אנו מודים לחברים במעבדה גלפנד שתרם לפיתוח של פרוטוקולים אלה. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי למדע כללי רפואי של המכון הלאומי לבריאות במספר הפרסים R01GM052111 לVIG ועל ידי הבסקים מחלקה ממשלתית לחינוך, אוניברסיטאות ומחקר תחת BFI-2,011-295 מספר הפרסים לUDC.

1. תאי דרוזופילה S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת coverslips ConA המצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח coverslips במעמד קרמיקה ולשטוף אותם על ידי טבילת חומצה כרומית במשך שעה 1. [זהירות: חומצה כרומית היא מאכל ויכולה לגרום לגירוי של עיניים, האף, גרון ועור]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ביסודיות עם coverslips פועל כל הזמן DH 2 O למשך 30 דקות עד לחומצה הוא נשטפה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן אוויר coverslips יבש ואת מעיל אותם עם ConA (פתרון 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר ב DH 2 O) ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips עם DH 2 O ל15 דקות ולתת להם להתייבש באוויר. ניתן לאחסן את coverslips ConA מצופה חודש 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאי S2 לגדול באופן אקספוננציאלי ב2 צלוחיות T25 או T75 סנטימטר בהתאם למספרם של תאים הנדרשים לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer. מ &#39;צמיחת מיליליטר הוסף 1edium (למשל חרקים-Xpress) לתוך צלחת 35 מ&quot;מ רקמת תרבות עם coverslip מצופה ConA, ובעדינות להעביר ~ 1 x 10 5 תאים למנה. צפיפות תא זה היא אופטימלי עבור הדמיה, כי תהליכים מהתאים שונים אינם חופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לגרום להיווצרותם של תהליכים, מייד לאחר ציפוי מוסיף בינוני 1ml עם 5 CytoD מיקרומטר למנה (לריכוז הסופי של 2.5 מיקרומטר CytoD). לאפשר פיתוח מלא של תהליכים על ידי דוגרים התאים לפחות לשעה 2 ב C º 25 לפני ההדמיה. </li></ol></li></ol> 2. דרוזופילה הראשית Neuron תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לתרבות נוירון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום גידול עצבי דרוזופילה (הבינוני של שניידר בתוספת: 20% בסרום שור עוברי, חום מומת ב55 º C למשך 30 דקות; 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין; 10 מיקרוגרם / טטרציקלין מיליליטר) . sup זההמדיום של plemented שניידר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקבוקונים אגר מיץ תפוחים לאיסוף עוברי דרוזופילה (אגר 22.5 גרם, 12.0 סוכרוז גרם ו750 H 2 O מיליליטר בבקבוק 2 ליטר; החיטוי ל20-25 דקות, להוסיף מיץ תפוחי מיליליטר 250 ויוצקים ~ 10 מיליליטר לכל דרוזופילה בקבוקון; לאחר התמצקות, חבר צלוחיות עם כדורי צמר גפן, ולעטוף את צלוחיות עם אריזות פלסטיק של מזון, כדי למנוע על ייבוש של המזון). מיץ התפוחים בצלוחיות אגר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בשקיות פלסטיק אטומות היטב במשך 4 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל שטף חומצת 25 מ&quot;מ המעגל עם ConA (ראה פירוט בפרוטוקול לתאי דרוזופילה S2) ולעקר אותם תחת אור UV ל10-15 דקות. coverslips אלה יכול להיות מאוחסן במשך חודש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות נוירון העוברית דרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוגרים צעירים שמרו עף בצלוחיות אגר מיץ תפוחים בתוספת שמרים יבשים ל1-2 ימים לפני איסוף עוברים ואו הכנת נוירון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום האיסוף, על מנת לסנכרן את העוברים שנאספו, למבוגרים העברה טס לבקבוקון טרי תפוחי מיץ אגר לprecollection שעה 1 באור וזורקים עוברים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים לבקבוקון אגר מיץ תפוחים חדש, לאסוף עובר במשך שעה 1, ולהעביר את הזבובים לבקבוקון נוסף לעוד שעה, גם בחושך כדי להגדיל את תשואת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזבובים הבוגרים מהבקבוקון אגר מיץ תפוחים ולתת לעוברים להתפתח 4 שעות נוספות לשלבי 9-11 בטמפרטורת חדר (4-6 עוברים HR-ישן הם בין השלב 9-11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העוברים על ידי התזת מים לתוך צלוחיות והתרופפות העוברים מאגרו מיץ התפוחים עם מכחול קטן (לפחות 10 עוברים נדרשים להכנת נוירון אחד טובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים למסננת תא רשת ניילון 100 מיקרומטר עם טפטפת העברה לניקוז מים (prerinse טפטפת ההעברה במאגר דרוזופילה לשטוף עובר, 0.4% NaCl, 0.03% טריטוןX-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את העוברים מהמסננת באמצעות מכחול קטן, ולהעביר אותם לתוך 1.5 מיליליטר microtube מלא 1 מיליליטר לשטוף דרוזופילה עובר (הערה: לנקות סיבים אגר או כותנה באמצעות המכחול או הטיפים פיפטה). בפרוטוקול זה, microtube 1.5 מיליליטר מגיע עם העלי גלולה חד פעמי תואם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עוברים בשטיפת עובר דרוזופילה 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate העוברים ב1:1 פתרון חדש של אקונומיקה מסחרית ו95% אתנול עבור 10 דקות [זהירות: אקונומיקה יכולה לגרום לגירוי עיניים, האף, גרון ועור]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למכסת המנוע בתרבית רקמה, ולשטוף את העוברים 2x במדיום של שניידר בתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר 200-300 בינוני μl בצינור עם העוברים, ועדינות מכאנית לנתק עובר Dechorionated באמצעות עלי גלולה חד פעמי קימבל צ&#39;ייס כי כבר מעוקר ידי 70% אתנול (לטחון 10-15x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התערובת הומוגני ב20 XG במשך 2 דקות, וטרהnsfer supernatant לצינור טרי. [שלב זה הוא אופציונלי, זה מסייע להסיר עובר פסולת] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב 550 XG במשך 2 דקות עד גלולה תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב500 μl בתוספת למטה התאים בינוניים וספין של שניידר שוב ב550 XG במשך 2 דקות, לחזור על מחזור resuspension מסתובב פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף resuspend את הכדור ב~ 100 μl בתוספת הבינוני של שניידר וצלחת התאים על גבי coverslip מצופה ConA 25 מ&quot;מ בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ סטרילי. דגירה של 10 דקות כדי לאפשר התקשרות סלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של המדיום של שניידר שיושלם, עם 5 מיקרומטר CytoD להטביע את coverslip עם תאים מצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס humidified לילה לפני ההדמיה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence.</a> 3, 606-611 (2008).</li><li>Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Drosophila+S2+cells+for+light+microscopy.">Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy.</a> J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).</li><li>Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Drosophila+fragile+X+mental+retardation+protein-containing+ribonucleoprotein+granules+by+kinesin-1+and+cytoplasmic+dynein.">Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+binding+by+dynactin+is+required+for+microtubule+organization+but+not+cargo+transport.">Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport.</a> J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).</li><li>Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite-polarity+motors+activate+one+another+to+trigger+cargo+transport+in+live+cells.">Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells.</a> J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).</li><li>Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-mediated+transport+of+the+tumor-suppressor+protein+Merlin+and+its+mutants.">Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).</li><li>Jolly, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+heavy+chain+mediates+microtubule+sliding+to+drive+changes+in+cell+shape.">Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).</li><li>Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule-binding+protein+ensconsin+is+an+essential+cofactor+of+Kinesin-1.">The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1.</a> Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).</li><li>Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+Neurite+Outgrowth+in+Drosophila+Neurons+Is+Driven+by+Kinesin-Powered+Microtubule+Sliding.">Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding.</a> Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).</li><li>Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+myosin+activity+opposes+microtubule-based+axonal+transport+of+mitochondria.">Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria.</a> J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441, 1162-1166 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Koo, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+of+amyloid+protein+in+Alzheimer+disease+undergoes+fast+anterograde+axonal+transport.">Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).</li><li>Stokin, G. B., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+Alzheimer's+disease.">Axonal transport and Alzheimer's disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).</li><li>Bilsland, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+axonal+transport+precede+ALS+symptoms+in+vivo.">Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74, 344-360 (2012).</li><li>Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+required+for+transport+initiation+from+the+distal+axon.">Dynactin is required for transport initiation from the distal axon.</a> Neuron. 74, 331-343 (2012).</li><li>Lorenzo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrin+mutations+that+cause+spinocerebellar+ataxia+type+5+impair+axonal+transport+and+induce+neurodegeneration+in+Drosophila.">Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila.</a> J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Furst, A., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+primary+embryonic+neuroblasts+in+purified+neural+cell+cultures+from+Drosophila.">Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila.</a> Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).</li><li>Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neuronal+differentiation+of+Drosophila+embryo+cells.">In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells.</a> J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains.">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ללימוד הובלת מטעני microtubule תלוי בתאי דרוזופילה S2 ותרבות הנוירון ראשוני. שני תהליכי S2 וneurites הם מבנים מולא על ידי מערכי microtubules ארוזים המשמשים כמסלולים לתחבורת אברון. שתי אסטרטגיות משמשות בדרך ...

תאי דרוזופילה S2 צברו פופולריות הולכת וגוברת ללימוד תהליכים תאיים רבים. תאים אלה התקבלו במקור מעוברים בשלב מאוחר trypsinized של OregonR תסיסנית ולשמור על תכונות כמו מקרופאג-1. תאי דרוזופילה S2 מציעים יתרונות רבים על פני שורות תאים אחרות. הם מתורבתים ב25 מעלות צלזיוס בלי CO 2, ויכולים להיות צילמו במשך שעות רבות בטמפרטורת חדר ללא הצורך בחימום או חילוף גזים. חשוב מכך, תאי דרוזופילה S2 רגישים מאוד לטיפול RNAi המאפשר מציאה יעילות גבוהה של חלבונים של עניין. תאי S2 הם transfectable מאוד יכולים להיות שנבחרו שורות תאי יציבות בפחות מארבעה שבועות, כדי לאפשר ביטוי אקטופי היציב של חלבונים של עניין. תאי S2 בדרך כלל גם לגדול מחוברים באופן רופף, אך לא התפשטו בבקבוק או בהשעיה. הם יכולים להיגרם להתפשט על coverslips precoated עם קונקה לקטינים צמחnavalin (ConA). הפריפריה של תאי ההתפשטות היא דקה במיוחד, ולכן הוא אידיאלי למיקרוסקופיה תא חי. ניתן למצוא בפרוטוקולים מפורטים לתרבות תאי S2, טיפול RNAi, הדמיה אור חי וimmunostaining ב2,3 הספרות. המעבדה שלנו אימצה תאי S2 כמערכת מודל ללמוד הובלת מטענים מבוסס microtubule. תאי דרוזופילה S2 שטופלו בכל תרופה שdepolymerizes או קוטעת F-אקטין, כגון cytochalasin D (CytoD), לגדול תהליכים ארוכים מלאים microtubules אחיד המקוטב 4 -10, מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד תנועת מטענים לאורך מערכי microtubule. פרמטרים שונים של הובלה בתהליכים אלו (. כלומר אורכי מסלולים, מהירויות, יווניות וכו &#39;) ניתן למדוד בקלות באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים אוטומטית, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; ד&quot;ר . פסקל אלוטון: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-I# Nformatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx A4). תכונות אלו הופכות את תאי S2 מערכת מושכת ללימוד הובלת מטענים לאורך microtubules בתאים בתרבית רקמה. ניסויי פיילוט בתאי S2 יכולים להתארך למודל חשוב מבחינה פיזיולוגית של מחקרי הובלת מטענים בנוירונים עיקרי דרוזופילה. בדומה לתאי S2, נוירונים בתרבית מעוברים ניתקו הם חדירים למולקולות קטנות, כגון צבעים ומעכבים, והדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של תחבורת אברון יכולה להתבצע בתאי עצב בטמפרטורת חדר. שימוש בדרוזופילה עם רקע גנטי שונה, אנו יכולים לבחון את תפקוד גן בנוירונים עיקרי בנוקאאוט (מוטציות אובדן של הפונקציה גנטיות), מציאה (הזרקת dsRNA או ביטוי) או ביטוי אקטופי (זבובים מהונדסים). באופן ספציפי, פיצול של סיבי אקטין באמצעות טיפול CytoD אינו מונע תולדת neurite, אלא הם גדלים מהר יותר, ובכך אנו יכולים ללמוד microtubule-dependeתחבורת אברון NT בנוירונים שטופלו CytoD ללא ההשפעה של אקטין חוטי 11. לכן, תרבויות עצביות עיקריות לשלב את היתרונות של תאים בתרבית רקמה ולעוף גנטיקה, מה שהופך את מערכת נהדרת ללמוד הובלת מטענים במערכת רלוונטית פיזיולוגית 10,12. מאז כמה מחלות ניווניות משפחתיות יכולים להיגרם על ידי או קשורה עם מומי הובלת מטענים (למשל מחלת פרקינסון 13, מחלת הנטינגטון 14, מחלת אלצהיימר 15,16, Amyotrophic Lateral Sclerosis / 17 ALS, תסמונת HMN7B ופרי 18,19, וסוג אטקסיה spinocerebellar 5/SCA5 20), תרבויות עצביות עיקריות יכולות להיות שימושיות בניתוח של ההשפעות של מוטציות מסוימות גורמות למחלות אלה בתחבורה microtubule תלוי. לבסוף, מאפיינים חשובים של תחבורת microtubule תלוי הם נשמרים גם בין יונקים וזבובים, אבל <em&gt; התרבות גנטית ותאים דרוזופילה היא פחות יקרה וגוזל זמן, המצדיקה את השימוש בתאי דרוזופילה תרבותיים ללימוד היבטים חיוניים של תחבורת אברון בתנאים נורמלים ופתולוגיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="435">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Powder Insect cell medium (Schneider&#8217;s)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:179px;">S9895</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Insect &#8211;Xpress medium</td>
			<td style="width:133px;">Fisher</td>
			<td style="width:179px;">BW12730Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Insulin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">I6634</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Penicillin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">P93000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">S62000</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">T7660-5G</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:133px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:179px;">S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">C2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">IC15077105</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:133px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:179px;">L7528</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">100 &#181;m Cell strainer</td>
			<td style="width:133px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">22363549</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">25 mm Circle cover glass</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">48380 080</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">89092-730</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:124px;">Disposable pellet pestles with matching microtubes</td>
			<td style="width:133px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:179px;">749520-0000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.

תאי דרוזופילה S2 מצופים על coverslip בנוכחות של כל תהליכי unbranched ארוכי צורת תרופת depolymerizing-אקטין מלאים microtubules אחיד מקוטב. אברונים לנוע לאורך תהליכים אלה על ידי מנועים microtubule. תחזוקה קלה, רגישות גבוהה לחלבון RNAi בתיווך לדפוק למטה והליך יעיל ליצירת שורות תאי יציבות להפוך תאי דרוזופילה S2 מערכת מודל אידיאלי ללמוד הובלת מטענים על ידי הדמיה לחיות. התוצאות שהושגו עם תאי S2 יכולות להיות מיושמות בהמשך ליותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת: תחבורת אקסון בנוירונים העיקרי בתרבית מעוברי דרוזופילה ניתקו. נוירונים בתרבית לגדול neurites הארוכה מלאות microtubules ארוזים, דומה מאוד לתהליכי S2. כמו בתאי S2, האברונים בנוירונים בתרבית ניתן דמיינו ידי שני צבעי ניאון אברון ספציפי או באמצעות סמני אברון ניאון המקודדים על ידי DNA מוזרק לתוך עובריים מוקדם או לידי ביטוי בtransgenic זבובים. לכן, תחבורת אברון ניתן להקליט בקלות בנוירונים בתרבית על coverslips זכוכית באמצעות הדמיה חי. כאן אנו מתארים נהלים לculturing חזותי הובלת מטענים בתאי דרוזופילה S2 ונוירונים עיקרי. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים הללו להפוך את שני המערכות נגישות למעבדות לימוד הובלת מטענים.

דרוזופילה S2 תאים המצורפים על התפשטות coverslip מצופה ConA לתוך סיבוב צורה &quot;פנקייק&quot; (איורים 1 א ו1C) שטוח. עם זאת, כאשר תאי S2 מצופים על coverslips בנוכחות CytoD ואפשרו להפיץ ל2-3 שעות, הם יוצרים תהליכים דקים וארוכים מולא על ידי microtubules המקביל (איורים 1B ו 1D).<...

Watch this Scientific Journal Video about Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons. at JoVE.com

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

organelle-transport-cultured-drosophila-cells-s2-cell-line-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

13.6K Views.  Feinberg School of Medicine, Northwestern University.  תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם. 

Video: Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...