ha fornito un protocollo robusto per ottenere un&#39;elevata qualità passivazione della superficie. Questo protocollo sarà utile per studi di fluorescenza singola molecola che sono coinvolti con le proteine ​​14, nonché i complessi proteici all&#39;interno di estratti cellulari e immunoprecipita 15. Sarà ampiamente utilizzato per altre tecniche di singola molecola come la spettroscopia di forza e spettroscopia di coppia 16. Sarà utile anche per evitare cellule da adsorbire ad una superficie 17. Il protocollo previsto in questo lavoro è impegnativo per le procedure multi-step. Passivazione della superficie utilizzando lipidi PEG-8 e poli-lisina PEG 9 è disponibile come un approccio alternativo. Dal momento che, non richiedono reazioni chimiche è facile da implementare. Tuttavia, il grado di passivazione non è così elevata come quella conseguita attraverso modif chimicaicazione di una superficie.

Quando si esegue uno studio proteina a singola molecola è essenziale per ottenere una elevata qualità di passivazione della superficie in modo che l&#39;esperimento è libero da qualsiasi malfunzionamento proteina-superficie indotta o denaturazione 1,2. Mentre una superficie di vetro trattata con tensioattivi, come albumina di siero bovino, è comunemente utilizzato per studi di acido nucleico a singola molecola 3, il suo grado di passivazione non è sufficientemente elevata per gli studi di proteine. Una superficie di vetro rivestito con polimero (polietilene glicole, PEG) è superiore al 4-6 prestazioni passivazione. In tal modo, è diventato universalmente usato per gli studi di proteine ​​singola molecola da quando è stato introdotto in uno studio di fluorescenza singola molecola 7-10. La procedura di rivestimento in polimero richiede più trattamenti superficiali 7,11,12. Pertanto, è difficile seguire l&#39;intera procedura senza istruzioni dettagliate. Spesso il grado di passivazione superficiale varia a seconda del protocollo Is seguirono. Qui vi presentiamo un protocollo robusto con passo-passo le istruzioni, che rimuovere uno dei principali colli di bottiglia degli studi di proteine ​​singola molecola. Vedere la Figura 1 per una panoramica.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

Spettroscopia di fluorescenza singola molecola ha dimostrato di essere determinante nella comprensione di una vasta gamma di fenomeni biologici su scala nanometrica. Importanti esempi di ciò che questa tecnica può cedere alle scienze biologiche sono gli approfondimenti meccanicistici sulla proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. Quando interazioni di proteine ​​vengono sondati a livello di singola molecola, le proteine ​​oi loro substrati sono spesso immobilizzate su una superficie di vetro, che consente una osservazione a lungo termine. Questo schema immobilizzazione può introdurre artefatti indesiderati di superficie. Pertanto, è essenziale passivazione della superficie di vetro per renderlo inerte. Rivestimento di superficie utilizzando polietilene glicole (PEG) si distingue per le sue alte prestazioni nella prevenzione proteine ​​da non specificamente interagendo con una superficie di vetro. Tuttavia, la procedura di rivestimento polimerico è difficile, a causa della complicazione derivante da una serie di trattamenti superficiali e il requisito stringente che una superficie deveessere esente da qualsiasi molecole fluorescenti alla fine della procedura. Qui, forniamo un protocollo robusto con passo-passo le istruzioni. Si estende la pulizia di superfici tra cui piranha incisione, funzionalizzazione superficiale con gruppi amminici, e infine il rivestimento PEG. Per ottenere una elevata densità di uno strato PEG, si introduce una nuova strategia di trattamento della superficie con molecole di PEG su due turni, che migliora notevolmente la qualità di passivazione. Forniamo risultati rappresentativi, nonché consigli pratici per ogni fase critica in modo che chiunque possa raggiungere la passivazione della superficie di alta qualità.

Dopo il montaggio della camera microfluidica (Passo 7,1-7,6) e prima di effettuare Passo 7.7, si consiglia di effettuare il controllo di qualità della superficie PEGylated. Se la passivazione della superficie è stato fatto con successo, ci sono meno di 10 non specificamente adsorbite proteine ​​per area di esposizione (25 mm x 25 mm) osservata quando 1-10 nM proteina fluorescente viene aggiunto nella camera (figura 3a, sinistra). Quando una qualsiasi delle fasi di pulizia o di reazione non è stata correttamente effettuata, il numero di non-specifico proteine ​​assorbito aumenta in modo significativo, e lo schermo CCD può essere saturo di segnali di fluorescenza. Ad esempio, se l&#39;incisione piranha viene saltato, vi è 100 volte maggiore quantità di adsorbimento non specifico osservato (Figura 3a; confronta sinistra con mezzo). Quando il secondo passo PEGylation viene saltato, c&#39;era circa 3 temposa grande quantità di adsorbimento non specifico osservato (Figura 3b). Un basso grado di PEGylation si osserva quando vengono utilizzati prodotti chimici scaduti (ad esempio APTES conservati a temperatura ambiente per diversi mesi) (dati non riportati). La qualità della superficie scende giù quando anche una notevole quantità di tempo è passato da quando era PEGylated (Figura 3a; confronta sinistra con destra). Per la nostra migliore conoscenza, è la prima volta che vengono introdotti i due turni di PEGylation per gli studi di singola molecola. I due turni di PEGylation garantiscono la più alta qualità di PEG strato formazione (Figura 3b). La natura superiore del doppio PEGylation è ben visibile mostrato nei film (Confronta Movie 1a con Movie 1b). In questi film, i segnali di fondo da molecole fluorescenti in soluzione sono osservate per essere molto più debole quando il doppio PEGylation era<html> utilizzati, il che indica che le proteine ​​sono respinti più efficacemente dallo strato doppiamente pegilato. Anche se questo processo in due fasi è fortemente consigliata, la seconda fase PEGylation potrebbe essere saltato se l&#39;esperimento è tollerabile di passivazione non ottimale. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Schematica dei trattamenti superficiali (a) Un vetrino viene pulita con acetone, KOH, e soluzioni Piranha. Si è funzionalizzato con APTES e PEGylated con NHS-estere PEG. (B) Un vetrino viene pulita con KOH, nonché con la soluzione Piranha se necessario. Si è funzionalizzato con APTES e PEGylated con NHS-estere PEG. fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 2:. Camera microfluidica (a) Una camera monocanale. Il vetrino da microscopio ha due fori. Si è assemblato con un vetrino coprioggetto utilizzando due fette di un nastro adesivo a doppia faccia. (B) Una camera a tre canali. Il vetrino da microscopio ha sei fori. Si è assemblato con un vetrino coprioggetto utilizzando quattro fette di un nastro adesivo a doppia faccia. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: immagini CCD prese con le proteine ​​dye-marcato in soluzione. (A) immagini CCD sono stati presi dai prisma-tipo microscopia riflessione interna totale fluorescenza utilizzando una lente obiettivo 60X con 10 nM Cy3-labeld Rep in soluzione. (Sinistra) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo. (Middle) Una superficie era preparazionerosso secondo il protocollo in questo articolo, ma piranha attacco è stato ignorato. (A destra) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo e conservato per 3 mesi a -20 ° C sotto azoto. (B) immagini CCD scattate con 10 nM Cy3-labeld Rep in soluzione. (Sinistra) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo. (A destra) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo, ma il secondo turno di PEGylation stato saltato. Barra della scala = 5 micron. Movie 1: film CCD prese con le proteine ​​dye-marcato in soluzione. Film CCD sono state prese da prisma-tipo microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza utilizzando una lente obiettivo 60X con 10 nM Cy3-labeld Rep in soluzione. La risoluzione temporale è di 100 msec. (A) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo. (B) Una superficie è stata preparata seguendo il protocollo in questo articolo, ma il secondo turno di PEGylzione è stato saltato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Clicca qui</a> per vedere un film 1a e <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">clicca qui</a> per vedere un film 1b.

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Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Noi descriviamo un metodo per la passivazione una superficie di vetro con polietilenglicole (PEG). Questo protocollo copre pulizia delle superfici, funzionalizzazione superficiale, e rivestimento PEG. Introduciamo una nuova strategia per il trattamento della superficie con molecole di PEG su due turni, che produce una qualità superiore di passivazione rispetto ai metodi esistenti.

Passivazione della superficie per singola molecola proteica Studi

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

41.5K Views.  Delft University of Technology.  Noi descriviamo un metodo per la passivazione una superficie di vetro con polietilenglicole (PEG). Questo protocollo copre pulizia delle superfici, funzionalizzazione superficiale, e rivestimento PEG. Introduciamo una nuova strategia per il trattamento della superficie con molecole di PEG su due turni, che produce una qualità superiore di passivazione rispetto ai metodi esistenti. 

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Ricerca

Chimica

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Trasporto di nanotubi di carbonio modificati superficie attraverso una colonna di terreno

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Un metodo per manipolare Tensione superficiale di un metallo liquido tramite ossidazione superficiale e riduzione

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

Sintesi di ciclici polimeri e caratterizzazione di loro moto diffusivo allo stato fuso alla molecola Piano unico

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparazione di stabile biciclico Aziridinium ioni e loro anello-apertura per la sintesi di Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

Funzionalizzazione superficiale di Metal-Organic Frameworks per resistenza all'umidità migliorata

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) with a 4.6 nm pore size, and ordered silica porous matrix, SBA-15, with a 5.3 nm pore size. This work describes the surface properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the differently ordered porous materials with similar pore sizes. For this purpose, OMC and SBA-15 with highly ordered nanoporous structures are synthesized via impregnation of the silica matrix by applying a carbon precursor and by the sol-gel method, respectively. The porous structure of investigated systems is characterized by an N2 adsorption-desorption analysis at 77 K. To determine the electrochemical character of the surface of synthesized materials, potentiometric titration measurements are conducted; the obtained results for OMC shows a significant pHpzc shift toward the higher values of pH, relative to SBA-15. This suggests that investigated OMC has surface properties related to oxygen-based functional groups. To describe the surface properties of the materials, the contact angles of liquids penetrating the studied porous beds are also determined. The capillary rise method has confirmed the increased wettability of the silica walls relative to the carbon walls and an influence of the pore roughness on the fluid/wall interactions, which is much more pronounced for silica than for carbon mesopores. We have also studied the melting behavior of D2O confined in OMC and SBA-15 by applying the dielectric method. The results show that the depression of the melting temperature of D2O in the pores of OMC is about 15 K higher relative to the depression of the melting temperature in SBA-15 pores with a comparable 5 nm size. This is caused by the influence of adsorbate/adsorbent interactions of the studied matrices.

Here we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon (with a 4.6 nm pore size) and SBA-15 (with a 5.3 nm pore size). The work describes the surface and textural properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the materials.

Proprietà della superficie di sintetizzato nanoporosi carbonio e matrici di silice

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.