作者は感謝した画像は、 図3とPICT-IBISAイメージング機能（研究所キュリー）で取得して処理するために博士ワシーリーGurchenkov（キュリー研究所）を認める。 in vitroで細胞のモデルでコンプレックス-この仕事はANR-09-JCJC0023-01、ARC SFI20111203863とPIC 3Dによってサポートされていました。

1。 TAMRA-コラーゲンIラベル<ol><li>供給25mgのTAMRA粉末に2.5ミリリットルのDMSOを加えることにより10 mg / mlのTAMRA溶液を調製。完全に溶解するまでボルテックスすることにより、それを溶かす。 -20ºCで保存し、光から保護します。 </li><li>標識バッファー（0.25 M NaHCO 3を 、0.4 M NaCl）を2Lのを準備します。 10 MのNaOH溶液を用いてpHを9.5に調整する。 4℃に保つ特に明記しない蛍光体は、アルミニウム箔を用いて光から保護されていない限り、この時点から、すべての操作は4℃で実施される。 </li><li>高度に濃縮されたラット尾コラーゲンI溶液1mlで1ミリリットル使い捨て注射器を埋める。高濃度のコラーゲン溶液は、典型的には10 mg / mlの濃度の周りに設けられており、非常に粘稠であるて​​いる。気泡の形成を避けるためにゆっくりとそれを操作してください。 </li><li> 21 Gの皮下注射針を使用し、MWCOカットオフ10,000予浸3ミリリットル透析カセットにコラーゲンを注入する。玉を避けるために注意してください針で膜パトン。シリンジピストンを引き上げて透析カセットからすべての空気を除去する。ラベルバッファの1リットルに対して一晩、それを透析。 </li><li>ラベルバッファの900μlの10 mg / mlのTAMRA溶液100μlを混ぜる。注：DMSOは4℃で凍るので、これは、室温でTAMRAソリューションとラベルバッファの両方で行う必要があります混合した後、4℃に希釈TAMRAソリューションを持ち帰る</li><li>慎重に21 Gの皮下注射針で2ミリリットル使い捨て注射器を使用して透析カセットからコラーゲンを削除します。ピペッティングにより希釈TAMRA溶液1mlで透析コラーゲン溶液1mlを混ぜる。 </li><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブにコラーゲン/ TAMRAミックスを移し、回転で一晩インキュベートする。 </li><li>予浸3ミリリットル透析カセットにTAMRA標識コラーゲン2 mlを移し、自由色素の過剰を削除するには、バッファのラベリングの1 Lに対して一晩透析。 </li><li> TAMRA-ラボを復元するには元のコラーゲン溶液にELEDコラーゲンは、0.2％のL 1（v / v）の酢酸溶液、pHが4の中に透析カセットを配置し、一晩透析する。 </li><li> TAMRA標識コラーゲンの最終容積を測定し、使用されるコラーゲン溶液の初期体積と濃度を考慮して、最終的な濃度を計算。 4℃で保存</li></ol> 2。組込シングルセルで3D TAMRA-コラーゲンマトリックス<ol><li>実験のために必要な2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックスの体積を計算する。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。 </li><li> 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。 </li><li>希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切な容量で10倍PBSと1NのNaOHを混ぜる。例えば、1 mlの最終容積のためにpH7.4でTAMRAコラーゲンミックスの、1N NaOHを5μlの10倍のPBSを100μlを兼ね備えています。よく混ぜる。 </li><li> TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンと未標識コラーゲンの4.01 mg / mlのの415.71μlに90.48μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 </li><li> 10 5細胞/ mlおよび2 mg / mlのコラーゲンの最終濃度の最終細胞密度を得るために、TAMRA-コラーゲンの組合せにすることなく冷却されたFBS細胞培地の適切なボリュームに懸濁した細胞を加える。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlのために、10 5個の細胞を含むメディアの388.81μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験の上でミックスを10μLをテストすることによって、pHを確認旅。 </li><li>ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは30-45分間室温で重合することができます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。 </li><li>慎重にコラーゲン/セル滴をカバーするために十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。細胞がマトリックスに移行するための十分な時間（通常1-3日）を10％CO 2の加湿空気中で37℃で保管してください。 </li></ol> 3。組み込み細胞スフェロイドの3D TAMRA-コラーゲンマトリックス<ol><li> 2 mg / mlのTAMRAコラーゲンMの体積を計算実験のために必要なIX。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。 </li><li> 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。 </li><li>希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切なボリュームにFBSことなく10倍PBS、1 N NaOHおよび細胞培地を混ぜる。例えば、pH7.4でTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、10倍のPBS100μlを、1NのNaOH5μlのメディアの388.81μLを兼ね備えています。よく混ぜる。 </li><li> TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンの90.48μlのとunlaの4.01 mg / mlのの415.71μLを追加beledコラーゲン。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験ストリップ上のミックス10μLをテストすることによって、pHを確認してください。 </li><li>ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは2-5分間重合を開始することができます。これは、若干のゲル粘度を増加させることによりスフェロイドの沈み込みを防止するのに役立ちます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。 </li><li>細胞スフェロイドを収集し、クリーンなペトリ皿の上に置きます。液体の余分を削除し、TAMRAコラーゲンミックス10μlにそれを再懸濁します。これは、セルメディアとコラーゲンの希釈を防止することが重要である。 </li><li> P20ピペットを用いて、コラーゲンは回転楕円体濁し、100μlのTAMRAコラーゲンミックスドロップの中央上部に置きます集める。注：彼らが侵入し、及び/又は移行する各他の容量に影響を与えることができるので、コラーゲンの低下ごとに複数の回転楕円体を置かないでください。 </li><li>ポリにTAMRAコラーゲンミックスを許可する30-45分間室温でmerize。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。 </li><li>慎重にコラーゲン/スフェロイド滴をカバーするのに十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。 </li><li>細胞がマトリックスに侵入する/移行するための十分な時間（通常1-3日）のために、10％のCO 2加湿空気中で37℃で保管してください。 </li></ol> 4。 3D免疫蛍光染色<ol><li>慎重に細胞培地を除去し、PBSで細胞/スフェロイドを含むコラーゲンマトリックスをすすいでください。 </li><li>同時に抽出/固定液（4％PFA、0.3％トリトンX-100、PBの5％ショ糖でインキュベートすることによって固定し、細胞を抽出5分間S）。 2μMのファロイジンと細胞骨格や細胞骨格関連タンパク質の可視化のためのタキソール2μMでバッファを補う。 </li><li>さらに、4％PFAで30分間、PBS中の5％スクロースで細胞を固定します。 0.05％PBS中のTween-20で洗い流してください。 </li><li> PBS中で一次抗体溶液を調製。室温または一晩4℃で少なくとも1時間一次抗体で細胞をインキュベート全体のコラーゲンの低下をカバーするのに十分な解決策を追加してください。 35ミリガラスボトムディッシュのために、溶液1.5〜2溶液に必要であろう。注：抗体溶液の量を減らすために、例えばシリコーングリース又はPDMSリングの円周線と水不溶性障壁は、コラーゲン滴の周りに配置することができる。 </li><li> 0.05％PBS中のTween-20で3回、30分間洗浄します。 </li><li>アレクサ標識二次抗体を、PBS中アレクサ共役ファロイジン及びDAPI溶液を調製する。室温で2時間、適切な二次抗体で細胞をインキュベートする。 </li><li> 3X 3を洗うのTween-20、PBS中の0.05％と0分。 </li><li>液体の過剰を取り除き、ガラスボトムディッシュ底（約500μL）を記入し、密封するために上部に24ミリメートルのカバースリップを置くために十分なマウントメディアを追加。コラーゲンの低下を圧縮し、3Dの組織の損傷を防ぐために、カバースリップを下に押さないでください。 </li></ol> 5。サンプルイメージングクラシックまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用することができます。反転されたシステムは、優先的にガラス下から撮像された細胞の距離を決定するために使用されるべきである。この作業のために使用されるシステムは40X/1.3NAと60X/1.4NA油浸対物レンズ（それぞれ距離は200μmと130μmのを、作業）、Photometrics CoolSNAP HQ2カメラ、1392 X 1040を搭載した倒立共焦点スピニングディスクですイメージング·アレイ、6.45 X 6.45μmのピクセルと変形者イメージングソフトウェアによって制御されます。 405nmで、491 nmで、561 nmであり、かつ633nmのレーザは、典型的には30〜50％のパワーで使用される、利得1および2のビニング露光時間を短縮すること×2。 、FITC（EXC 478から495;全角510から555）と、テキサスレッド（EXC 560から580;全角600;顕微鏡もDAPI（全角450から465 EXC 400から418 nm）のための水銀ランプとフィルターキューブが装備されている-650）アイピースで使用する。 <ol><li>蛍光灯を使用した、コラーゲンの低下の中央に40X客観的に配置します。のx-y軸およびz軸の両方において、試料の概要を取得する。エッジ効果を避けるために、画像を取得する際のxy軸のゲル端から100μm以上を逸脱しないことを確認してください。ときイメージングスフェロイド、彼らが客観作動距離の下にあることを確認してください。必要に応じて目標を変更してください。 </li><li>共焦点ライブイメージングモードに切り替えます。 TAMRA標識したコラーゲンを可視化するために561 nmのレーザーを使用することにより、ガラスの底部から出発すると、コラーゲン繊維が現れ始めるれるzの値を決定する。これにより、基板底面およびz = 0である。 </li><li>フォーカスノブを使用して、Z = 0から100程度まで行く。 Z = 100ミクロンでセルのみ以上硬質ガラス底から張力の影響を回避するために結像されるべきである。 </li><li>イメージにセルを選択します。波長毎にカメラの露出時間とレーザパワーを最適化する。 DAPIおよびアレクサ488ファロイジンの典型的な露光時間は100〜200ミリ秒の間である。抗体染色のための露光時間は変わる場合があります。 </li><li>フォーカスノブを使用して染色し、ファロイジンを可視化するための適切なレーザを用いた共焦点ライブモードでは、電流を上部と下部のzの値を設定することにより、zの系列間隔を定義する。 </li><li> zのステップサイズを定義します。 40Xの目的のために、1ミクロンを使用しています。 60Xの場合、0.5μmのを使用しています。取得を開始します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私はTAMRAを使用蛍光ラベルコラーゲンにここで説明するプロトコルは、561 nmのレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を使用することにより、コラーゲンネットワーク組織を簡単に可視化を可能にする優れた方法を提供します。反射率共焦点顕微鏡と比較して、この技術の利点は、三次元マトリックスに深く画像コラーゲン繊維の能力である。繊維反射の強度およびコントラストは、レー?...

細胞移動の分野では、ブランドの新しい三次元の世界に勇敢に立ち向かうされています。これは、最も近い3次元（3D）、したがって、生理1に似ており、環境内の細胞遊走を研究する直感的である。しかし、技術的な制限により、ほとんどの細胞遊走試験は、未処理又は適切な細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されたいずれかの剛体二次元（2D）基板を横切って細胞運動を解析することが行われている。 三次元コラーゲン格子において細胞遊走に捧げ最初の研究は20年以上戻って1-3行く。ただし、過去5年間では遊走細胞が実質的にその形態や基板の次元に応じて、移行のモードで異なる可能性があることが明らかになった。 2Dで、細胞が広いだけで平坦突起の形成（葉状）、その結果、接着斑を使用して、腹面を有する基板に連絡彼らのリーディングエッジに埋め込まれた指状の突起（糸状仮足）。これらの構造体は、一緒に後縁へのセル前面を接続するストレスファイバーと、2Dで細胞運動のために重要であると考えられている。 3Dマトリックス中に、細胞が形成し、これらの構造の多くの機能的関連性にかなりの変化を引き起こし、ECMを接触全体細胞表面と、一般的に細長いある。逆に、他の細胞の機能は、このようなECMリモデリング4に関わる核変形や構造などの3D移行に関連性を得ることができます。 これらの既知の形態学的変化、ならびにECMおよび細胞型に応じて変化し得る5-7移行モードの違いは、3Dマトリックス内に埋め込 ​​まれた細胞の構造的および機能的な解析にもかかわらず、依然として異常なままである。太く密3D行列の操作技術などの高解像度の顕微鏡イメージングなど困難、最も安定して非互換性を運ぶndardプロトコルは、内因性タンパク質の免疫蛍光ラベルのように、2次元文化のために最適化されています。 3Dマトリックスの使用は比較的新しいアプローチであるため、また、研究者は依然として密接な異なる組織器官の正常な間質アーキテクチャまたは腫瘍の周囲のECM組織として生体内の状況で特定の似ているように最高の条件を調査している。異なるグループに関する検索結果の矛盾は、例えば、癌細胞の遊走のモードや接着斑の存在は、いくつかの論争8を生成した。多くの努力が最近ECM化学的性質、細孔径、繊維の太さ、およびマトリックス剛性の点で合意に達するために専念してきました。 3D ECMは多くの異なるタイプの現在市販されているマトリゲルに細胞由来のマトリックスを変化させ、使用されている、pepsinizedウシコラーゲンI、またはnonpepsinizedラット尾部コラーゲンI.は、これらの行列の各々は、特定の物理的および化学的性質を有し、相対する1つのニーズ検討されて生理的プロセスに最適なTEが行列。また、細孔径および繊維の厚さは、例えばpH及び温度9,10等の重合条件に依存することができる。にとガラスのようなリジッド基板からの距離バインド、またマトリックス10,11の弾性特性を変更することができます。 この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞スフェロイドの製造方法は、以前に、ハンギングドロップ法12,13およびアガロースでコーティングされたプレート法14、最も人気のあるものに記載されている。癌細胞の移動に適したECMの基板として、Iは室温で重合nonpepsinizedラット尾コラーゲンは2 mg / mlのに使用される。 Nonpepsinized酸抽出したコラーゲンラット尾から私は両方のN-およびC-末端テロペプチド、天然コラーゲンintermolecの責任コラーゲン分子のnonhelical部分を保持ウラル架橋とfibrilar安定性15。併せて、これらの条件に最も近いインビボ 10 で観察されたものに似たコラーゲンネットワークの形成を可能にする。詳細なプロトコルは、蛍光5を用いたin vitro 10 中のコラーゲンを標識するために設けられている固定および培養物中で生きている、コラーゲン繊維の視覚化を可能にする- （および-6） -カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、スクシンイミジルエステル。このプロトコルはBaici らから適応されています。フルオレセインイソチオシアネートは、水溶性のコラーゲン分子を標識するために使用されている16,17。フルオレセインとして、TAMRAは、例えば、N末端の遊離アミノ基と、より重要なのは、リシンの側アミノ基のようなタンパク質のnonprotonated脂肪族アミノ基と反応するアミノ反応性蛍光色素である。リジンアミノ基がnonprotonated形態である場合、この反応は、塩基性のpHで起こる。 TAMRAに加えて上のフルオレセインよりも安定している時間は、その発光スペクトルは便利GFPタグ融合タンパク質の生細胞イメージングのために組み合わせることができ、赤/オレンジレンジ（EX / EM = 518分の555 nm）で、上に落ちる。アミノ反応性色素でラベルされた可溶性コラーゲン分子を使用すると、重合プロセスでも密度、細孔径とコラーゲンマトリックス10,16,18,19の架橋状態には影響を与えません。 このプロトコルは、さらに細胞骨格や細胞骨格に関連するタンパク質を標識するために最適化された内因性タンパク質の三次元免疫ラベリングするための方法も含まれています。このプロトコルの最終的な焦点は、コラーゲンマトリックスの張力に硬質ガラス製カバースリップの低減に寄与共焦点顕微鏡を用いた3次元培養物の高解像度の画像を取得する方法である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TAMRA, SE</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">C-1171</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxol (Paxitel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>106 226 89 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis Cassette</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris 7.2.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

細胞遊走は、伝統的に、2D基板で研究されている。しかし、それは、問題の生理学的プロセスの次元に似て良い、より適切な3D環境での細胞遊走を研究する必要があることがますます明らかになっている。遊走細胞は、実質的に、彼らは2Dまたは3Dの基板上に移動しているかに応じてその形態と移行のモードで異なる場合があります。 3Dマトリックス内に埋め込まれた細胞のほとんどは標準プロトコル、構造及び機能解析と技術的な問題と互換性がないため、まだ珍しい​​のまま。この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞の移行のための適切なECM​​基板として、我々は、私は室温で重合し、蛍光共焦点顕微鏡の標準を使用して可視化を容易にするためのラベルnonpepsinizedラット尾コラーゲンを使用しています。この作品はまた、protocを含む内因性の細胞骨格の3D免疫標識OL。我々は、分子組成、ローカリゼーション、および3Dで細胞構造の機能のより良い記述に貢献したいと考えて、これらのプロトコルを使用する。

TAMRAとラットテールコラーゲンIにラベルを付けると3Dコラーゲンネットワークの容易な作成と可視化を可能にします。 生体 10 で見つかったものに匹敵する組織とコラーゲンネットワークの形成における室温結果でスロー重合。 ここでは、回転楕円体として単一細胞としても、CT26癌細胞の細胞骨格の免疫蛍光染色するためのプロトコルを提示...

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Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K ビュー.  Institut Curie. この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。 

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

医学

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

生きたマウスのシリアル内視鏡イメージングを使用して、腸の異常のための新しい治療の有効性の非侵襲的評価

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...