טיפול מותאם אישית לחולי סיסטיק פיברוזיס יכול להיות מושג על ידי מודל מחלה חוץ גופית כדי להבין את פעילות ה- CFTR בנקודת ההתחלה. אורגנואידים של אפיתל האף האנושי, או אורגנואידים של HNE, מייצרים לומן בגדלים שונים התואמים את פעילות ה-CFTR, ומבחינים בין אורגנואידים של CF לבין אורגנואידים שאינם CF. כאן, תיארנו מתודולוגיה לגידול והדמיה של אורגנואידים אלה של HNE בפירוט.
הובלת יוני אפיתל לא מתפקדת, במיוחד זו של כלוריד וביקרבונט, גורמת לירידה בנפח נוזלי הרירית של האפיתל. זה משפיע גם על הפרשות הריר המובילות לרירית וחסימה. לכן, מודל HNE שלנו פותח עבור יישומים שונים, בהתאם לתכנון הניסויי והמשאבים של החוקר.
מלבד הערכת פעילות CFTR בנקודת ההתחלה או בתגובה לטיפולים, ניתן ליישם טכניקה זו גם על מחלות אחרות המערבות תפקוד תאי אפיתל, במיוחד הובלת נוזל תאי אפיתל. שיטות אלה פותחו בעיקר לשימוש במחקרי סיסטיק פיברוזיס. מחקרים אחרים המעריכים את אפיתליה של דרכי הנשימה, כגון דיסקינזיה סילארית ראשונית, עשויים גם הם למצוא שיטות אלה מועילות.
טכניקות אלה דורשות תשומת לב לפרטים ולדיוק. הם גם דורשים תצפית זהירה כדי להבטיח שההתפשטות הראשונית של התאים מתאימה. עקוב אחר כל התרבויות מדי יום, וההצלחה תהיה סבירה יותר.
כדי להתחיל, נתקו את הביופסיה של מברשת האף לתוך 8 מיליטרים של מדיית RPMI בצינור חרוטי של 15 מיליליטר על ידי העברת מברשת הציטולוגיה מספר פעמים דרך קצה פיפטה אחד של מיליליטר גדול. צנטריפוגה של התאים ב-500 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את ה-supernatant ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא בשלושה מיליליטרים של תמיסת ניתוק התא.
דגירה בטמפרטורת החדר למשך 16 דקות לעיכול. השתמש בחמישה מיליליטרים של מדיית ההרחבה כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו אותם לבקבוק T75, שנזרע מראש עם פיברובלסטים מוקרנים, מומתים, ו-50% עד 60% מתמזגים עם פיברובלסטים של 3T3.
אפשרו לתאים תרבית משותפת והתרחבו במדיית ההרחבה למשך 7 עד 14 יום. אם הוכנסה אנטיביוטיקה לתאים שמקורם בחולי סיסטיק פיברוזיס, יש להחליף את המדיה במדיית הרחבה ללא אנטיביוטיקה לאחר שלושת הימים הראשונים של התרבית, והיא יכולה להמשיך לשנות את המדיה כל יומיים עד 80% מפגש. לשטוף את התאים עם 1x DPBS.
לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק T75 ודגרו במשך ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפיברובלסט 3T3 המוקרן והמומת מהתרבית. שטפו את בקבוקון T75 עם 1x DPBS פעמיים כדי לשטוף ביסודיות את כל הפיברובלסטים הנותרים של 3T3. הוסיפו 1.5 מיליליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק T75 ודגרו במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את ה-HNEs.
נטרלו את הטריפסין באמצעות מעכב טריפסין סויה ביחס של אחד לאחד. צנטריפוגה של התאים ב-500 פעמים gi במשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את ה-supernatant ושטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של מדיית התפשטות פעם אחת.
התאים מוכנים כעת לזריעה כדי לגדל אורגנואידים. להפשיר את התרבית האורגנואידית מטריצה חוץ-תאית או ECM בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. מצננים את מגלשות האנגיוגנזה בנות 15 הבארות למשך הלילה באותה טמפרטורה.
לאחר מכן, מצננים את קצות הפיפטה לארבע מעלות צלזיוס. מצפים את המגלשות בחמישה מיקרוליטרים של 100% ECM קר על קרח. הכניסו אותם לחממה של תרביות תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לצורך איחוד.
ספרו את ה-HNEs שנקטפו מתרבות משותפת באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, דיללו את התאים ל-500 תאים לכל מיקרוליטרים במספר הכולל, כאשר 20% ECM מדולל על ידי אמצעי התמיינות על קרח. הוציאו את המגלשות מצופות ה-ECM מהאינקובטור וזרעו חמישה מיקרוליטרים של תערובת ECM של התא הקר לכל אחת מהבארות.
מעבירים את השקופיות מיד לחממת תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאחד את תערובת ה-ECM של התא. לאחר מכן, הוציאו את השקופיות מהאינקובטור והזינו את התאים בכל באר של שקופיות האנגיוגנזה בנות 15 הבארות עם 50 מיקרוליטרים של מדיית ההתמיינות. החזירו את השקופית לחממת התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ושינו את המדיה כל יומיים עד שהאורגנואידים יהיו מוכנים לניסויים נוספים.
טפלו מראש בשקופיות החדר התחתון מזכוכית עם 8 בארות עם דבק התא למשך 30 דקות. השליכו את התמיסה וייבשו את הבארות באוויר למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, השליכו את המדיה מהחלק העליון של ה-ECM ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של ה-1x PBS הקרים לכל באר של 15 המגלשות על הקרח.
פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים באמצעות 200 מיקרוליטרים של קצה הפיפטה הגדול. מחלקים את התמיסה למרכז באר של שקופיות 8 הבארות. הסר את הנוזל העודף מיד מהבארות על ידי פיפטה עדינה.
לאחר מכן, הניחו את החלקת החדר לתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לשפר את האורגנואיד הדבק בקרקעית הזכוכית. לאחר 40 דקות, לשטוף בעדינות את האורגנואידים עם 1x PBS פעמיים ולתקן אותם עם 300 microliters של 4% paraformaldehyde בכל באר במשך 30 דקות להגדיר את טמפרטורת החדר. יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS ולאחסן את האורגנואידים ב-1x PBS שנקבעו בארבע מעלות צלזיוס לצורך שמירה חיסונית למשך עד שבועיים.
כדי לקצור את האורגנואידים למחקרים היסטולוגיים, הסירו את המדיה מהתרבית והוסיפו 50 מיקרוליטרים של PBS קר אחד 1x לכל באר של המגלשות על הקרח. פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרוליטר בעל נשא גדול. שלבו את כל הפתרונות ממגלשת 15 הקידוחים או מתוספות התרבית לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר על קרח.
התאם את נפח הפתרון הכולל בצינור ל- 10 מיליליטר על-ידי הוספת PBS קר של 1x. צנטריפוגה של הצינור בארבע מעלות צלזיוס, 300 פעמים גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו החוצה את הסופרנטנט והוסיפו 60 מיקרוליטרים של היסטוגל חם כדי לערבב עם הכדור האורגנואידי באמצעות קצה פיפטה בעל 200 מיקרוליטר גדול.
מעבירים את ההשעיה מיד לתבנית היסטולוגית. לאחר איחוד ההיסטוגל בטמפרטורת החדר, הכניסו את גוש העובש ל-4% פרפורמלדהיד לקיבוע למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. פתח את התוכנה ולחץ לחיצה ימנית בתחתית המסך.
לאחר מכן, בחר פקדי ניתוח, ולאחר מכן תוצאות מדידה אוטומטיות. פתח את התמונה האורגנואידית ובחר 5 עד 10 אורגנואידים עם לומן גלוי. לחץ לחיצה ימנית על התמונה כדי לפתוח את התפריט ובחר ROI מצולע כדי לתאר את האורגנואיד המלא כדי לקבל את שטח הפנים הכולל של האורגנואיד.
לאחר מכן, תאר את הלומן כדי לקבל את אזור לומן. חזור על כך עבור האורגנואידים הנותרים בבאר, וכל הבארות שבבדיקה. לבסוף, ייצא את הנתונים ל- Excel.
חלקו את שטח הלומן בשטח הפנים הכולל ורשמו ממוצע של כל האורגנואידים מהדגימה כדי לקבל את יחס לומן הבסיסי. תמונות השדה הבהיר מייצגות HNEs מאוסף דגימות מוצלח ולא מוצלח. ה-HNEs גדלים היטב באשכול גדול.
לעומת זאת, ה-HNEs גדלים בצורה גרועה בשני אשכולות קטנים המקיפים את תאי 3T3 המוקרנים. אורגנואידים בשקופית 15 הבאר יש תמונות מדויקות וחדות יותר מאלו שבתוספת התרבות. מלבד זאת, לא נצפה הבדל מורפולוגי משמעותי בשתי שיטות התרבות הללו.
לאורגנואידים שאינם CF יש בדרך כלל לומן גדול יותר ונוזל יותר מאשר אורגנואידים של CF. צביעת HNE באורגנואידים מנבדק שאינו CF, F508del/F508del, והכתם אימונופלואורסצנטי של ריסונים באורגנואיד מוצגים בתמונות אלה. הריסונים המוכתמים באצטילציה-טובולין, FITC המסומן בנוגדן משני, והגרעינים המסומנים ב-DAPI מוצגים כאן.
תמונות הקרנה מקסימליות של שני האורגנואידים המייצגים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה ותמונות השחזור התלת-ממדיות המתאימות להם מוצגות כאן. ליחה וריסונים בתוך לומן האורגנואידים מוצגים. התמונות הגרפיות מייצגות את בדיקת הנפיחות המושרה על ידי פורסקולין לבדיקת תפקוד CFTR על תאי אפיתל האף העיקריים.
ניסוי פורסקולין מייצג של מינון-תגובה של מתנדבים שאינם CF מוצג כאן. התגובה למינון FSK מושווית עם שינוי שברירי ממוצע בשעה אחת, לעומת שמונה שעות, מה שמצביע על כך שהבדיקה של שמונה שעות יכולה לייצר הפרש נפיחות משמעותי יותר בין מינוני FSK שונים מאשר אלה שבשעה אחת. האזור שמתחת לעקומה יכול להראות הבדל קל בנפיחות לעומת שינוי שברים ממוצע בשמונה שעות.
בעת ניסיון הליך זה, יש לזכור כי אורגנואידים יאבדו במהלך תהליך האיסוף, הקיבעון והכתם. לכן, יש להקפיד על זהירות בכל שלב ולהשיג מספרים התחלתיים מספיקים כדי להבטיח הצלחה. גידול אורגנואידים בתוספות תרבית יכול לעזור בהקשר זה, שכן טכניקות אלה מפותחות.
כאן, השתמשנו בריאגנטים ובאספקה הזמינים מסחרית כדי להקל על ההתרחבות לחוקרים אחרים. כמו כן פותחה בדיקה פונקציונלית שהשתמשה בטכניקות מיקרוסקופ נפוצות ובציוד מיוחד יותר.
