DEZA, ACH, und CJ wurden durch Starting Grants (ERC StG--2012-309509) durch den European Research Council unterstützt. J.-MN wurde von der National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) Korea unterstützt; und der Pioneer Research Center Programm (2012-009586) durch die NRF Koreas durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (MSIP) finanziert. Diese Arbeit wurde auch von Zentrum für Gesundheit BioNano-Guard von MSIP Korea als Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) gefördert unterstützt. YKL und J.-HH wurden von der Seoul Wissenschaft Fellowship Program der Stadt Seoul, Korea unterstützt. Das markierte Rep-Protein war ein großzügiges Geschenk von Dr. Sua Myong.

1. Schieben Vorbereitung und Reinigung Mikrofluidkammer aus einem Quarz-Objektträger und einem Deckglas besteht. Prismenartigen inneren Totalreflexion (TIRF)-Mikroskopie, wird die Oberfläche des Objektträgers abgebildet. Daher ist es wichtig, eine Quarz-Objektträger gründlich mit H 2 O, Aceton, KOH und Piranha-Lösung gereinigt werden. Th mehrstufige Reinigung beseitigt fluoreszierenden organischen Molekülen auf einer Oberfläche, die mit Einzelmolekülfluoreszenzmessungen beeinträchtigen. Darüber hinaus macht der Piranha Ätzen der Quarzoberfläche hydrophil durch Erzeugung Hydroxylgruppen. Die freien Hydroxylgruppen sind für die Amino-Silanisierung Reaktion in Schritt 3. <ol><li> Bohren Quarz Rutschen. Bohren Sie ein Paar Löcher in eine Quarz-Objektträger mit einer 3/4 mm Diamantbohrer (Abbildung 2a). Wenn mehrere Kanäle gewünscht werden, bohren mehr pairs von Löchern (Abbildung 2b). Diese Löcher sind zum Einspritzen von Lösungen in einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7 verwendet. <ol><li> Halten Sie den Bohrer nass in H 2 O während des Bohrens. H 2 O führt als Schmiermittel, wodurch die Lebensdauer des Bohrers erhöht. </li><li> Gelegentliche Wischen Sie die Spitze des Bohrers hilft Bohren von Löchern. </li><li> Nach dem Bohren, Markieren einer Seite der Folie zur einfachen Identifizierung während der PEGylierung Prozess. Die Marker können als Referenz verwendet werden, um spätere Verwirrung zu vermeiden. Zur Kennzeichnung kann ein Diamant-Bohrer verwendet werden. Verwenden Sie keine Kugelschreiber da die Tinte könnte auf der Oberfläche zu erhalten. </li></ol></li><li> Reinigung mit H 2 O. Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O. Spülen Sie die Folien Wiederholen Sie es 3 Mal und beschallen die Folien mit MilliQ H 2 O für 5 Minuten, um Schmutz zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und spülen Sie die Folien wieder 3 mal mitMilliQ H 2 O. Hinweis, dass 130 W ist die Beschallungsleistung für dieses Protokoll verwendet. Höhere Beschallungsleistung könnte die Lebensdauer der Quarz-Objektträger zu verringern. </li><li> Reinigung mit Aceton. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O mit Aceton. Beschallen Sie die Folien mit Aceton für 20 Minuten oder länger. </li><li> Spülen mit H 2 O. Entsorgen Sie die Aceton und spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O. Wiederholung für 3-mal, um jegliche Rückstände zu entfernen Aceton. </li><li> Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Übermäßige Ätzen (z. B. über Nacht KOH-Behandlung) wird die Qualität der Oberfläche zu verbessern, wird aber Kratzer, die mit Fluoreszenz-Bildgebung stören könnten einzuführen. </li><li> Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O 3-mal, um Spuren von KOH zu entfernen. </li><li> Piranha Ätzen. <ol><li> Die Objektträger in eine Duran Trägerhalter oder einem maßgeschneiderten Teflon Halter und place sie in einen Becher (1 L), die in einer chemischen Haube befindet. </li><li> Das Becherglas wird mit 450 ml H 2 SO 4. </li><li> Mit 150 ml H 2 O 2 für 3:1-Verhältnis zwischen H 2 SO 4 und H 2 O 2. Sobald die Lösung beginnt zu sieden spontan erhöht über 90 ° C die Temperatur Sicherstellen, dass die H 2 O 2-Lösung bei Raumtemperatur vor dem Starten der Reaktion. Ansonsten kann die Temperatur der siedenden Lösung niedriger als 90 ° C sein </li><li> Rühren Sie die Lösung für die richtige Mischung und lassen Sie das Becherglas ungestört für 20 min. </li><li> Nehmen Sie die Folien aus dem Piranha-Lösung zusammen mit dem Trägerhalter, und steckte sie in einen Objektträgerhalter enthält MilliQ H 2 O. Unterdessen werfen Sie die Piranha-Lösung in einem bestimmten Abfallflasche, wenn es Zimmertemperatur erreicht. </li><li> Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Folien 3 mal Besondere Sorgfalt sollte in weiteren ste genommen werdenps, um jede mögliche Verunreinigung der Folien zu vermeiden. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. Es wird empfohlen, sofort mit den folgenden Schritten fortfahren. * Achtung: Das Piranha-Lösung ist äußerst reaktiv. Beim Umgang mit dieser Lösung sollte besondere Vorsicht eingenommen werden. Darüber hinaus, wenn aus Versehen mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton vermischt, kann es zu einer Explosion führen. </li></ol></li></ol> 2. Coverslip Reinigung Ein mikrofluidischen Kammer besteht aus einem Quarz-Objektträger und eine Abdeckung s Lippe zusammen. Wenn ein TIRF-Mikroskop Prismentyp verwendet wird, wird die Oberfläche eines Deckglases nicht abgebildet. Daher ist es ausreichend, ein Deckglas nur mit H 2 O und KOH reinigen. Im Falle muss ein Deckglas abgebildet werden (zB über das Ziel-Typ-TIRF-Mikroskopie), empfiehlt es sich, die Deckgläser mit Piranha-Lösung (Schritt 1.7) zu behandeln. Beachten Sie, dass, wenn PEGylation der Deckfläche ist nicht von hoher Qualität, könnte es als Senke für Proteine ​​wirken eind zu Schwankungen in der Proteinkonzentration zu ergeben. <ol><li> Spülen mit H 2 O. Platz Deckgläsern (24 x 30, 24 x 40 oder 24 x 50 mm 2) in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 Deckgläser in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Deckgläser 3 mal </li><li> Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Deckgläser für 20 Minuten oder länger. </li><li> Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Deckgläschen 3 mal mit MilliQ H 2 O, um Spuren von KOH zu entfernen. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Amino-Silanisierung von Folien und Deckgläser Funktionalisieren der Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser mit Amingruppe über die Amino-Silanisierung Chemie. Methanol wird als Lösungsmittel und Essigsäure als Katalysator für die Amino-Silanisierung Reaktion verwendet. <ol><li> Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O in der Färbung Gerichte (ab STEPs 1 und 2) mit Methanol. Halten Sie die Folien und die Deckgläser in Methanol bis Schritt 3.3. Da Verunreinigungen in Methanol die Folien und die Deckgläser in Methanol für eine unnötig lange Zeit (zB mehrere Stunden) lagern an die Oberfläche zu adsorbieren. </li><li> Vorbereiten Amino-Silanisierung Lösung. <ol><li> Ein Pyrex-Kolben mehrmals mit Methanol spülen. Beschallen der Kolben mit Methanol für 5 min oder länger. Es wird empfohlen, einen dedizierten Kolben, die sauber gehalten wird, zu haben. </li><li> Werden 100 ml Methanol in den Kolben. </li><li> 5 ml Essigsäure. </li><li> 3 ml APTES (3-Aminopropyltrimethoxysilan) und vorsichtig durch Schütteln. </li></ol></li><li> Amino-Silanisierung. Ersetzen Sie das Methanol in den Gerichten, die Färbung der Objektträger und Deckgläser mit dem Aminosilanisierung Reaktionsgemisch enthalten. <ol><li> Inkubation für 20-30 min. Während der Inkubation beschallen einmal für 1 min. </li></ol></li><li> Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die eineminosilanization Reaktion mit Methanol. Entsorgen Sie die Methanol und fügen Sie eine neue Methanollösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li></ol> 4. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (Die erste Runde) Passivieren der Amin-beschichtete Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser durch Konjugation von NHS-Ester Polyethylenglykol (PEG). Diese Reaktion wird mit der Sättigungskonzentration der PEG-Lösung bei pH 8,5 über Nacht durchgeführt. <ol><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Trocknen der Objektträger und Deckgläser unter Verwendung von N 2-Gas und sie in saubere Pipettenkästen in einer Weise, dass die Seite, die zu sein PEGylierten nach oben weist. Die Pipette Feld ist teilweise mit MilliQ H 2 O gefüllt Dies verhindert, dass feuchte Umgebung PEGylation Lösung vor dem Austrocknen während der Inkubation über Nacht. </li><li> Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5) durch Auflösen von 84 mg Natriumbicarbonat in 10 mlMilliQ H 2 O. Es besteht keine Notwendigkeit der Einstellung des pH. Diese Lösung kann für den nächsten Einsatz (zB Step 6.1) eingefroren gelagert werden. </li><li> Vorbereiten PEGylation Lösung. <ol><li> Vorbereitung einer Mischung von PEG 0,2 mg biotinylierte PEG-NHS-Ester (5.000 Da) und 8 13 mg NHS-Ester von mPEG (5.000 Da) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Bei der Herstellung einer Anzahl N von Folien herzustellen N-fache Menge der PEG-Mischung in einem einzigen Rohr. </li><li> Add 64 ul (oder N mal 64 &amp;mgr; l für eine Anzahl N von Folien) des frisch hergestellten Puffer (Schritt 4.2). Pipettieren Sie es auf und ab, um sie vollständig zu lösen. </li><li> Zentrifugieren mit 16.100 × g für 1 min, um Luftblasen zu entfernen. Danach pipettieren. Andernfalls wird Luftblasen bilden, die mit PEGylation stören bei Schritt 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Tropfen 70 ul der PEGylierung Mischung auf eine getrocknete Folie aus Quarz Schritt 4.1. Verwenden Sie 90 ul bei 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Sanft statt eines getrockneten Deckglas aus Schritt 4.1 über die Lösung. </li><li> Um eine einheitliche und hohe Qualität der PEGylation haben, kümmern sich nicht um Luftblasen einzuführen. Aufgrund der Oberflächenspannung, die meisten der Luftbläschen spontan verlassen das Reaktionsvolumen innerhalb von fünf Minuten aufgrund der Oberflächenspannung. </li><li> Die Folien Inkubation in einem dunklen und feuchten Umgebung. Die Halbwertszeit von NHS-Ester PEG, die wir verwenden bei pH 8 ist etwa eine Stunde. Zumindest inkubieren für 2 Stunden. Inkubation über Nacht führt zu höherer Qualität der PEGylierung (Daten nicht gezeigt). </li></ol></li></ol> 5. Langzeitlagerung Speichern der PEGyliertem Rutschen und Deckgläser in N 2 bei -20 º C. <ol><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Die Rutsche und das Deckglas vorsichtig zerlegen, indem das Deckglas zu einer Seite, spülen sie mit MilliQ H 2 O, und trocknen Sie sie mit N 2. </li><li> Speichern von Dias und Deckgläser. For den sofortigen Einsatz, folgen Sie den Vorgang für die zweite Runde der PEGylation (Schritt 6). Um für einen längeren Zeitraum zu speichern, befolgen Sie die nächsten Schritte. <ol><li> Legen ein Paar von dem Schieber und dem Deckglas in einem 50 ml-Röhrchen, so dass die PEGylierte Flächen abgewandten zueinander. </li><li> Teilweise schließen die Röhre, Vakuum der Röhre, und füllen Sie es mit N 2. Diese Schritte helfen Erhaltung der PEGylierten Fläche für einen langen Zeitraum. Schrauben Sie den Schlauch fest und bewahren Sie sie bei -20 ° C Die Qualität der Folien bleibt gut für bis zu 3 Monate (Abbildung 3, rechts). </li></ol></li></ol> 6. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (der zweiten Runde) Weitere Runde der PEGylation die PEG-Schicht dichter zu machen und auch, um alle verbleibenden Aminogruppen auf der Oberfläche zu stillen. Der Einsatz von Kurz NHS-Ester PEG-Moleküle (333 Da) wirksam bei der Durchdringung in eine bestehende PEG-Schicht sein. Es ist recfohlen, diese zweite Runde der PEGylation rechts, bevor Sie eine Diashow zu tun. <ol><li> Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5). Die gefrorene Lösung aus Schritt 4.2 können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Vorbereiten PEGylation Lösung. Auflösen 7 ul 250 mM MS4-PEG in 63 ul des Natriumbicarbonat-Puffer. </li><li> PEGylation. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 4.4. Inkubation für 30 Minuten bis zu über Nacht. </li><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Demontieren Sie das Paar der Folie und das Deckglas, spülen sie mit MilliQ H 2 O, trocknen Sie sie mit N 2, und bewahren Sie sie an einem sauberen Pipette-Box. Gehen Sie zur Montage einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7. </li></ol> 7. Montage eines Mikrofluidik-Kammer Montage einer mikrofluidischen Kammer mit einem Paar aus einer PEG Quarz-Objektträger und Deckglas auflegen. Doppelseitiges Klebeband wird als Abstandshalter verwendet. Die Kammer ist mit Epoxy Klebstoff abgedichtet und soLösungen werden durch die Löcher in dem Quarz-Objektträger eingebracht. <ol><li> Legen Sie eine Quarz-Objektträger auf einer ebenen Fläche mit pegylierten Seite nach oben. </li><li> Einen Kanal (Breite 5 bis 7 mm) schräg auf die Oberfläche PEGylierten indem doppelseitige Klebebänder über den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Löcher in der Mitte des Kanals positioniert ist. Achten Sie darauf, das pegylierte Oberfläche während des Prozesses der Herstellung eine Kammer zu verwöhnen. Es ist möglich, eine Multi-Channel-Rutsche und das Festhalten, indem die doppelseitigen Klebebänder unterschiedlich (siehe Abbildung 2) zu machen. </li><li> Sanft statt eine PEG Deckglas auf, um die Kammer zu vervollständigen. Das mit PEG Seite sollte nach unten. </li><li> Verschließen Sie die Kammer, indem Sie die Deckglas über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Tun Sie es sanft, aber gründlich, so dass die Kammer wird wasserdicht versiegelt. </li><li> Schließen die Kanten der Kammer mit Epoxy Klebstoff. </li><li> Immobilisieren Streptavidin oder Neutravidin auf diebiotinylierten PEG-Schicht durch Zugabe von 50 ul 0,1 mg / ml Streptavidin oder Neutravidin Lösung in T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl-Puffer) unter Verwendung einer Pipette p200. Nach 1 min Inkubation bündig mit 100 ul Puffer T50. </li><li> In biotinylierten biologischen Molekülen für Einzelmolekül-Imaging. </li></ol> 8. Schieben Recycling Recycling Quarz Rutschen. Gebrauchte Folien werden durch Abnehmen der Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder recycelt. <ol><li> Nach Gebrauch speichern die Kammern in Leitungswasser. Langzeit-Inkubation in Wasser erleichtert die Demontage der Kammern. </li><li> Kochen Sie die Kammern in Leitungswasser mit Hilfe einer Mikrowelle. Verwenden Sie ein Pyrex-Becher. Kochen Sie für 10 Minuten oder länger. </li><li> Nehmen Sie die Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder mit einer Rasierklinge. Sie drücken eine Quarz-Objektträger nicht senkrecht zu ihrer Ebene. Andernfalls bricht es. Halten Sie die Rasierklinge aus dem Kanal. Otchts, sonst führt sie Kratzer auf dem Kanal. </li><li> Spülen Sie die Folien mit einem Haushaltsreinigungsmittel durch Reiben mit den Fingern. </li><li> Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. In 10% Haushaltsreiniger und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Mit einer großen Menge Wasser abspülen Registerkarte Folien. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.2. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls Es ist wichtig, die Oberfläche hydrophil vor dem Amino-Silanisierungsreaktion machen. Dies wurde durch die Piranhas Radierung, die die freien Hydroxylgruppen an einem Glas / Quarz-Oberfläche erzeugt erreicht. Es wird empfohlen, den Piranha geätzte Oberfläche auf H 2 O oder Luft für eine lange Zeit, da die Hydrophilie der Oberfläche ausgesetzt zu halten und nach unten geht. Der NHS-Ester-PEG-Molekülen reaktiv sind. Es wird empfohlen, Teilmengen zu machen und in -20 ° C lagern sie unter Stickstoff Die Haltbarkeit der chemischen APTES bei Raumtemperatur gering ist. Es wird empfohlen, ihn durch einen neuen zu ersetzen jeden Monat. Modifikationen dieses Protokolls Wenn Sie nicht mit dem Piranha-Ätzen für jede praktische Vernunft, können Sie Ätzen mit KOH für einen längeren Zeitraum (z. B. overnight), die auch machen wird Hydroxylgruppen ausgesetzt. Die Falle dieses alternativen Ansatzes ist, dass der Schieber wird nach ein paar Rückführungen aufgrund der schweren Kratzer unbrauchbar. Es wird oft praktiziert, um ein Glas / Quarz-Oberfläche brennen Propan Fackel, die wirksam bei der Beseitigung fluoreszierenden organischen Materialien 7 ist. Dieses Verfahren wurde in diesem Protokoll enthalten, weil sie redundant Piranha Ätzen ist. Beachten Sie, dass diese Prozedur möglicherweise eine Oxidation der Hydroxylgruppen führen. Daher sollte dieses Verfahren nicht durchgeführt werden, wenn eine Oberfläche wurde unter Verwendung von KOH oder Piranha-Lösung geätzt. Wenn ein Puffer mit pH-Wert unter 7 zur Einzelmolekül-Imaging verwendet, die Konformation ändert sich von PEG &quot;Pilz&quot; auf &quot;Bürste&quot;, der den Grad der Passivierung. Deshalb, wenn pH-Wert unter 7,0 verwendet wird, empfiehlt es sich, die Oberfläche mit Disuccinimidylester Tartarat &lt;weiter zu passivierensup&gt; 7. Perspektiven Diese Arbeit hat ein robustes Protokoll für die Erreichung hoher Qualität Oberflächenpassivierung Verfügung gestellt. Dieses Protokoll wird nützlich für Einzelmolekül-Fluoreszenz-Studien, die mit Proteinen 14 sowie Protein-Komplexe im Zellextrakten immunpräzipitiert beteiligt sind und 15 sein. Es wird häufig für andere Einzelmolekültechniken wie Kraft-und Drehmoment-Spektroskopie Spektroskopie 16 verwendet werden. Es wird auch zur Verhinderung von Adsorption von Zellen an eine Oberfläche 17 sein. Die in dieser Arbeit vorgesehenen Protokoll verlangt für seine Multi-Schritt-Verfahren. Oberflächenpassivierung mit Lipid-PEG 8 und Poly-Lysin-PEG-9 als Alternative zur Verfügung. Da sie keine chemischen Reaktionen ist es einfach zu implementieren erfordern. , Ist der Grad der Passivierung jedoch nicht so hoch wie die durch chemische modif erreichtication einer Oberfläche.

Bei der Durchführung einer Einzel-Molekül-Protein-Studie ist es wichtig, eine hohe Qualität der Passivierung zu erreichen, so dass das Experiment ist frei von jeder Oberfläche-induzierten Proteinfehlfunktion oder Denaturierung 1,2. Während eine Glasoberfläche mit Tensiden, wie Rinderserumalbumin, wird allgemein für Einzelmolekül Nukleinsäure Studien 3 verwendet wird, ist der Grad der Passivierung nicht hoch genug für Proteinstudien. Eine Glasoberfläche mit Polymer (Polyethylenglykol, PEG) beschichtet ist, ist in der Passivierung Leistung 4-6 überlegen. Dabei hat es sich für Einzel-Molekül-Protein-Studien allgemein verwendete, seit es zu einem Einzelmolekül-Fluoreszenz-Studie 10.7 eingeführt wurde. Die Polymerbeschichtung Verfahren mehrere Oberflächenbehandlungen 7,11,12. Daher ist es schwierig, die ganze Prozedur ohne detaillierte Anweisungen zu befolgen. Oft ist der Grad der Oberflächenpassivierung variiert je nachdem, welches Protokoll is gefolgt. Hier präsentieren wir eine robuste Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen, die eine der wichtigsten Engpässe von Einzelmolekül-Proteinstudien entfernen wird. Siehe Abbildung 1 für Übersicht.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Spektroskopie hat sich maßgeblich an Verständnis einer Vielzahl von biologischen Phänomene auf der Nanoskala zu sein. Wichtige Beispiele für das, was diese Technik zu biologischen Wissenschaften ergeben sind die mechanistische Erkenntnisse über Protein-Protein-und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Wenn Interaktionen von Proteinen auf Einzelmolekülebene untersucht werden die Proteine ​​oder ihre Substrate oft auf einer Glasoberfläche, die für eine Langzeitbeobachtung ermöglicht immobilisiert. Diese Immobilisierung Schema kann unerwünschte Oberflächenartefakten führen. Daher ist es wichtig, die Glasoberfläche zu passivieren, es inert zu machen. Oberflächenbeschichtung Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) zeichnet sich durch seine hohe Leistung bei der Verhinderung von Proteinen aus nicht-spezifisch mit einer Glasoberfläche interagieren. Jedoch ist das Polymer-Beschichtungsverfahren schwierig, aufgrund der Komplikation, die sich aus einer Reihe von Oberflächenbehandlungen und die strenge Anforderung, dass eine Oberfläche musswird am Ende des Verfahrens frei von fluoreszierenden Molekülen. Hier bieten wir eine robuste Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Es umfasst Oberflächenreinigung einschließlich Piranha Radierung, Funktionalisierung von Oberflächen mit Amingruppen und schließlich PEG Beschichtung. Um eine hohe Dichte eines PEG-Schicht zu erhalten, führen wir eine neue Strategie zur Behandlung der Oberfläche mit PEG-Molekülen mit zwei Umläufen, die merklich die Qualität der Passivierung verbessert. Wir stellen repräsentative Ergebnisse sowie praktische Tipps für jeden kritischen Schritt, so dass jeder die hohe Qualität Oberflächenpassivierung erreichen können.

Nach der mikrofluidischen Kammeranordnung (Schritt 7,1 bis 7,6) und vor der Durchführung von Schritt 7.7, ist es ratsam, für die Durchführung der Qualitätskontrolle der PEG Oberfläche. Wenn die Oberflächenpassivierung erfolgreich durchgeführt wurde, gibt es weniger als 10 nicht-spezifisch adsorbierte Proteine ​​pro Abbildungsfläche (25 mm x 25 mm) beobachtet, wenn 1-10 nM fluoreszenzmarkierten Proteins (Abbildung 3, links) in die Kammer gegeben. Wenn eine der Reinigungs-oder Reaktionsschritte nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, adsorbiert die Anzahl der nicht-spezifisch Proteine ​​erhöht, und der CCD-Schirm kann durch Fluoreszenzsignale gesättigt. Zum Beispiel, wenn der Piranha Ätzen übersprungen wird, gibt es 100 Mal eine größere Menge der beobachteten unspezifischen Adsorption (Fig. 3a, mit der mittleren linken vergleichen). Wenn die zweite PEGylation Schritt wird übersprungen, es war ungefähr 3 maleinen größeren Menge an nicht-spezifischer Adsorption beobachtet werden (Abbildung 3b). Ein niedriger Grad der PEGylierung beobachtet, wenn abgelaufen Chemikalien (zB APTES bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert) werden (Daten nicht gezeigt). Die Qualität der Oberfläche fällt auch ab, wenn eine erhebliche Menge an Zeit vergangen, seit es war PEGyliertem geben (Abbildung 3a, vgl. links mit rechts). Unseres Wissens ist es das erste Mal, dass die beiden Runden der PEGylation für Einzelmoleküluntersuchungen eingeführt. Die zwei Runden der PEGylation garantieren die höchste Qualität von PEG Schichtbildung (Bild 3b). Die überlegene Art der Doppel PEGylation ist prominent in den Filmen gezeigt (vgl. 1a Film mit Movie-1b). In diesen Filmen werden die Hintergrundsignale von fluoreszierenden Molekülen in Lösung beobachtet sehr viel schwächer als die doppelte PEGylierung zu sein<html> verwendet, was bedeutet, dass Proteine ​​werden dadurch von der doppelt PEGylierte Schicht abgestoßen. Obwohl das Zwei-Schritt-Verfahren wird dringend empfohlen, könnte der zweite PEGylation Schritt übersprungen werden, wenn Ihr Experiment ist erträglich nicht optimale Passivierung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1:. Schema der Oberflächenbehandlungen (a) einen Objektträger mit Aceton, KOH und Piranha-Lösung gereinigt. Es ist mit APTES und mit PEG-NHS-Ester funktionalisierten PEG. (B) Ein Deckglas wird mit KOH, sowie mit Piranha-Lösung gegebenenfalls gereinigt. Es ist mit APTES und mit PEG-NHS-Ester funktionalisierten PEG. fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 2:. Microfluidic Kammer (a) Ein Single-Channel-Kammer. Der Mikroskop-Objektträger hat zwei Löcher gebohrt. Es wird mit einem Deckglas mit zwei Scheiben eines doppelseitigen Klebeband montiert. (B) Ein Drei-Kanal-Kammer. Der Mikroskop-Objektträger hat sechs Löcher gebohrt. Es wird mit einem Deckglas mit vier Scheiben eines doppelseitigen Klebeband montiert. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3: CCD-Bilder mit Farbstoff-markierten Proteine ​​in Lösung aufgenommen. (A) CCD-Bilder wurden durch Prisma-Typ-Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit einem 60X Objektiv mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. (Links) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel erstellt. (Mitte) Eine Oberfläche war Vorbereitungrot nach dem Protokoll in diesem Artikel, aber Piranha Ätzen wurde übersprungen. (Rechts) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll hergestellt, das in diesem Artikel und für 3 Monate bei -20 º C unter Stickstoff gelagert. (B) CCD-Aufnahmen mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. (Links) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel erstellt. (Rechts) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel vorbereitet, aber die zweite Runde der PEGylation übersprungen wurde. Maßstabsbalken = 5 um. Film 1: CCD-Filme mit Farbstoff-markierten Proteine ​​in Lösung aufgenommen. CCD-Filme wurden von Prisma-Typ-Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit einem 60X Objektiv mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. Die Zeitauflösung beträgt 100 ms. (A) Eine Oberfläche wurde nach dem Protokoll hergestellt, das in diesem Artikel. (B) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel vorbereitet, aber die zweite Runde der PEGylation wurde übersprungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Klicken Sie hier</a> , um Film-1a anzeigen und <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">klicken Sie hier</a> , um Film-1b zu sehen.

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Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Wir beschreiben ein Verfahren zum Passivieren einer Glasoberfläche unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG). Dieses Protokoll umfasst die Oberflächenreinigung, Oberflächen Funktionalisierung und PEG-Beschichtung. Wir führen eine neue Strategie für die Behandlung der Oberfläche mit PEG-Molekülen über zwei Runden, die im Vergleich zu bestehenden Methoden überlegene Qualität der Passivierung ergibt.

Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

41.4K Aufrufe.  Delft University of Technology.  Wir beschreiben ein Verfahren zum Passivieren einer Glasoberfläche unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG). Dieses Protokoll umfasst die Oberflächenreinigung, Oberflächen Funktionalisierung und PEG-Beschichtung. Wir führen eine neue Strategie für die Behandlung der Oberfläche mit PEG-Molekülen über zwei Runden, die im Vergleich zu bestehenden Methoden überlegene Qualität der Passivierung ergibt. 

Serie: Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Forschung

Chemie

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Transport von oberflächenmodifizierte Kohlenstoff-Nanoröhren durch eine Bodensäule

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Eine Methode, die Oberflächenspannung eines Liquid Metal manipulieren via Oberfläche Oxidation und Reduktion

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

Synthese cyclischer Polymere und Charakterisierung ihrer Diffusionsbewegung im geschmolzenen Zustand auf der Einzelmolekülebene

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Vorbereitung der stabile bicyclische Aziridinium Ionen und ihre Ring-Öffnung für die Synthese von Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

Oberfläche Funktionalisierung der Metall-organischen Frameworks für verbesserte Feuchtigkeitsbeständigkeit

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) with a 4.6 nm pore size, and ordered silica porous matrix, SBA-15, with a 5.3 nm pore size. This work describes the surface properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the differently ordered porous materials with similar pore sizes. For this purpose, OMC and SBA-15 with highly ordered nanoporous structures are synthesized via impregnation of the silica matrix by applying a carbon precursor and by the sol-gel method, respectively. The porous structure of investigated systems is characterized by an N2 adsorption-desorption analysis at 77 K. To determine the electrochemical character of the surface of synthesized materials, potentiometric titration measurements are conducted; the obtained results for OMC shows a significant pHpzc shift toward the higher values of pH, relative to SBA-15. This suggests that investigated OMC has surface properties related to oxygen-based functional groups. To describe the surface properties of the materials, the contact angles of liquids penetrating the studied porous beds are also determined. The capillary rise method has confirmed the increased wettability of the silica walls relative to the carbon walls and an influence of the pore roughness on the fluid/wall interactions, which is much more pronounced for silica than for carbon mesopores. We have also studied the melting behavior of D2O confined in OMC and SBA-15 by applying the dielectric method. The results show that the depression of the melting temperature of D2O in the pores of OMC is about 15 K higher relative to the depression of the melting temperature in SBA-15 pores with a comparable 5 nm size. This is caused by the influence of adsorbate/adsorbent interactions of the studied matrices.

Here we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon (with a 4.6 nm pore size) and SBA-15 (with a 5.3 nm pore size). The work describes the surface and textural properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the materials.

Oberflächeneigenschaften von synthetisierten nanoporöse Carbon und Silica-Matrizen

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.