Gli autori ringraziano il Dott. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) per un&#39;immagine acquisizione ed elaborazione in Figura 3 e PICT-IBISA Imaging Facility (Istituto Curie). Questo lavoro è stato sostenuto da ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 e PIC 3D - Complesso in modelli cellulari in vitro.

1. TAMRA-collagene I Etichettatura <ol><li> Preparare a 10 mg / ml soluzione TAMRA con l&#39;aggiunta di 2,5 ml di DMSO a quello in dotazione 25 mg TAMRA polvere. Sciogliere nel vortex fino a completa dissoluzione. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li><li> Preparare 2 L di Labeling Buffer (0,25 M NaHCO3, 0,4 M di NaCl). Regolare il pH a 9,5 con soluzione 10 M di NaOH. Conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate a 4 º C se non diversamente indicato e materiale fluorescente è protetta dalla luce con un foglio di alluminio. </li><li> Riempire una siringa monouso 1 ml con 1 ml di altamente concentrato coda di ratto collagene I soluzione. Soluzioni ad alta concentrazione di collagene sono tipicamente forniti a concentrazioni circa 10 mg / ml e sono molto viscoso. Assicurati di manipolarla lentamente per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Utilizzando un ago G 21 ipodermico, iniettare il collagene in un ammollo 3 ml cassetta dialisi di 10.000 MWCO tagliata. Usare cautela per evitare damastituito la membrana con l&#39;ago. Rimuovere tutta l&#39;aria dalla cassetta dialisi sollevando il pistone della siringa. Dializzare durante la notte contro 1 L di Labeling Buffer. </li><li> Mescolare 100 ml di 10 mg / ml soluzione TAMRA con 900 ml di Labeling Buffer. Nota: Questo dovrebbe essere fatto sia con soluzione TAMRA e Labeling tampone a temperatura ambiente da DMSO congela a 4 ° C. Dopo la miscelazione, portare la soluzione diluita TAMRA torna a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione il collagene dalla cassetta dialisi utilizzando una siringa monouso da 2 ml con un ago G 21 ipodermico. Miscelare 1 ml della soluzione di collagene dializzata con 1 ml di soluzione diluita TAMRA pipettando. </li><li> Trasferire il collagene / TAMRA miscela in una provetta da 2 ml ed incubare una notte con la rotazione. </li><li> Trasferire il 2 ml di collagene TAMRA marcato in un 3 ml cassetta dialisi ammollo e Dializzare overnight contro 1 L di tampone Labeling per rimuovere l&#39;eccesso di colorante libero. </li><li> Per ripristinare il TAMRA-labcollagene eLED alla soluzione originale collagene, posizionare la cassetta dialisi in 1 L di 0,2% (v / v) di acido acetico, pH 4, e dializza overnight. </li><li> Misurare il volume finale del collagene TAMRA marcato e calcolare la sua concentrazione finale, considerando il volume iniziale e la concentrazione della soluzione utilizzata collagene. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. 3D Matrici TAMRA-collagene con impliciti singole cellule <ol><li> Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix necessaria per l&#39;esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene. </li><li> Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili. </li><li> Mescolare 10x PBS e 1 N NaOH in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 mldi Tamra-Collagene Mix a pH 7,4, unire 100 ml di PBS 10X con 5 ml di NaOH 1N. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di collagene non marcato. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Aggiungere cellule sospese nel volume appropriato di medie cella refrigerata senza FBS al TAMRA-Collagene Mix per ottenere una densità cellulare finale di 10 5 cellule / ml e una concentrazione finale di collagene di 2 mg / ml. Per esempio, per 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 388,81 ml di supporto contenente 10 5 cellule. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su un test del pH sviaggio. </li><li> Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d&#39;acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l&#39;aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml. </li><li> Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire i collagene / cella gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. Mantenere a 37 ° C in 10% di CO 2 dell&#39;aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni). </li></ol> 3. 3D Matrici TAMRA-collagene con sferoidi cellulari embedded <ol><li> Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix necessario per l&#39;esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene. </li><li> Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili. </li><li> Mescolare 10x PBS, 1 N NaOH e supporti cellulari senza FBS in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di collagene-TAMRA Mix a pH 7,4, 100 pl di combinare 10x PBS, 5 ml di NaOH 1 N e 388,81 ml di media. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di unlacollagene Beled. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su una striscia di test del pH. </li><li> Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciarlo per iniziare la polimerizzazione per 2-5 min. Questo aiuterà a prevenire affondamento degli sferoidi, aumentando leggermente la viscosità del gel. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. </li><li> Raccogliere uno sferoide cella e metterlo su un piatto pulito Petri. Rimuovere ogni eccesso di liquido e risospendere in 10 ml di Tamra-Collagene Mix. Questo è importante per evitare la diluizione del collagene con supporti cellulari. </li><li> Usando una pipetta P20, raccogliere il collagene sospeso sferoide e collocarlo sulla parte superiore centrale di 100 l TAMRA-Collagene goccia del Mix. Nota: Non inserire più di una sferoide per goccia di collagene, dal momento che possono influenzare l&#39;un l&#39;altro la capacità di invadere e / o migrare. </li><li> Lasciare che il TAMRA-Collagene Mix di poliMerize a temperatura ambiente per 30-45 min. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d&#39;acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l&#39;aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml. </li><li> Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire il collagene / sferoidi gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. </li><li> Conservare a 37 ° C in 10% di CO 2 aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di invadere / migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni). </li></ol> 4. 3D immunofluorescenza <ol><li> Rimuovere delicatamente il supporto di cellule e lavare le matrici di collagene contenenti cellule / sferoidi con PBS. </li><li> Simultaneamente fissare e estrarre cellule mediante incubazione con estrazione / fissaggio tampone (PFA 4%, 0,3% Triton X-100, 5% di saccarosio in PBS) per 5 min. Supplemento il buffer con 2 mM falloidina e 2 mM Taxol per la visualizzazione di citoscheletro o proteine ​​del citoscheletro associati. </li><li> Fissare ulteriormente le celle con 4% PFA, 5% di saccarosio in PBS per 30 min. Risciacquare con 0,05% di Tween-20 in PBS. </li><li> Preparare le soluzioni di anticorpi primari in PBS. Incubare le cellule con anticorpi primari per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di aggiungere una soluzione sufficiente a coprire l&#39;intera perdita di collagene. Per un piatto fondo di vetro 35 mm, 1,5-2 ml di soluzione sarà necessario. Nota: Per ridurre il volume della soluzione di anticorpo, una barriera insolubile in acqua, come ad esempio una linea circolare di grasso al silicone o un anello PDMS, può essere disposto intorno alla goccia collagene. </li><li> Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Preparare anticorpi secondari coniugati con Alexa, soluzioni DAPI Alexa coniugato falloidina e in PBS. Incubare le cellule con gli appropriati anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di liquido, aggiungere abbastanza supporti di montaggio per riempire il fondo di vetro piatto fondo (circa 500 ml) e inserire un 24 millimetri coprioggetto sopra per sigillare. Non premere il vetrino per evitare di comprimere la caduta di collagene e di danneggiare l&#39;organizzazione 3D. </li></ol> 5. Imaging campione Disco microscopi confocale Classic o spinning può essere utilizzato. Un sistema capovolta può preferenzialmente essere usato per determinare la distanza delle cellule imaged dal fondo di vetro. Il sistema utilizzato per questo lavoro è un invertito confocale disco rotante dotato di una 40X/1.3NA e un 60X/1.4NA obiettivi ad immersione in olio (di lavoro distanze di 200 micron e 130 micron, rispettivamente), una fotocamera CoolSNAP fotometrici HQ2, 1392 x 1040 gamma di imaging, 6,45 x 6,45 micron pixel e controllate dal software Metamorph imaging. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm laser sono in genere utilizzati a potenza 30-50%, guadagnare 1 e binning di 2x 2 per ridurre i tempi di esposizione. Il microscopio è inoltre dotato di una lampada a mercurio e cubetti di filtro per DAPI (EXC 400-418 nm; em 450-465), coniugati (exc 478-495; em 510-555) e Texas Red (exc 560-580; em 600 -650), da utilizzare con l&#39;oculare. <ol><li> Utilizzando la lampada fluorescente, posizionare l&#39;obiettivo 40X al centro della goccia collagene. Ottenere una panoramica del campione, sia nell&#39;asse xy e l&#39;asse z. Assicuratevi di non discostarsi più di 100 micron dal bordo gel sull&#39;asse xy quando l&#39;acquisizione delle immagini per evitare effetti di bordo. Quando sferoidi di imaging, assicurarsi che siano sotto la distanza di lavoro obiettivo. Cambiare obiettivo, se del caso. </li><li> Passare alla modalità di imaging dal vivo confocale. Utilizzando il laser 561 nm per visualizzare il collagene TAMRA-etichettato, partendo dal fondo di vetro determinare il valore Z da cui le fibre di collagene cominciano ad apparire. Questo è il fondo substrato e z = 0. </li><li> Usando la manopola di messa a fuoco, salire 100 micron da z = 0. Solo le celle a Z = 100 microno sopra dovrebbe essere ripreso per evitare gli effetti di tensione dal fondo di vetro rigida. </li><li> Selezionare le celle di immagine. Ottimizzare i tempi di esposizione della fotocamera e la potenza del laser per ogni lunghezza d&#39;onda. Tempi di esposizione tipici per DAPI e Alexa-488 falloidina sono tra i 100-200 msec. I tempi di esposizione per la colorazione degli anticorpi possono variare. </li><li> Sulla modalità live confocale utilizzando il laser appropriato per visualizzare il falloidina colorazione e usando la manopola di messa a fuoco, definire l&#39;intervallo di serie z, impostando valori z superiore e inferiore di corrente. </li><li> Definire la dimensione z-passo. Per obiettivi 40X, utilizzare 1 micron. Per 60X, utilizzare 0,5 micron. Avvia acquisizione. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+(VLA-2)+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells.">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li><li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils.">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li><li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44.">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesions+in+3D.">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li><li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy.">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li><li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering.">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin.">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li><li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+in+collagen+and+elastin.">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li><li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., B&#246;ni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils.">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li><li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels.">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li><li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP.">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li><li>Jawerth, L. M., M&#252;nster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy:+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks.">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li><li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecular+structure+to+tissue+architecture:+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy.">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo qui descritto per etichettare fluorescently collagene I usando TAMRA fornisce un metodo eccellente per consentire una facile visualizzazione della organizzazione rete di collagene, utilizzando un microscopio confocale campione fornito di un laser a 561 nm. Un vantaggio di questa tecnica rispetto al riflettanza microscopia confocale è la capacità di immagine più profonde fibre collagene nella matrice 3D. L&#39;intensità e contrasto della riflessione fibre diminuisce notevolmente con profondità dovuto a...

Il campo della migrazione delle cellule è stato sfidando nel nuovo mondo tridimensionale del marchio. È intuitivo studiare la migrazione delle cellule in un ambiente che più assomiglia quelle fisiologiche e, pertanto, tridimensionale (3D). Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, studi di migrazione più cellule sono state fatte analizzando movimento cellulare attraverso substrati bidimensionali (2D) rigidi, sia non trattati o rivestiti con adeguate proteine ​​della matrice extracellulare (ECM). I primi studi dedicati alla migrazione delle cellule in tre reticoli di collagene tridimensionali risalgono ad oltre 20 anni 1-3. Tuttavia, solo negli ultimi 5 anni è diventato chiaro che cellule migranti potrebbero sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione seconda della dimensionalità del substrato. In 2D, cellule solo contatto il substrato con la loro superficie ventrale utilizzando adesioni focali, causando la formazione di sporgenze piatte larghe (lamellipodi) conincorporati sporgenze simili a dita (filopodia) al loro bordo. Queste strutture, insieme a fibre di stress che collegano la parte anteriore cella al bordo di uscita, sono da ritenersi cruciale per il movimento delle cellule in 2D. In matrici 3D, le cellule sono generalmente più allungata, con l&#39;intera superficie cellulare contattare la ECM, causando notevoli cambiamenti nella formazione e la rilevanza funzionale di molte di queste strutture. Al contrario, le altre caratteristiche cellulari guadagnare rilevanza nella migrazione 3D, come ad esempio la deformazione nucleare e strutture coinvolte nel rimodellamento 4. Nonostante queste note alterazioni morfologiche, così come le differenze di modalità di migrazione 5-7, che possono variare a seconda della ECM e tipi di cellule, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all&#39;interno di matrici 3D rimane ancora inusuale. Lavorare con spesse e dense matrici 3D trasporta difficoltà tecniche, come ad esempio ad alta risoluzione di immagini di microscopia, e le incompatibilità con la maggior parte staprotocolli ndard ottimizzati per le culture in 2D, come l&#39;etichettatura immunofluorescenza di proteine ​​endogene. Inoltre, poiché l&#39;uso di matrici 3D è un approccio relativamente nuovo, i ricercatori stanno ancora studiando le migliori condizioni per assomigliare specifico in situazioni in vivo, come la normale architettura stromale di organi diversi tessuti o l&#39;organizzazione ECM attorno a un tumore. Discrepanze nei risultati per i diversi gruppi riguardanti, ad esempio, le modalità di cellule di cancro della migrazione o l&#39;esistenza di adesioni focali, hanno generato qualche polemica 8. Un grande sforzo è stato recentemente dedicato a raggiungere un consenso in termini di ECM chimica natura, dimensione dei pori, lo spessore delle fibre, e matrice di rigidezza. Molti diversi tipi di ECM 3D sono attualmente utilizzati, che variano da cellule matrici derivate per disponibile in commercio matrigel, pepsinized collagene bovino io, o nonpepsinized ratto coda di collagene I. Ciascuna di queste matrici ha specifiche proprietà fisiche e chimiche e uno ha bisogno di relate la matrice di scelta per il processo fisiologico in fase di studio. Inoltre, le dimensioni e la fibra spessore pori può dipendere da condizioni di polimerizzazione, quali pH e temperatura 9,10. Legandosi e distanza da supporti rigidi quali vetro, può anche modificare le proprietà elastiche della matrice 10,11. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l&#39;imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Metodi per rendere sferoidi di cellule di cancro sono stati precedentemente descritti, i più diffusi sono il metodo della goccia pendente 12,13 e il metodo della piastra di agarosio rivestita 14. Come substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzate a temperatura ambiente viene utilizzato a 2 mg / ml. Nonpepsinized collagene estratte con acido, io dalla coda di ratto mantiene entrambe le C-terminale N-e telopeptide, porzioni nonhelical della molecola di collagene responsabili di collagene nativo intermolecreticolazione lare e stabilità fibrilar 15. Insieme, queste condizioni consentono la formazione di reti di collagene che la maggior parte sono molto simili a quelli osservati in vivo 10. Per permettere la visualizzazione delle fibre collagene, sia in culture fisse e vivente, un protocollo dettagliato è fornito per etichettare fluorescently collagene in vitro 10 usando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimmidil estere. Questo protocollo è stato adattato da Baici et al. 16,17, dove fluoresceina isotiocianato viene utilizzato per etichettare molecole di collagene solubili. Come fluoresceina, TAMRA è un colorante fluorescente amino-reattivo che reagisce con nonprotonated alifatici gruppi amminici delle proteine, come gruppo ammino libero al terminale N e, soprattutto, il lato gruppo amminico di lisine. Questa reazione si verifica solo a pH basico, quando il gruppo amminico della lisina è in forma nonprotonated. Oltre a TAMRA essere più stabile di fluoresceina sopratempo, il suo spettro di emissione cade sul campo di colore arancione / rosso (ex / em = 555/518 nm), che possono essere utilmente combinati per l&#39;imaging cellulare dal vivo di proteine ​​GFP-tagged. Utilizzando collagene molecole marcate con coloranti solubili ammino-reattivi non influenza il processo di polimerizzazione, né la densità, dimensione dei pori e lo stato reticolazione della matrice di collagene 10,16,18,19. Questo protocollo include anche un metodo per l&#39;etichettatura immunofluorescenza 3D di proteine ​​endogene, che è stato ulteriormente ottimizzato per etichettare il citoscheletro o proteine ​​associate citoscheletro. L&#39;obiettivo finale di questo protocollo è sui metodi per acquisire immagini ad alta risoluzione delle culture 3D utilizzando la microscopia confocale a ridotto apporto di vetrini rigidi sulla tensione matrice di collagene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TAMRA, SE</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">C-1171</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxol (Paxitel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>106 226 89 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis Cassette</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris 7.2.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

La migrazione cellulare è stato tradizionalmente studiato in substrati 2D. Tuttavia, è diventato sempre più evidente che vi è la necessità di studiare la migrazione delle cellule in più appropriati ambienti 3D, che meglio ricordano la dimensionalità dei processi fisiologici in questione. Cellule migratorie possono sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione a seconda che si stanno muovendo su substrati in 2D o 3D. A causa di difficoltà tecniche e le incompatibilità con i protocolli più standard, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all&#39;interno di matrici 3D rimane ancora raro. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l&#39;imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Come un substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, usiamo nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzato a temperatura ambiente e fluorescente per facilitare la visualizzazione usando microscopi confocale standard. Questo lavoro include anche un protocolo per l&#39;etichettatura immunofluorescenza 3D del citoscheletro delle cellule endogene. L&#39;utilizzo di questi protocolli speriamo di contribuire ad una migliore descrizione della composizione molecolare, localizzazione e funzioni delle strutture cellulari in 3D.

Etichettatura coda di topo collagene I con TAMRA consente una preparazione facile e la visualizzazione delle reti di collagene 3D. Polimerizzazione lenta a pranzo risultati di temperatura nella formazione di reti di collagene con organizzazione paragonabili a quelle presenti in vivo 10. Qui vi presentiamo un protocollo per immunofluorescenza del citoscheletro delle cellule tumorali CT26, sia come sferoidi e come cellule singole. Per conservare meglio il citoscheletro, i b...

Watch this Scientific Journal Video about Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D at JoVE.com

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Rivelare l&#39;organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Views.  Institut Curie.  Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D. 

Video: Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Ricerca

Medicina

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblasti

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Invasione Chick Cuore Saggio per il test l&#39;invasività delle cellule tumorali e l&#39;attività di composti potenzialmente anti-invasive

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimamente invasiva trasversale aortica costrizione nei topi

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...