Questo lavoro è stato finanziato dal BBSRC e il Wellcome Trust. Vorremmo ringraziare Simon Walker per l&#39;assistenza con l&#39;imaging e Felix Krueger per un aiuto con analisi bioinformatica.

1. Generazione di sonde di DNA marcate direttamente da Nick traduzione Nota: le sonde marcate direttamente realizzati dalla BAC (100-250 kb) realizzare regolarmente i segnali luminosi. Se sono necessarie sonde più piccole, utilizzare fosmidi (40-50 kb) o anche plasmidi contenenti inserti kb 5-10. Identificare BAC o fosmid cloni corrispondenti a geni specifici utilizzando Ensemble o browser genoma UCSC. Preparare BAC DNA di alta qualità da ripetute precipitazioni o utilizzare i kit disponibili in commercio. Il meno la preparazione è contaminato con DNA genomico batterico, meno sonda è necessaria per ogni diapositiva. Eseguire l&#39;etichettatura in due fasi: traduzione nick introducendo aminoallyl-dUTP e accoppiamento chimica di un colorante ammina-reattiva. 1.1. Nick traduzione Durante la traduzione nick, DNasi I è utilizzato per creare singole-filamento. DNA polimerasi I allunga &#39;estremità di questi&#39; del 3 nick &quot;, sostituendo i nucleotidi esistenti con quelli nuovi, t<html> dichiara &#39;tradurre&#39; il nick e fornendo così l&#39;opportunità di incorporare nucleotidi marcati. Aminoallyl-dUTP viene scelta a causa della incorporazione efficiente dalla DNA polimerasi I e il suo potenziale per un successivo attacco chimico per coloranti reattivi-ammina o apteni. E &#39;fondamentale per ottenere il giusto equilibrio tra DNasi I intaccare e DNA polimerasi I di traduzione; troppo DNasi I comportino un&#39;eccessiva digestione DNA dando a basso rendimento e dimensioni dei frammenti brevi, troppo poco non produrre abbastanza nick per la polimerasi per iniziare la traduzione, dando grande dimensione del frammento e la scarsa integrazione di aminoallyl-dUTP. Il seguente protocollo funziona bene, ma può essere necessario per titolare la DNAsi I lotti differenti o da diversi fabbricanti. <ol><li> Impostare l&#39;etichettatura reazione in ghiaccio e incubare per 2 ore a 16 ° C. Questo dovrebbe produrre 0,5-1 mg DNA nick-tradotto e può essere installato su. Diluire DNasi I 1:30 DNasi I tampone (cioè 0,3 U / mL). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione di magazzino </td><td> Volume o importo </td></tr><tr><td> BAC DNA </td><td></td><td> 5-10 mcg </td></tr><tr><td> NTB tampone </td><td> 10x </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1 M </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> 10x </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> DNA polimerasi I </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 microlitri </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 ml (di una diluizione 1:30) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td></td><td> a 50 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Esegui 1 microlitri su un gel di agarosio al 2% per controllare la dimensione dei frammenti marcati. Mentre si esegue il gel, tenere la reazione in ghiaccio. Successo nick translation si tradurrà in uno striscio con la maggior parte dei frammenti che corrono tra 150 bp e 700 bp con alcuni frammenti più grandi di ~ 1 kb (PUNTO CRITICO: vedi Rappresentante dei risultati). Se necessario, aggiungere un altro 1 ml di una fresca 1:30 DNasi I diluizione e incubare a 16 ° C per 15-30 min. Tempo di incubazione varierà secondo la quantità e la qualità di BAC DNA. </li><li> Inattivare DNasi I mediante riscaldamento a 75 ° C per 10 min. </li><li> Clean-up DNA ammina-modificato utilizzando un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 ml H 2 O. </li><li> Etanolo DNA precipitato per aggiunta di 10 microlitri NaOAc 3 M (pH 5.2) e 275 ml di etanolo. Lasciare a -20 ° C per almeno 1 ora o durante la notte. Girare alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con 500 microlitri 70% di etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. Questo passaggio rimuove tracce di ammine che interferiscono con la reazione di marcatura. Risospendere il pellet in 6 ml H 2 O per 1x reazione iniziale. </li><li> Usare 1 microlitri per determinare la concentrazione del DNA ammina-modificatomediante spettroscopia UV microvolumi. </li></ol> 1.2. Accoppiamento del colorante fluorescente Etichettatura fluorescenza della sonda è ottenuta mediante accoppiamento chimico del colorante. Alexa Fluor succinimidyl coloranti esteri reagiscono con le ammine di DNA amino-allyldUTP modificato per formare un legame covalente, producendo in tal modo sonde marcate direttamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e coloranti hanno avuto successo per questo processo. <ol><li> Regolare 4 mg di DNA amino-allil modificato per un volume di 5 microlitri, riscaldare a 95 ° C per 5 min, scattare raffreddare su ghiaccio, e aggiungere 3 ml di 0,2 M NaHCO3. </li><li> Sciogliere un&#39;aliquota di colorante reattivo ammina in 2 microlitri DMSO anidro a temperatura ambiente. Aggiungere 8 ml DNA modificato con NaHCO3, vortice, impulso di spin e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora. </li></ol> Nota: I coloranti reattivi ammine possono essere usati per etichettare più di una sonda basata sul seguente schema. Dal momento oolo 10-20 ng di sonda viene utilizzata per l&#39;etichettatura di diapositive, 1 mg dà abbastanza sonda per 50-100 diapositive. È anche possibile memorizzare DNA ammina-modificato per reazioni di marcatura future a -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità di DNA </td><td> Volume di DNA </td><td> 0,2 M NaHCO3 </td><td> Volume di colorante </td><td> Totale </td><td> Abbastanza per </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1,25 ml ciascuno </td><td> 0,75 ml ciascuno </td><td> 0,5 microlitri ciascuno </td><td> 2,5 microlitri (1/4) </td><td> 50-100 diapositive ciascuno </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 mcg </td><td> 1,67 ml ciascuno </td><td> 1 microlitri ciascuno </td><td> 0,67 ml ciascuno </td><td> 3,34 microlitri (1/3) </td><td> 65-130 diapositiva ogni </td></tr><tr><td> 2 x 2 mg </td><td> 2,5 microlitri ciascuno </td><td> 1,5 ml ciascuna </td><td> 1 microlitri ciascuno </td><td> 5 microlitri (1/2) </td><td> 100-200scivola ogni </td></tr><tr><td> 1 x 4 microgrammi </td><td> 5 microlitri </td><td> 3 ml </td><td> 2 microlitri </td><td> 10 microlitri (completo) </td><td> 200-400 diapositive </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Aggiungere 90 ml di H 2 O e purificare sonda marcata con un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 microlitri 10 mMTris-Cl (pH 8,5). </li><li> Determinare la concentrazione della sonda e l&#39;efficienza di etichettatura mediante spettroscopia gamma completa microvolumi (vedi figura 2) utilizzando le equazioni di Beer-Lambert (istruzioni riportate nella scheda tecnica che accompagna i Alexa Fluor coloranti reattivi o si possono trovare on-line). Sonde contenenti 3-6 coloranti per 100 bp funzionano bene. Sonde con bassi gradi di incorporazione possono dare segnali FISH deboli. In alternativa, eseguire 5 microlitri su un gel di agarosio al 2% del DNA senza macchia e controllare l&#39;incorporazione del colorante fluorescente utilizzando una phosphoimager. Posta-macchia il gel con bromuro di etidio o alternative di colorazione del DNA e confrontare il DNA marcato a DNA totale. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. FISH DNA Tramite le seguenti fasi, le cellule di interesse sono fissati alle diapositive e permeabilizzate. DNA cellulare e sonde marcate direttamente sono poi denaturati insieme su una piastra calda e ibridati durante la notte in una camera umidificata a tenuta di luce. 2.1. Giorno 1 <ol><li> Sonda Precipitazioni Nota: le sonde precipitato a un certo punto durante Day 1. Questo può essere comodamente eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve essere fatto all&#39;inizio della giornata. <ol><li> Mescolare 10-20 ng sonda direttamente etichettato, 6 ml C 0 t-1 DNA (6 mg), 1 ml DNA a singolo filamento da testicoli di salmone (9,7 mg) e regolare il volume a 100 ml con acqua. </li><li> Aggiungere 10 ml 3 M NaOAc e 275 microlitri EtOH, e mescolare nel vortex. Precipitare per almeno 1 ora a -20 ° C. </li><li> Spin in microcentrifuga alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con EtOH 70% e far girare di nuovo. Secco pellete risospendere in 5 microlitri formammide deionizzata. Sospendere di nuovo per 30 minuti a 37 ° C sotto agitazione a 1000 giri al riparo dalla luce (posto sopra il foglio thermomixer). </li><li> Aggiungere 5 ml di destrano solfato mix e agitare per altri 10 min a 37 ° C al riparo dalla luce nuovamente. Pipettare su e giù appena prima di dispensazione sul vetrino. Nota: Per la pittura cromosoma combinata con sonde BAC, interi cromosomi sonde di pittura che sono forniti in pronta all&#39;uso mix di ibridazione sono una scelta conveniente. Risospendere il precipitato sonda BAC (con C 0 t1 DNA e DNA a singolo filamento da testicoli di salmone) in 10 microlitri cromosoma vernice mescolare pipettando su e giù. Incubare a 37 ° C agitando a 300-500 rpm per 10 min. Utilizzare 10 ml di cromosoma vernice / BAC sonda mix per punto. </li></ol></li><li> Collegamento celle di diapositive Nota: le cellule propensione ad aderire alle diapositive varia con il tipo di cellula. Per ciascun tipo di cellula, determinare ilottimale tempo di assestamento e di densità cellulare empiricamente. Per risultati coerenti, le celle devono essere in una sospensione di cellule singole. Per facilità d&#39;uso cerchio l&#39;area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo, anche se per le cellule risospese in PBS questo non è strettamente necessario. Una barriera idrofoba impedisce la sospensione di diffondersi sul vetrino, continua fino a tre campioni per vetrino ben separati e consente l&#39;impiego di molto piccoli volumi di soluzione di anticorpi in immuno-FISH. Inoltre, la zona chiazze può essere ridotto al minimo se il numero di cellule sono bassi. </li><li> Topo cellule epatiche fetali <ol><li> Raccogliere ogni E13.5 il mouse fegato fetale a circa 1,5 ml di PBS e risospendere pipettando su e giù. Spin in microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 min. Ripetere lava tre volte. Al lavaggio ultimi, cellule filtrare attraverso un setaccio 70 micron. Risospendere le cellule da un fegato in 160 l di PBS e utilizzare 50 μ per ogni posto. Lasciare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mouse ES Cellule 1. Cellule ES di topo non si attaccano facilmente alla diapositiva. In una diapositiva, cerchio l&#39;area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo. Preparare una sospensione di 20.000-50.000 cellule per 80-100 microlitri nel normale terreno di coltura, pipetta in circolo e partono da allegare per circa 3 ore in un incubatore umidificato. Nota: In alternativa, le cellule staminali possono essere coltivate su vetrini, ma poi formare colonie che potrebbero ostacolare l&#39;imaging automatizzati. </li><li> Cellule fissate 1. Alcuni esperimenti richiedono l&#39;uso di cellule fisse che non si attaccano alle diapositive da soli. Filatura dolci a 300 rpm per 3 minuti usando una citocentrifuga conserva la struttura tridimensionale delle cellule e assicura che le cellule non cadono. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di cella </td><td> Sospensione in </td><td> Tempo di assestamento </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Topofegato fetale </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sulla panchina </td></tr><tr><td> Topo ES </td><td> DMEM con gli integratori </td><td> 4 ore </td><td> 37 ° C in incubatore umidificato </td></tr><tr><td> Linfociti mouse </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sulla panchina </td></tr><tr><td> Topo P20 cellule germinali </td><td> Fissare in soluzione </td><td> Cytospin </td><td> Sulla panchina </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Per fissare le cellule, delicatamente immergere diapositive nel 4% PFA (ATTENZIONE: eseguire in cappa) per 10 min. Fissare le cellule con la slitta piatta in un vassoio per la migliore conservazione di cellule (per esempio 50 ml 4% PFA nel coperchio di una scatola di punta). Nota: Questo passo non si applica alle cellule fisse prima di attaccamento alle diapositive. </li></ol> Per tutte le fasi successive, utilizzare 50 ml o 100 ml vaschette Coplin. Fare attenzione a non raschiare le cellule off quando si spostano le diapositive tra vasi. <ol start="4"><li> Quench in 0.1 M Tris-Cl, pH 7,4 per 10 minuti a RT. </li><li> Permeabilize cellule in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS per 10 minuti a RT. </li><li> Lavare due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Incubare per almeno 20 min a 20% glicerolo / PBS a RT. Nota: A questo punto, i vetrini possono essere memorizzati in 50% glicerolo / PBS a -20 ° C per almeno diverse settimane. E &#39;stato osservato che la memorizzazione per almeno un giorno si traduce in un aumento della forza del segnale 9. Ricalibrare a temperatura ambiente 20% di glicerolo / PBS prima di procedere. Nota: Questo è un punto comodo per iniziare a precipitare le sonde (vedi 2.1.1). </li><li> 3x congelamento / scongelamento in azoto liquido. Immergere una diapositiva alla volta in azoto liquido utilizzando un piccolo dewar. Ritirare dopo pochi secondi e un caratteristico rumore di scoppio, e posto su un tovagliolo di carta per lo sbrinamento. Attendere opaco glicerolo congelato per scomparire poi congelare di nuovo. Fino a 15 diapositive può essere fatto comodamente a rotazione per tre cicli di congelamento / scongelamento. </li><li> Wcenere due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Incubare in HCl 0,1 M per 30 minuti a RT. </li><li> Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilize nel 0,5% saponin/0.5% X-100/PBS Triton per 30 min a RT. </li><li> Lavare due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Equilibrare nel 50% formamide/2x SSC per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sonda Pipetta su un vetrino. Rimuovere diapositiva dal vaso e asciugare il liquido in eccesso intorno al punto cellulare (s) con un tovagliolo di carta. Come si asciuga rapidamente formammide, fare attenzione a non asciugare cellule. Per le diapositive con due o tre punti di cellule, applicare 10 ml di sonda per ogni posto su di un 22 millimetri x 50 mm coprioggetto corrispondente per individuare posizione nella diapositiva. Inverti coprioggetto sul vetrino sopra spot (s). Sigillare con mastice e permettere che questo si asciughi completamente. Proteggere dalla luce in tutte le fasi successive. </li><li> Diapositive di calore a 78 ° C per esattamente 2 minuti su una piastra calda (ad esempio un blocco di riscaldamento rovesciata, PUNTO CRITICO: vedi la discussione). Mettere un coperchio (scatola di cartone o sim<html> Ilar) sopra il piatto caldo al riparo dalla luce durante la denaturazione. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in una camera umidificata a tenuta di luce. Per umidificare, mettere gli asciugamani di carta in una scatola a tenuta di luce e di inumidire con acqua. </li></ol> 2.2 Giorno 2 <ol><li> Preparare vaschette Coplin con soluzioni alla giusta temperatura per le successive fasi di lavaggio. Proteggere i vetrini dalla luce il più possibile durante tutte le fasi successive. Un caffè può fa una buona copertura a tenuta di luce per vaschette Coplin. </li><li> Staccare mastice e luogo vetrino in SSC 2x fino coprioggetto allentare e sfilare. </li><li> Lavare a 50% formamide/2x SSC per 15 min a 45 ° C. Mettere il coperchio sulla bagnomaria per proteggerlo dalla luce. </li><li> Lavare a 0.2x SSC per 15 min a 63 ° C. </li><li> Lavare in SSC 2x per 5 min a 45 ° C. </li><li> Lavare in 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Colorare con DAPI (5 mg / ml in 2x SSC) per 2 minuti in una vaschetta Coplin a RT. </li></ol>contenuto &quot;&gt; Nota: La soluzione DAPI può essere conservato a 4 ° C al buio per 2 mesi. <ol start="9"><li> Destain in PBS per 5 min a RT. </li><li> Per montare il coprioggetti, pipetta mezzo di montaggio su un vetrino. Utilizza 10 microlitri per posto cella, da 22 mm x 22 mm coprioggetto per uno spot, e 22 mm x 50 coprioggetto mm per 2-3 punti. Asciugare PBS intorno al punto cella il più possibile, ma attenzione a non far seccare le cellule. Inverti coprioggetto sul vetrino, e sigillare con smalto. </li></ol>

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La produzione di questo articolo è stato in parte sponsorizzato da Carl Zeiss e MetaSystems.

FISH 3D DNA è diventato uno strumento ampiamente riconosciuto per analizzare disposizioni spaziali nel nucleo. Mentre il pesce fornisce risultati visivi e diretti, come con ogni tecnica, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti. FISH DNA affronta il problema intrinseco che i trattamenti relativamente dure sono necessarie per rendere cromatina accessibile per sonde FISH che alla fine interrompe nucleare struttura-la cosa che deve essere analizzato. Diverse strategie sono state perseguite a destreggiarsi tra accessibilità e la conservazione della struttura. Nel protocollo qui descritto, il DNA cromosomico viene resa accessibile dal congelamento-scongelamento permeabilizzazione delle cellule e denaturazione termica prima di ibridazione della sonda. Solovei, et al., (2002) ha analizzato cambiamenti strutturali dopo trattamento simile ed ha trovato che lo spostamento medio dei domini cromatinici era 300 nm che limita la risoluzione di analisi strutturale a circa 1 Mb regioni nel genoma 8. Mentre questo non è alta risoluzione, essaè un ragionevole per analizzare la posizione nucleare. Una considerazione più pratica per l&#39;analisi FISH è che l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e misure di distanze nucleari sono processi richiede tempo che limitano il numero di nuclei che può essere analizzato. Al fine di studiare eventi rari abbiamo cercato di fare imaging ad alta velocità automatizzato. Poi, con comandi idonei in atto, numero sufficiente possono essere confrontati per permettere l&#39;analisi statistica robusta delle relazioni spaziali. Noi abitualmente Analizziamo 600 nuclei per ogni punto di dati per il quale si determinano le coordinate 3D di tutti i segnali FISH all&#39;interno del volume nucleare. Questi dati richiedono poco spazio di archiviazione e consentono l&#39;analisi di inter-e intra-allelica distanze o posizioni radiali in qualsiasi momento successivo. Inoltre, il trattamento automatizzato può essere fatto in modo cieco ricercatore che riduce notevolmente la probabilità di distorsione inconsapevole. Per abilitare questo tipo di analys ad alto rendimentosi, il nostro obiettivo era quello di stabilire un modo veloce ed efficiente di eseguire FISH DNA. Abbiamo trovato il protocollo qui descritto per essere estremamente robusta, costantemente produrre segnali luminosi a basso fondo. Ha funzionato per tutti i tipi di cellule che abbiamo provato fornito abbiamo adattato la fase di fissare le cellule al vetrino. Inoltre, con una sola eccezione, tutti i BAC abbiamo utilizzato potrebbero essere trasformate in sonde luminose. Abbiamo anche rilevato con successo un certo numero di proteine ​​nucleari mediante colorazione anticorpale dopo FISH DNA. Mentre per alcune proteine ​​questo funziona bene, si consiglia di confronto con immunofluorescenza tradizionale (IF) per garantire la coerenza del pattern di colorazione anticorpale tra IF e DNA immuno FISH (cfr. 11). Generalmente, abbiamo trovato che sonde marcate in diversi colori producevano gli stessi risultati. Tuttavia, i seguenti aspetti devono essere considerati quando si sceglie il colorante etichettatura. Prima, il colore del fluoroforo deve essere ben rilevabile con il microscopio uSED. In secondo luogo, la lunghezza d&#39;onda della luce emessa dai fluorofori dovrebbe essere sufficientemente diverso per evitare sanguinare attraverso nell&#39;altro canale. Questo dipenderà filtri nel microscopio. E terzo, almeno nelle nostre mani, alcuni colori producono segnali luminosi più coerente di altri. Abbiamo sempre usato DAPI (blu) come di contrasto che rende Alexa Fluor 555 (rosso), 488 (verde), e 647 (rosso lontano) buone scelte per l&#39;etichettatura di sonde. Con il nostro sistema di imaging, abbiamo trovato Alexa Fluor 555 (rosso) per produrre i segnali luminosi, seguiti da Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (rosso lontano) ha lo svantaggio che non può essere rilevata dall&#39;occhio umano e quindi non segnali può essere visto quando guardando il microscopio. Così, se facendo FISH a due colori, si consiglia la combinazione di coloranti rossi e verdi. Possono sorgere due problemi principali: le cellule lavare via le diapositive e segnali deboli. Come le cellule e aderire alla diapositiva è betw estremamente variabiletipi di cellule een, e il miglior protocollo per risolvere / seme le cellule devono essere determinati. Abbiamo utilizzato con successo sia con carica positiva o vetrini rivestiti di poli-L-lisina (acquistati pronti per l&#39;uso), ma abbiamo trovato le cellule generalmente rispettati meglio vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Abbiamo anche scoperto che quando le cellule erano intere zone troppo dense avrebbe tolto come un foglio, mentre l&#39;imaging automatizzato è stato ostacolato se le cellule erano troppo scarsi. Così, se il campione non è troppo preziosa, numeri cellulari differenti dovrebbero essere seminate per determinare la densità ideale. Se le cellule sono particolarmente inclini a lavare, una penna barriera idrofobica può essere utilizzato, e passi FISH può essere eseguita con una pipetta con attenzione le soluzioni direttamente sul vetrino. Pipettaggio inoltre riduce drasticamente i volumi dei reagenti necessari, ma richiede molto più tempo quando si fa più diapositive. I segnali deboli sono di solito a causa di sonde poveri, e vale la pena di investire tempo nel fare buoni. Clean BAC DNA deve essere un usod come materiale che può essere ottenuto mediante ripetute precipitazione o kit disponibili in commercio partenza. Contaminazione con DNA genomico batterico influisce negativamente sulla qualità sonda e accurato trattamento durante la lisi cellulare e filtraggio del lisato cellulare è necessaria per mantenerlo al minimo. E &#39;, tuttavia, non è necessario utilizzare un passo esonucleasi per digerire il DNA lineare, in quanto ciò riduce notevolmente rendimento. Etichettatura efficiente della sonda è di fondamentale importanza. Il controllo di qualità più importante per questo passaggio sta controllando la dimensione del frammento dopo la traduzione nick (vedi Rappresentante dei risultati). Un &#39;buon&#39; striscio quasi sempre si tradurrebbe in un brillantemente sonda colorata. Tuttavia, abbiamo trovato che occasionalmente un certo BAC non può essere trasformato in una buona sonda, e una diversa BAC deve essere scelto. Un altro passo importante è la denaturazione al calore. Se la temperatura è troppo bassa, il DNA sarà solo parzialmente denaturate e ibridazione sonda sarà compromessa. Se la temperatura è troppo elevata, la struttura nucleare will essere turbato più del necessario. Nelle nostre mani, 78 ° C su blocco calda invertito è il compromesso ideale, ma questo può variare a seconda del rispettivo blocco calda utilizzata. Abbiamo avuto buoni risultati utilizzando montaggio Vectashield medie, ma ha scoperto che SlowFade Oro ha meno di fondo e mantiene il segnale fluorescente a lungo. Si sconsiglia l&#39;utilizzo di hard-set di mezzo di montaggio, come abbiamo trovato che questo influisce struttura 3D e di formare bolle d&#39;aria nel corso del tempo. In conclusione, brillantemente fluorescenti sonde marcate direttamente insieme al protocollo FISH DNA qui descritti offrono una soluzione efficiente per l&#39;analisi robusta e rapida dell&#39;architettura nucleare che è applicabile ad un&#39;ampia varietà di questioni biologiche.

DNA ibridazione in situ fluorescente (FISH DNA) permette la visualizzazione tridimensionale dei singoli loci genici, domini subchromosomal e anche interi cromosomi durante tutte le fasi del ciclo cellulare. FISH 2D viene utilizzato per studi metafase mentre FISH 3D è stato ampiamente utilizzato per sondare il rapporto tra l&#39;organizzazione spaziale del genoma e la sua funzione durante l&#39;interfase (1,2 e riferimenti ivi citati). Storicamente, gli studi di co-associazione sono stati eseguiti da indagando decine a centinaia di singoli loci dai pesci. Tecniche più recentemente potente high throughput 3C-based come 4C e Hi-C sono stati sviluppati 3, permettendo l&#39;indagine molecolare, cross-talk tra molte migliaia di differenti loci. Mentre le tecniche di 3C-based e FISH DNA possono essere metodi complementari, non necessariamente rispondere alle stesse domande. Metodi basati 3C forniscono una lettura insieme di popolazioni cellulari miste, con un conseguente probalità per la co-associazioni. Al contrario, mentre in basso rendimento, le tecniche base di pesce offrono la possibilità di analizzare le disposizioni spaziali di loci o cromosomi nelle cellule individuali in base alle loro diverse fasi del ciclo di sviluppo o cellulare. Quindi, FISH continuerà ad essere un importante strumento per sondare i rapporti struttura-funzione nucleari. Ci sono due considerazioni importanti nello svolgimento di successo esperimenti di FISH 3D. Questi sono: 1. ottenendo sonde marcate in modo ottimale e 2. scelta di trattamenti cellulari, compresa la fissazione, pre e procedura post-ibridazione, per preservare morfologia nucleare il più possibile rendendo DNA sufficientemente accessibile per l&#39;ibridazione della sonda. Etichettatura sonda efficiente è di fondamentale importanza per i pesci. Tradizionalmente, nick-translation è stato usato per introdurre o aptene o nucleotidi fluoroforo-coniugati 4. Allo stesso modo, i kit commerciali nick-traduzione sono disponibili per aptene diretta o fluoroforo incorporazione, but anche per l&#39;etichettatura in due fasi utilizzando nucleotidi aminoallyl e coloranti ammina-reattiva. Quest&#39;ultimo rende incorporazione colorante più efficace dando polimerasi DNA una molecola meno ingombrante con cui lavorare. Più recentemente, kit per l&#39;etichettatura non enzimatica di DNA sono stati sviluppati che sfruttano legame coordinativo di platino per acidi nucleici. Sonde FISH possono anche essere acquistati già etichettato 5. Mentre i kit e le sonde prodotte commercialmente senza dubbio dare la facilità d&#39;uso, sono notevolmente più costosi rispetto all&#39;acquisto dei singoli componenti e la produzione di sonde in-house. Abbiamo ottimizzato un protocollo di traduzione nick a basso costo al fine di etichettare direttamente molte diverse sonde BAC in più colori. Abbiamo scoperto che l&#39;ottenimento di DNA altamente puro BAC è critica e risultati in un requisito per solo il 10-20 ng di sonda per vetrino FISH, rispetto a 10-20 volte più quando viene utilizzato impuro DNA stampo, con conseguente maggiore costo e tempo- risparmio. L&#39;uso di ammino-allyldUTP permette di etichettatura flessibilesonde con coloranti ammina-reattivi disponibili (ad esempio, Alexa Fluor o Cy-coloranti) o apteni (es. biotina, digossigenina). Aptene-sonde marcate vengono rilevati da anticorpi coniugati fluoroforo o streptavidina per amplificare e visualizzare il segnale. Luminoso sonde marcate direttamente mostrano generalmente meno la colorazione di fondo e di evitare sovra-amplificazione dei segnali, e quindi una conseguente rappresentazione più accurata della localizzazione nucleare e locus morfologia. Ci sono diverse tecniche di pesci diversi che utilizzano diversi fissativi, pre-trattamenti e lavaggi post-ibridazione, ma questi generalmente rientrano nelle seguenti categorie: fissazione glutaraldeide con NaOH denaturazione, la fissazione di formaldeide con HCl denaturazione, e la fissazione di formaldeide con denaturazione al calore 6-9 . Ognuno di questi ha vantaggi e svantaggi. Glutaraldeide risultati fissaggio in buona conservazione strutturale nucleare, ma richiede un trattamento con agenti riducenti per ridurre al minimol&#39;autofluorescenza risultante, e il trattamento NaOH deve essere attentamente controllato per bilanciare sufficiente denaturazione del DNA e potenziali danni alla struttura nucleare 6. Fissazione formaldeide è meno forte, dando una maggiore probabilità di perturbazioni di architettura nucleare, ma anche in genere dando segnali più forti e più affidabile e più bassi autofluorescenza 9. HCl trattamento depurinates DNA e ne estrae le proteine, che fornisce un facile accesso al DNA per le sonde, ma può anche introdurre rotture del DNA. Riscaldamento separa fisicamente i due filamenti di DNA con conseguente buona ibridazione target e segnali forti, ma può causare qualche perturbazione della struttura nucleare 8. Il grado in cui ciascuna di queste tecniche affetti epitopi proteici varia ampiamente 6,9, con la conseguente esigenza di determinare sperimentalmente per ogni proteina il protocollo ottimale da utilizzare in esperimenti di immuno-FISH. Mentre non vi è alcun &#39;perfetto&#39; DNA FISH technique, tutti possono essere utili se ben controllata. Nostro obiettivo era ottimizzare un protocollo per robusto e riproducibile FISH DNA per indagare posizionamento spaziale dei loci multipli in una varietà di tipi cellulari 10, concentrandosi sul metodo di riscaldamento per la maggior parte dei segnali affidabili. Con questo e l&#39;uso di un sistema di imaging automatizzato abbiamo puntato ad aumentare il throughput per l&#39;analisi di singole cellule di accordi nucleari.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

FISH 3D DNA è diventato uno strumento importante per analizzare l&#39;organizzazione tridimensionale del nucleo, e diverse variazioni della tecnica sono stati pubblicati. In questo articolo descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per la robustezza, la riproducibilità e la facilità d&#39;uso. Vivaci fluorescenti sonde marcate direttamente sono generati da nick-translation con amino-allyldUTP seguita da accoppiamento chimica del colorante. FISH 3D DNA viene eseguita utilizzando una fase di congelamento-scongelamento per permeabilizzazione cellulare e una fase di riscaldamento per denaturazione simultanea di sonda e DNA nucleare. Il protocollo è applicabile ad una gamma di tipi di cellule e una varietà di sonde (BAC, plasmidi, fosmidi, o vernici Chromosome interi) e permette l&#39;imaging automatizzato ad alta produttività. Con questo metodo abbiamo quotidianamente indaghiamo localizzazione nucleare di un massimo di tre regioni cromosomiche.

Il protocollo qui descritto (Figura 1 per una panoramica), è stato utilizzato con grande effetto per combinare FISH DNA con l&#39;acquisizione di immagini ad alta velocità per l&#39;analisi di organizzazione genomica. La generazione di sonde di buona qualità è fondamentale per il successo (vedi discussione). Figura 2 mostra due importanti controlli di qualità per le sonde FISH. Dopo nick-translation, uno striscio di DNA dovrebbe essere visibile con la maggior parte dei frammenti in esecuzione tra i 150 e 700 bp (Figura 2A). Dopo accoppiamento chimico, incorporazione del colorante fluorescente può essere misurato mediante analisi spettroscopica della sonda (Figura 2B). Quando si utilizza buone sonde, seguendo il protocollo FISH DNA di solito si traduce in segnali FISH DNA luminose a basso fondo. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo su una varietà di diversi tipi di cellule, e sia con microscopi a fluorescenza o confocale. L&#39;imaging automatico utilizzando un epi-fluorescence microscopio richiede taglienti, segnali FISH facilmente identificabile con sfondo poco (Figura 3), mentre la microscopia confocale richiede segnali più intensi. Figura 4A mostra immagini elaborate rappresentative. Coordinate nucleari di segnali FISH possono essere ottenuti, e le relazioni spaziali di regioni genomiche possono essere calcolati (per un esempio vedere la Figura 4B). Abbiamo anche utilizzato stack di immagini ottenute al microscopio confocale per la modellazione 3D di segnali FISH nei loro territori cromosomici (Movie 1). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro per l&#39;etichettatura e la sonda FISH DNA. Preparazione della sonda è in blu. Procedimento FISH DNA appare in bianco con dettagli forniti nel verde. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Figura 2. Etichettatura sonde da nick-traduzione e il controllo di qualità delle sonde marcate. A) Gel mostrando striscio ideale prima di riscaldamento per inattivare DNasi I (corsia 1: scala del DNA, corsia 2 e 3: BAC dopo nick-translation). Frammenti dovrebbero essere nel range 150-700 bp. Un ulteriore striscio a ~ 1 kb è frequentemente osservata con successo reazioni nick-traduzione. B) Microvolume analisi spettro completo di sonde marcate. Un picco di DNA a 260 nm si osserva con un secondo picco corrispondente alla lunghezza d&#39;onda di assorbimento del fluoroforo della sonda è marcato con: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Visualizzati sono tre sonde con buona incorporazione: picchi di assorbimento fluorofori sono una altezza simile o superiore a quella dei picchi di DNA. Alexa Fluor 647 ha in genere maggiore assorbanzadi Alexa Fluor 555, che a sua volta ha assorbanza superiore Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 assorbe anche qualche luce a 260 nm, quindi il primo picco di tale sonda è superiore alle altre. Sonde con scarsa incorporazione spettacolo fluoroforo assorbanza 2-3 volte inferiore rispetto alla assorbanza DNA. Sonde con più di 2 volte superiore picco fluoroforo di DNA di picco in genere contengono colorante non coniugata che possono causare sfondo nel pesce. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Figura 3. Screenshot del software di imaging 3D FISH MetaCyte che mostra un tipico esperimento di FISH a tre colori. Lo schermo è diviso in più parti. A) campo di vista (FOV) immagini Raw catturata dal Metafer / sistema di scansione MetaCyte diapositiva. B) Galleria di immagini di nuclei identificati che hanno Onuelaborazione di immagini dergone e segmentazione per segnali FISH. Vari tipi di dati possono essere visualizzati su ogni immagine galleria. In questo esempio, il numero di cellulare viene visualizzato in alto a sinistra con varie interallelic e interlocus distanze alto a destra e su entrambi i lati sotto ogni immagine. C) nome della diapositiva con il numero di nuclei individuati nell&#39;analisi. D) Rappresentazione della slitta con l&#39;area acquisita dal sistema. E) Allargamento della zona sottoposta a scansione. Macchie bianche rappresentano nuclei individuati per FOV. F) I dati elaborati. In questo esempio vengono mostrati massime distanze interallelic tra i segnali verdi (in alto) e segnali rossi (in basso). I dati indicati sono da topo P20 cellule germinali. Le sonde si trovano su cromosomi diversi, che coprono Hbb e geni HBA e un cluster istoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Entro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di immagini elaborate e dati posizionali derivati. A Immagini) trattati per E13.5 topo cellule epatiche fetali marcate con sonde BAC situati su cromosomi diversi che coprono Myc e KCNQ1 geni (chiamati myc e KvDMR, di colore verde e rosso, rispettivamente). B) Tukey box-whisker che rappresentano la distanza interallelic distribuzione per gli stessi loci in 600 nuclei. Distanza Interallelic è tracciata come una frazione del raggio del nucleo &#39;(distanza / raggio) per tenere conto di variazioni di dimensione nucleare. Nuclei delle cellule ES hanno un raggio di circa 5 micron. Raggi rossi sono significativamente inferiore a quello di sonde verdi (***: p &lt;0.01, spaiati t-test). Dati da 10. Movie 1. Modellazione 3D di due loci nel loro cromosoma territory. Due sonde BAC situati vicino alle estremità di topo cromosoma 7 sono stati etichettati (rosso e rosso lontano, (bianco pseudo-colorato)) e ibridati con una vernice cromosoma intero (verde) di topo cellule ES. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere film</a> .

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Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l&#39;analisi dell&#39;architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

34.4K Views.  The Babraham Institute. Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Video: Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

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Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

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Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Valutare Contributi specie-specifiche per lo sviluppo craniofacciale Uso Chimere Quaglia-anatra

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...