Gli autori ringraziano il Dott. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) per un&#39;immagine acquisizione ed elaborazione in Figura 3 e PICT-IBISA Imaging Facility (Istituto Curie). Questo lavoro è stato sostenuto da ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 e PIC 3D - Complesso in modelli cellulari in vitro.

1. TAMRA-collagene I Etichettatura <ol><li> Preparare a 10 mg / ml soluzione TAMRA con l&#39;aggiunta di 2,5 ml di DMSO a quello in dotazione 25 mg TAMRA polvere. Sciogliere nel vortex fino a completa dissoluzione. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li><li> Preparare 2 L di Labeling Buffer (0,25 M NaHCO3, 0,4 M di NaCl). Regolare il pH a 9,5 con soluzione 10 M di NaOH. Conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate a 4 º C se non diversamente indicato e materiale fluorescente è protetta dalla luce con un foglio di alluminio. </li><li> Riempire una siringa monouso 1 ml con 1 ml di altamente concentrato coda di ratto collagene I soluzione. Soluzioni ad alta concentrazione di collagene sono tipicamente forniti a concentrazioni circa 10 mg / ml e sono molto viscoso. Assicurati di manipolarla lentamente per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Utilizzando un ago G 21 ipodermico, iniettare il collagene in un ammollo 3 ml cassetta dialisi di 10.000 MWCO tagliata. Usare cautela per evitare damastituito la membrana con l&#39;ago. Rimuovere tutta l&#39;aria dalla cassetta dialisi sollevando il pistone della siringa. Dializzare durante la notte contro 1 L di Labeling Buffer. </li><li> Mescolare 100 ml di 10 mg / ml soluzione TAMRA con 900 ml di Labeling Buffer. Nota: Questo dovrebbe essere fatto sia con soluzione TAMRA e Labeling tampone a temperatura ambiente da DMSO congela a 4 ° C. Dopo la miscelazione, portare la soluzione diluita TAMRA torna a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione il collagene dalla cassetta dialisi utilizzando una siringa monouso da 2 ml con un ago G 21 ipodermico. Miscelare 1 ml della soluzione di collagene dializzata con 1 ml di soluzione diluita TAMRA pipettando. </li><li> Trasferire il collagene / TAMRA miscela in una provetta da 2 ml ed incubare una notte con la rotazione. </li><li> Trasferire il 2 ml di collagene TAMRA marcato in un 3 ml cassetta dialisi ammollo e Dializzare overnight contro 1 L di tampone Labeling per rimuovere l&#39;eccesso di colorante libero. </li><li> Per ripristinare il TAMRA-labcollagene eLED alla soluzione originale collagene, posizionare la cassetta dialisi in 1 L di 0,2% (v / v) di acido acetico, pH 4, e dializza overnight. </li><li> Misurare il volume finale del collagene TAMRA marcato e calcolare la sua concentrazione finale, considerando il volume iniziale e la concentrazione della soluzione utilizzata collagene. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. 3D Matrici TAMRA-collagene con impliciti singole cellule <ol><li> Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix necessaria per l&#39;esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene. </li><li> Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili. </li><li> Mescolare 10x PBS e 1 N NaOH in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 mldi Tamra-Collagene Mix a pH 7,4, unire 100 ml di PBS 10X con 5 ml di NaOH 1N. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di collagene non marcato. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Aggiungere cellule sospese nel volume appropriato di medie cella refrigerata senza FBS al TAMRA-Collagene Mix per ottenere una densità cellulare finale di 10 5 cellule / ml e una concentrazione finale di collagene di 2 mg / ml. Per esempio, per 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 388,81 ml di supporto contenente 10 5 cellule. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su un test del pH sviaggio. </li><li> Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d&#39;acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l&#39;aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml. </li><li> Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire i collagene / cella gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. Mantenere a 37 ° C in 10% di CO 2 dell&#39;aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni). </li></ol> 3. 3D Matrici TAMRA-collagene con sferoidi cellulari embedded <ol><li> Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix necessario per l&#39;esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene. </li><li> Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili. </li><li> Mescolare 10x PBS, 1 N NaOH e supporti cellulari senza FBS in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di collagene-TAMRA Mix a pH 7,4, 100 pl di combinare 10x PBS, 5 ml di NaOH 1 N e 388,81 ml di media. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di unlacollagene Beled. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su una striscia di test del pH. </li><li> Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciarlo per iniziare la polimerizzazione per 2-5 min. Questo aiuterà a prevenire affondamento degli sferoidi, aumentando leggermente la viscosità del gel. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. </li><li> Raccogliere uno sferoide cella e metterlo su un piatto pulito Petri. Rimuovere ogni eccesso di liquido e risospendere in 10 ml di Tamra-Collagene Mix. Questo è importante per evitare la diluizione del collagene con supporti cellulari. </li><li> Usando una pipetta P20, raccogliere il collagene sospeso sferoide e collocarlo sulla parte superiore centrale di 100 l TAMRA-Collagene goccia del Mix. Nota: Non inserire più di una sferoide per goccia di collagene, dal momento che possono influenzare l&#39;un l&#39;altro la capacità di invadere e / o migrare. </li><li> Lasciare che il TAMRA-Collagene Mix di poliMerize a temperatura ambiente per 30-45 min. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d&#39;acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l&#39;aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml. </li><li> Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire il collagene / sferoidi gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. </li><li> Conservare a 37 ° C in 10% di CO 2 aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di invadere / migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni). </li></ol> 4. 3D immunofluorescenza <ol><li> Rimuovere delicatamente il supporto di cellule e lavare le matrici di collagene contenenti cellule / sferoidi con PBS. </li><li> Simultaneamente fissare e estrarre cellule mediante incubazione con estrazione / fissaggio tampone (PFA 4%, 0,3% Triton X-100, 5% di saccarosio in PBS) per 5 min. Supplemento il buffer con 2 mM falloidina e 2 mM Taxol per la visualizzazione di citoscheletro o proteine ​​del citoscheletro associati. </li><li> Fissare ulteriormente le celle con 4% PFA, 5% di saccarosio in PBS per 30 min. Risciacquare con 0,05% di Tween-20 in PBS. </li><li> Preparare le soluzioni di anticorpi primari in PBS. Incubare le cellule con anticorpi primari per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di aggiungere una soluzione sufficiente a coprire l&#39;intera perdita di collagene. Per un piatto fondo di vetro 35 mm, 1,5-2 ml di soluzione sarà necessario. Nota: Per ridurre il volume della soluzione di anticorpo, una barriera insolubile in acqua, come ad esempio una linea circolare di grasso al silicone o un anello PDMS, può essere disposto intorno alla goccia collagene. </li><li> Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Preparare anticorpi secondari coniugati con Alexa, soluzioni DAPI Alexa coniugato falloidina e in PBS. Incubare le cellule con gli appropriati anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di liquido, aggiungere abbastanza supporti di montaggio per riempire il fondo di vetro piatto fondo (circa 500 ml) e inserire un 24 millimetri coprioggetto sopra per sigillare. Non premere il vetrino per evitare di comprimere la caduta di collagene e di danneggiare l&#39;organizzazione 3D. </li></ol> 5. Imaging campione Disco microscopi confocale Classic o spinning può essere utilizzato. Un sistema capovolta può preferenzialmente essere usato per determinare la distanza delle cellule imaged dal fondo di vetro. Il sistema utilizzato per questo lavoro è un invertito confocale disco rotante dotato di una 40X/1.3NA e un 60X/1.4NA obiettivi ad immersione in olio (di lavoro distanze di 200 micron e 130 micron, rispettivamente), una fotocamera CoolSNAP fotometrici HQ2, 1392 x 1040 gamma di imaging, 6,45 x 6,45 micron pixel e controllate dal software Metamorph imaging. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm laser sono in genere utilizzati a potenza 30-50%, guadagnare 1 e binning di 2x 2 per ridurre i tempi di esposizione. Il microscopio è inoltre dotato di una lampada a mercurio e cubetti di filtro per DAPI (EXC 400-418 nm; em 450-465), coniugati (exc 478-495; em 510-555) e Texas Red (exc 560-580; em 600 -650), da utilizzare con l&#39;oculare. <ol><li> Utilizzando la lampada fluorescente, posizionare l&#39;obiettivo 40X al centro della goccia collagene. Ottenere una panoramica del campione, sia nell&#39;asse xy e l&#39;asse z. Assicuratevi di non discostarsi più di 100 micron dal bordo gel sull&#39;asse xy quando l&#39;acquisizione delle immagini per evitare effetti di bordo. Quando sferoidi di imaging, assicurarsi che siano sotto la distanza di lavoro obiettivo. Cambiare obiettivo, se del caso. </li><li> Passare alla modalità di imaging dal vivo confocale. Utilizzando il laser 561 nm per visualizzare il collagene TAMRA-etichettato, partendo dal fondo di vetro determinare il valore Z da cui le fibre di collagene cominciano ad apparire. Questo è il fondo substrato e z = 0. </li><li> Usando la manopola di messa a fuoco, salire 100 micron da z = 0. Solo le celle a Z = 100 microno sopra dovrebbe essere ripreso per evitare gli effetti di tensione dal fondo di vetro rigida. </li><li> Selezionare le celle di immagine. Ottimizzare i tempi di esposizione della fotocamera e la potenza del laser per ogni lunghezza d&#39;onda. Tempi di esposizione tipici per DAPI e Alexa-488 falloidina sono tra i 100-200 msec. I tempi di esposizione per la colorazione degli anticorpi possono variare. </li><li> Sulla modalità live confocale utilizzando il laser appropriato per visualizzare il falloidina colorazione e usando la manopola di messa a fuoco, definire l&#39;intervallo di serie z, impostando valori z superiore e inferiore di corrente. </li><li> Definire la dimensione z-passo. Per obiettivi 40X, utilizzare 1 micron. Per 60X, utilizzare 0,5 micron. Avvia acquisizione. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo qui descritto per etichettare fluorescently collagene I usando TAMRA fornisce un metodo eccellente per consentire una facile visualizzazione della organizzazione rete di collagene, utilizzando un microscopio confocale campione fornito di un laser a 561 nm. Un vantaggio di questa tecnica rispetto al riflettanza microscopia confocale è la capacità di immagine più profonde fibre collagene nella matrice 3D. L&#39;intensità e contrasto della riflessione fibre diminuisce notevolmente con profondità dovuto a...

Il campo della migrazione delle cellule è stato sfidando nel nuovo mondo tridimensionale del marchio. È intuitivo studiare la migrazione delle cellule in un ambiente che più assomiglia quelle fisiologiche e, pertanto, tridimensionale (3D). Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, studi di migrazione più cellule sono state fatte analizzando movimento cellulare attraverso substrati bidimensionali (2D) rigidi, sia non trattati o rivestiti con adeguate proteine ​​della matrice extracellulare (ECM). I primi studi dedicati alla migrazione delle cellule in tre reticoli di collagene tridimensionali risalgono ad oltre 20 anni 1-3. Tuttavia, solo negli ultimi 5 anni è diventato chiaro che cellule migranti potrebbero sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione seconda della dimensionalità del substrato. In 2D, cellule solo contatto il substrato con la loro superficie ventrale utilizzando adesioni focali, causando la formazione di sporgenze piatte larghe (lamellipodi) conincorporati sporgenze simili a dita (filopodia) al loro bordo. Queste strutture, insieme a fibre di stress che collegano la parte anteriore cella al bordo di uscita, sono da ritenersi cruciale per il movimento delle cellule in 2D. In matrici 3D, le cellule sono generalmente più allungata, con l&#39;intera superficie cellulare contattare la ECM, causando notevoli cambiamenti nella formazione e la rilevanza funzionale di molte di queste strutture. Al contrario, le altre caratteristiche cellulari guadagnare rilevanza nella migrazione 3D, come ad esempio la deformazione nucleare e strutture coinvolte nel rimodellamento 4. Nonostante queste note alterazioni morfologiche, così come le differenze di modalità di migrazione 5-7, che possono variare a seconda della ECM e tipi di cellule, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all&#39;interno di matrici 3D rimane ancora inusuale. Lavorare con spesse e dense matrici 3D trasporta difficoltà tecniche, come ad esempio ad alta risoluzione di immagini di microscopia, e le incompatibilità con la maggior parte staprotocolli ndard ottimizzati per le culture in 2D, come l&#39;etichettatura immunofluorescenza di proteine ​​endogene. Inoltre, poiché l&#39;uso di matrici 3D è un approccio relativamente nuovo, i ricercatori stanno ancora studiando le migliori condizioni per assomigliare specifico in situazioni in vivo, come la normale architettura stromale di organi diversi tessuti o l&#39;organizzazione ECM attorno a un tumore. Discrepanze nei risultati per i diversi gruppi riguardanti, ad esempio, le modalità di cellule di cancro della migrazione o l&#39;esistenza di adesioni focali, hanno generato qualche polemica 8. Un grande sforzo è stato recentemente dedicato a raggiungere un consenso in termini di ECM chimica natura, dimensione dei pori, lo spessore delle fibre, e matrice di rigidezza. Molti diversi tipi di ECM 3D sono attualmente utilizzati, che variano da cellule matrici derivate per disponibile in commercio matrigel, pepsinized collagene bovino io, o nonpepsinized ratto coda di collagene I. Ciascuna di queste matrici ha specifiche proprietà fisiche e chimiche e uno ha bisogno di relate la matrice di scelta per il processo fisiologico in fase di studio. Inoltre, le dimensioni e la fibra spessore pori può dipendere da condizioni di polimerizzazione, quali pH e temperatura 9,10. Legandosi e distanza da supporti rigidi quali vetro, può anche modificare le proprietà elastiche della matrice 10,11. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l&#39;imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Metodi per rendere sferoidi di cellule di cancro sono stati precedentemente descritti, i più diffusi sono il metodo della goccia pendente 12,13 e il metodo della piastra di agarosio rivestita 14. Come substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzate a temperatura ambiente viene utilizzato a 2 mg / ml. Nonpepsinized collagene estratte con acido, io dalla coda di ratto mantiene entrambe le C-terminale N-e telopeptide, porzioni nonhelical della molecola di collagene responsabili di collagene nativo intermolecreticolazione lare e stabilità fibrilar 15. Insieme, queste condizioni consentono la formazione di reti di collagene che la maggior parte sono molto simili a quelli osservati in vivo 10. Per permettere la visualizzazione delle fibre collagene, sia in culture fisse e vivente, un protocollo dettagliato è fornito per etichettare fluorescently collagene in vitro 10 usando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimmidil estere. Questo protocollo è stato adattato da Baici et al. 16,17, dove fluoresceina isotiocianato viene utilizzato per etichettare molecole di collagene solubili. Come fluoresceina, TAMRA è un colorante fluorescente amino-reattivo che reagisce con nonprotonated alifatici gruppi amminici delle proteine, come gruppo ammino libero al terminale N e, soprattutto, il lato gruppo amminico di lisine. Questa reazione si verifica solo a pH basico, quando il gruppo amminico della lisina è in forma nonprotonated. Oltre a TAMRA essere più stabile di fluoresceina sopratempo, il suo spettro di emissione cade sul campo di colore arancione / rosso (ex / em = 555/518 nm), che possono essere utilmente combinati per l&#39;imaging cellulare dal vivo di proteine ​​GFP-tagged. Utilizzando collagene molecole marcate con coloranti solubili ammino-reattivi non influenza il processo di polimerizzazione, né la densità, dimensione dei pori e lo stato reticolazione della matrice di collagene 10,16,18,19. Questo protocollo include anche un metodo per l&#39;etichettatura immunofluorescenza 3D di proteine ​​endogene, che è stato ulteriormente ottimizzato per etichettare il citoscheletro o proteine ​​associate citoscheletro. L&#39;obiettivo finale di questo protocollo è sui metodi per acquisire immagini ad alta risoluzione delle culture 3D utilizzando la microscopia confocale a ridotto apporto di vetrini rigidi sulla tensione matrice di collagene.

<table><tbody><tr><td>TAMRA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C-1171</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rat tail Collagen High Concentration</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rat tail Collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P2141</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taxol (Paxitel)</td><td>Sigma</td><td>T7402</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Fisher Scientific</td><td>106 226 89</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialysis Cassette</td><td>Pierce</td><td>66380</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation &amp;amp; Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris 7.2.3</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

La migrazione cellulare è stato tradizionalmente studiato in substrati 2D. Tuttavia, è diventato sempre più evidente che vi è la necessità di studiare la migrazione delle cellule in più appropriati ambienti 3D, che meglio ricordano la dimensionalità dei processi fisiologici in questione. Cellule migratorie possono sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione a seconda che si stanno muovendo su substrati in 2D o 3D. A causa di difficoltà tecniche e le incompatibilità con i protocolli più standard, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all&#39;interno di matrici 3D rimane ancora raro. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l&#39;imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Come un substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, usiamo nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzato a temperatura ambiente e fluorescente per facilitare la visualizzazione usando microscopi confocale standard. Questo lavoro include anche un protocolo per l&#39;etichettatura immunofluorescenza 3D del citoscheletro delle cellule endogene. L&#39;utilizzo di questi protocolli speriamo di contribuire ad una migliore descrizione della composizione molecolare, localizzazione e funzioni delle strutture cellulari in 3D.

Etichettatura coda di topo collagene I con TAMRA consente una preparazione facile e la visualizzazione delle reti di collagene 3D. Polimerizzazione lenta a pranzo risultati di temperatura nella formazione di reti di collagene con organizzazione paragonabili a quelle presenti in vivo 10. Qui vi presentiamo un protocollo per immunofluorescenza del citoscheletro delle cellule tumorali CT26, sia come sferoidi e come cellule singole. Per conservare meglio il citoscheletro, i b...

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Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Rivelare l&#39;organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Views.  Institut Curie.  Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D. 

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Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Ricerca

Medicina

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Ricerca sul cancro

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Modelli 3D in Biologia del Cancro: Dinamiche di Invasione negli Eterosferoidi

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autore in primo piano: Decifrare il crosstalk tra cancro e cellule immunitarie durante la progressione del cancro della testa e del collo

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione